4.1.1. Xột nghiệm tinh dịch và chọn mẫu nghiờn cứu
Nghiờn cứu này được thực hiện tại Labo xột nghiệm Bộ mụn Mụ phụi. Cỏc đối tượng nghiờn cứu đến làm xột nghiệm tinh dịch sau khi đó kiờng xuất tinh từ 3 - 5 ngày. Đõy là khoảng thời gian hợp lý để cho một mẫu tinh dịch cú kết quả xột nghiệm chớnh xỏc nhất. Nếu thời gian kiờng xuất tinh quỏ ngắn cú thể giảm số lượng của tinh trựng. Nếu thời gian kiờng quỏ lõu cú thể giảm độ di động, tăng số lượng tinh trựng già, chết và dị dạng.
Cú nhiều phương phỏp lấy tinh dịch làm xột nghiệm như: tự lấy bằng tay (thủ dõm), giao hợp giỏn đoạn hoặc giao hợp sử dụng bao cao su chuyờn dụng. Phương phỏp lấy mẫu bằng cỏch giao hợp giỏn đoạn khụng nờn ỏp dụng vỡ sẽ mất một phần tinh dịch ban đầu rất giàu tinh trựng, mặt khỏc tinh dịch cú thể bị lẫn cỏc thành phần khỏc trong õm đạo làm ảnh hưởng đến kết quả phõn tớch.
Cỏc mẫu tinh dịch trong nghiờn cứu này được lấy bằng phương phỏp lấy bằng tay. Phương phỏp này dễ thực hiện nờn được ỏp dụng rộng rói tại cỏc cơ sở xột nghiệm. Ở đõy cỏc mẫu tinh dịch được lấy đảm bảo đủ số lượng và sạch. Tuy nhiờn, trong thực tế nghiờn cứu cú một số trường hợp khú hoặc khụng thể thực hiện được việc lấy tinh dịch bằng tay. Những trường hợp này sẽ chuyển sang lấy tinh dịch bằng phương phỏp khỏc.
Mẫu tinh dịch sau khi lấy được đựng trong lọ chuyờn dụng đó được đỏnh số và ghi tờn, tuổi của đối tượng nghiờn cứu. Sau đú, lọ đựng mẫu tinh
dịch được đặt trong tủ ấm 37oC trong thời gian 30 phỳt. Đõy là nhiệt độ và thời gian hợp lý cho việc ly giải hoàn toàn mẫu tinh dịch.
Sau khi xột nghiệm, chỳng tụi chọn ra những mẫu tinh dịch đỏp ứng được tiờu chuẩn lựa chọn mẫu của nghiờn cứu. Cỏc mẫu được chọn là cỏc mẫu cú kết quả xột nghiệm tinh dịch đồ là nhược tinh theo tiờu chuẩn chung của WHO 1999 (PR< 50%). Đồng thời cỏc mẫu này phải đỏp ứng được tiờu chuẩn riờng mà nghiờn cứu đề ra nhằm đảm bảo tớnh đồng nhất và tớnh chớnh xỏc của nghiờn cứu.
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi đỏnh giỏ tinh dịch đồ theo tiờu chuẩn của WHO 1999 bởi giỏ trị ứng dụng lõm sàng của phiờn bản này so với phiờn bản mới nhất phỏt hành vào năm 2010.
Những giỏ trị tinh dịch đồ bỡnh thường được WHO 2010 đưa ra dựa trờn cơ sở nghiờn cứu và thống kờ cỏc mẫu tinh dịch được thu thập từ 4500 người nam thuộc 14 nước của 4 chõu lục, cú một số thay đổi so với phiờn bản WHO 1999 (bảng 4.1).
Bảng 4.1: So sỏnh một số giỏ trị tinh dịch đồ bỡnh thường
theo WHO 1999 và WHO 2010 [68].
Cỏc chỉ số WHO 1999 WHO 2010 Thể tớch tinh dịch (ml) ≥ 2,0 ≥ 1,5 Mật độ tinh trựng (triệu/ml) ≥ 20 ≥ 15 Di động (%) A ≥ 25% hoặc A+B ≥ 50% PR ≥ 32% hoặc PR+NP ≥ 40% Hỡnh dạng TT bỡnh thường (%) ≥ 30 ≥ 4 Tỷ lệ tinh trựng sống (%) ≥ 75 ≥ 58
Thay đổi chớnh của WHO 2010 là phõn loại độ di động của tinh trựng. Theo phiờn bản do WHO phỏt hành 1999 đề nghị đỏnh giỏ khả năng di động của tinh trựng gồm cú 4 loại: di động nhanh (A: tốc độ di chuyển ≥ 25àm/s), di động chậm (B: tốc độ di chuyển từ 5àm/s đến 25àm/s), di động tại chỗ (C) và khụng di động (D). Trong khi đú, phiờn bản WHO 2010 chỉ phõn biệt 3 loại di động là: di động tiến tới (PR: ứng với loại A+B), di động khụng tiến tới (NP) và khụng di động (IM).
Theo chỳng tụi việc đỏnh giỏ khả năng di động của tinh trựng theo 4 loại mà chỳng tụi ỏp dụng trong nghiờn cứu này cú giỏ trị hơn trong nghiờn cứu, chẩn đoỏn, tiờn lượng và điều trị.
Đỏnh giỏ mật độ tinh trựng theo WHO 2010: để đếm mật độ tinh trựng, cần pha loóng tinh dịch với dung dịch pha loóng và đếm bằng buồng đếm Neubauer. Kỹ thuật pha loóng TT để đỏnh giỏ mật độ này tương đối phức tạp, khụng cần thiết. Theo chỳng tụi, sử dụng buồng đếm Markler để đỏnh giỏ mật độ TT mặc dự đầu tư ban đầu hơi cao nhưng đõy là phương phỏp vừa nhanh, vừa dễ làm lại vẫn đảm bảo độ chớnh xỏc.
Đỏnh giỏ hỡnh dạng tinh trựng: tinh trựng được nhuộm bằng phương phỏp Papanicolaou được WHO 2010 khuyến cỏo sử dụng là phương phỏp tốt để nhuộm tinh trựng và cỏc tế bào khỏc. Tuy nhiờn, phương phỏp này cú giỏ thành cao, kỹ thuật phức tạp, mất thời gian nờn khú ỏp dụng cho cộng đồng và sàng lọc. Theo chỳng tụi, với phương phỏp nhuộm giemsa quy trỡnh chuẩn, một bỏc sỹ cú kinh nghiệm cú thể đỏnh giỏ khỏ chớnh xỏc hỡnh thỏi vi thể TT.
Cỏc chỉ số bỡnh thường theo WHO 2010 trong thực tế ỏp dụng cũn gặp phải một số bất cập. Cỏc chỉ số này đều ở ngưỡng giỏ trị rất thấp so với cỏc giỏ trị mà WHO 1999 đưa ra. Cỏc giỏ trị bỡnh thường theo WHO 2010 khụng chỉ để ỏp dụng trong thụ tinh tự nhiờn mà cỏc giỏ trị này cũn được sử dụng trong thụ tinh trong ống nghiệm và IUI [68]. Do vậy, việc tham khảo cỏc chỉ
số bỡnh thường của WHO 2010 khi tiến hành xột nghiệm tinh dịch đồ cho cộng đồng và sàng lọc cú thể mang lại những khú khăn cho cỏc bỏc sỹ lõm sàng trong việc chẩn đoỏn và điều trị bệnh. Vỡ thế, Việt Nam hiện chưa cú nhiều cơ sở xột nghiệm tinh dịch đồ ỏp dụng hoàn toàn theo quy trỡnh hướng dẫn của WHO 2010. Việc ỏp dụng hoàn toàn quy trỡnh này vào xột nghiệm tinh dịch đồ thường quy là một vấn đề cần xem xột.
4.1.2. Lọc rửa tinh trựng
Theo khuyến cỏo của WHO, đối với mẫu tinh dịch chất lượng kộm, lọc rửa tinh trựng bằng phương phỏp ly tõm thang nồng độ sẽ được ưu tiờn sử dụng hơn so với phương phỏp bơi lờn do phương phỏp này giỳp thu được tinh trựng cú mật độ cao hơn [68]. Theo Counsel M. và cộng sự (2004): phương phỏp lọc rửa bằng thang nồng độ Percoll làm tăng rừ rệt khả năng sống của tinh trựng sau ró đụng ở mẫu thiểu tinh (p < 0,01), đồng thời phương phỏp này cũng giỳp thu được tổng số tinh trựng di động cao hơn so với phương phỏp bơi lờn [24].
Nghiờn cứu này được tiến hành trờn cỏc mẫu nhược tinh nờn chỳng tụi lựa chọn phương phỏp thang nồng độ để lọc rửa tinh trựng. Sau lọc rửa, mật độ tinh trựng giảm đỏng kể, tuy nhiờn chất lượng của cỏc mẫu nhược tinh được cải thiện rừ rệt (sẽ được đề cập ở phần sau). Sự khỏc biệt của cỏc thụng số sau lọc rửa đều rất đỏng tin cậy và cú ý nghĩa thống kờ với p < 0,001.
Như vậy, việc lọc rửa tinh trựng khụng những cú hiệu quả trờn cỏc mẫu tinh trựng bỡnh thường như một số tỏc giả đó nghiờn cứu [10],[13], mà quỏ trỡnh này cũn mang lại hiệu quả rừ nột khi tiến hành trờn cỏc mẫu tinh dịch chất lượng kộm. Đõy cũng là kết quả bước đầu chỳng tụi ghi nhận được trong nghiờn cứu.
4.1.3. Pha mụi trƣờng bảo quản lạnh vào tinh dịch
Nhiều tỏc giả đó sử dụng nhiều loại mụi trường khỏc nhau để bảo quản TT. Ban đầu, cỏc tỏc giả sử dụng glycerol đơn thuần để làm mụi trường bảo quản lạnh. Cỏc tỏc giả đó khuyến cỏo việc sử dụng mụi trường phối hợp sẽ cho chất lượng tinh trựng sau BQL tốt hơn glycerol đơn thuần và TEST - Yolk là mụi trường nờn được lựa chọn trước tiờn để bảo quản TT [31], [59]. Theo Trịnh Sinh Tiờn (2002) sử dụng mụi trường GEYC và mụi trường Sperm Freeze cho chất lượng tinh trựng sau BQL là tương đương [14].
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng mụi trường Sperm Freeze là mụi trường BQL. Hiện nay, mụi trường Sperm Freeze đang được sử dụng phổ biến tại cỏc trung tõm HTSS do tớnh tiện lợi và chất lượng sử dụng ưu việt của nú. Tuy nhiờn, mụi trường này cú giỏ thành tương đối cao.
Khi pha mụi trường bảo quản lạnh vào tinh dịch phải đảm bảo đỳng tỷ lệ. Mụi trường bảo quản lạnh phải được nhỏ từng giọt vào lọ tinh dịch với tốc độ 15 giọt/phỳt và lắc đều. Để đảm bảo tinh trựng ớt bị tỏc động bởi mụi trường cần thực hiện thao tỏc nhẹ nhàng và từ từ. Sau đú, mẫu tinh dịch đó được pha mụi trường được để ở nhiệt độ phũng 15 phỳt trước khi bảo quản lạnh. Thời gian này cú tỏc dụng để glycerol (thành phần chớnh của mụi trường bảo quản lạnh) trong mụi trường ngoại bào trao đổi nước với mụi trường nội bào qua màng tế bào [6].
4.1.4. Đúng gúi
Cú hai hỡnh thức đúng gúi hay được sử dụng là cọng rạ (straw) bằng nhựa 0,25 ml, 0,5 ml hoặc tuýp chịu lạnh (cryovial) 1- 3 ml. Hỡnh thức đúng gúi bằng tuýp chịu lạnh cryovial thớch hợp hơn đối với quy trỡnh hạ nhiệt chậm và cho chất lượng tinh trựng sau BQL tốt hơn so với hỡnh thức đúng gúi bằng cọng rạ [47].
Trong nghiờn cứu này chỳng tụi sử dụng cryovial 1,8 ml vỡ nú thớch hợp với thể tớch mẫu tinh dịch của nghiờn cứu. Mỗi mẫu tinh dịch được chia 2 phần cho mẫu đó lọc rửa và mẫu tươi khụng lọc rửa, mỗi phần lại được chia thành 3 phần nhỏ cho 3 khoảng thời gian bảo quản: 1 ngày, 10 ngày và 30 ngày. Việc phõn chia mẫu như vậy đảm bảo tớnh hợp lý, thống nhất và chớnh xỏc của nghiờn cứu.
4.1.5. Hạ nhiệt độ
Hiện cú 2 phương phỏp được ỏp dụng trong bảo quản lạnh tinh trựng là hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh húa. Trong đú, phương phỏp thủy tinh húa vẫn chưa được ứng dụng rộng rói trong thực tế.
Theo nhiều tỏc giả, nếu dựng mỏy lạnh sinh học chạy theo chương trỡnh mỏy tớnh hạ nhiệt độ chậm với tốc độ 1-25oC/ phỳt là tốt nhất [33],[34],[59]. Tuy vậy, phương phỏp này hầu như chỉ được dựng ở cỏc trung tõm HTSS lớn và sử dụng chủ yếu cho đụng phụi và trứng. Thiết bị được sử dụng cú giỏ thành cao, quy trỡnh đụng lạnh kộo dài và tốn nhiều nittơ lỏng là những nhược điểm của phương phỏp này.
Hiện nay, phương phỏp hạ nhiệt độ được cỏc ngõn hàng tinh trựng trờn thế giới thường dựng là hạ nhiệt độ bỏn tự động hoặc tự động theo chương trỡnh hoặc khụng theo chương trỡnh.
Quy trỡnh hạ nhiệt bằng mỏy lạnh bỏn tự động Nicool-10 đảm bảo tốc độ hạ nhiệt:
- Giai đoạn 1: hạ nhiệt từ 25oC → -10oC, trong 6 phỳt. - Giai đoạn 2: hạ nhiệt từ -10oC → -120oC, trong 20 phỳt. - Giai đoạn 3: hạ nhiệt từ -120oC → -196oC, trong 5 phỳt.
Tuy nhiờn, nhược điểm của phương phỏp hạ nhiệt sử dụng mỏy Nicool 10 là số lượng tuýp chứa mẫu trong mỗi quy trỡnh rất hạn chế (10 tuýp),
lượng nitơ tiờu thụ trong mỗi quy trỡnh khỏ lớn (gần 1000ml) và đũi hỏi phải cú thiết bị mỏy múc chuyờn dụng, khỏ đắt tiền, tớnh cơ động của phương phỏp khụng cao.
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp hạ nhiệt độ theo kinh nghiệm, từ cổ bỡnh nitơ lỏng trữ mẫu. Để xỏc định chớnh xỏc nhiệt độ và tốc độ hạ nhiệt của từng giai đoạn, chỳng tụi sử dụng đầu dũ cảm nhiệt:
Giai đoạn 1: Tốc độ hạ nhiệt là: 5,8oC/phỳt. Giai đoạn 2: Tốc độ hạ nhiệt là: 5,5oC/phỳt. Giai đoạn 3: Tốc độ hạ nhiệt là: 15,2oC/phỳt.
Như vậy quy trỡnh hạ nhiệt độ của chỳng tụi hoàn toàn tương đương với quy trỡnh hạ nhiệt sử dụng mỏy Nicool 10 và đảm bảo tốc độ hạ nhiệt tốt nhất là 1- 25oC/ phỳt. Mặt khỏc, việc ỏp dụng quy trỡnh này khỏ đơn giản và tiết kiệm chi phớ nờn quy trỡnh đó được ỏp dụng rộng rói ở nhiều trung tõm HTSS trong nước và trờn thế giới.
4.1.6. Lƣu trữ
Theo Saritha và cs (2001), chất lượng tinh trựng sau bảo quản khụng cú sự khỏc biệt khi bảo quản trong mụi trường nitơ lỏng và trong hơi nitơ lỏng [56]. Tuy nhiờn, để đảm bảo sự thống nhất trong nghiờn cứu, chỳng tụi lưu trữ tinh trựng trong nitơ lỏng, là phương phỏp đang được sử dụng phổ biến hiện nay ở trong nước và trờn thế giới [59]. Trong suốt quỏ trỡnh BQL, mẫu luụn chỡm trong nitơ lỏng để đảm bảo nhiệt độ của mẫu bảo quản luụn được duy trỡ hằng định ở -196oC. Do điều kiện thời gian thực hiện đề tài, cỏc mẫu lưu trữ dài nhất trong nghiờn cứu của chỳng tụi là 30 ngày. Khoảng thời gian này phự hợp với chu kỳ kinh nguyệt của người phụ nữ để làm HTSS lần 2 nếu lần 1 thất bại.
Ở đõy, chỳng tụi chia nhỏ cỏc mẫu tinh dịch trước khi lưu trữ để phục vụ cho việc đỏnh giỏ chất lượng mẫu tinh dịch sau BQL ở cỏc thời điểm khỏc nhau. Thực tế lõm sàng cũng cho thấy việc lưu trữ từng lượng nhỏ mẫu tinh dịch giỳp cho tổng số lượng tinh trựng thu hồi được sau quỏ trỡnh BQL cao hơn. Đồng thời, cú thể cung cấp sẵn nguồn tinh trựng cho cỏc bệnh nhõn vụ sinh phải điều trị bằng phương phỏp IVF, ICSI thực hiện nhiều chu kỳ.
4.1.7. Tan đụng
Cỏc tỏc giả đưa ra cỏc phương phỏp tan đụng khỏc nhau. Theo Vladimir I.(2004) tốc độ tan đụng chậm cú thể ảnh hưởng lờn chất lượng tinh trựng. Quỏ trỡnh này làm tăng thờm cỏc tế bào tổn thương [67]. Tỏc giả Isachenco E. (2003) cũng cho rằng quỏ trỡnh tan đụng với tốc độ rất nhanh sẽ giỳp ngăn chặn sự kết tinh trở lại của cỏc tinh thể đỏ, do đú sẽ ớt gõy hại với tế bào [35]. Theo Sherman J.K, tốc độ tan đụng tốt nhất từ 1- 60oC/ phỳt. Tốc độ này phự hợp với nghiờn cứu của nhiều tỏc giả [33], [34], [47].
Trờn cơ sở cỏc nghiờn cứu trờn, chỳng tụi thực hiện phương phỏp tan đụng bằng cỏch lấy mẫu trong nitơ lỏng ra và đặt ngay vào tủ ấm trong 10 phỳt. Như vậy tốc độ tan đụng là 23,3oC/ phỳt.
4.2. CHẤT LƢỢNG MẪU TINH TRÙNG SAU LỌC RỬA
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng kỹ thuật lọc rửa tinh trựng bằng phương phỏp ly tõm dựa vào thang nồng độ do mẫu nghiờn cứu của chỳng tụi là mẫu nhược tinh nờn lựa chọn phương phỏp này sẽ cho kết quả tốt hơn so với phương phỏp bơi lờn [68].
Ở đõy, chỳng tụi cũng sử dụng mụi trường Sil-select, là húa chất đang được sử dụng rộng rói trong lọc rửa tinh trựng vỡ tớnh ớt gõy độc cho tế bào.
Sau khi lọc rửa, chất lượng tinh trựng tốt hơn hẳn so với mẫu tinh trựng ban đầu (xem bảng 3.1, hỡnh 3.1, hỡnh 3.2). Cỏc chỉ số chất lượng tinh trựng sau lọc rửa đều thay đổi rừ rệt so với trước lọc rửa (biểu đồ 4.1).
73,63 32,47 49,1 86,37 36,9 68,83 74,63 59,37 11,07 18,8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Mật độ Di động Di động tiến tới Tỷ lệ khụng bắt màu eosin Hỡnh thỏi bỡnh thường Trước rửa Sau rửa Tỷ lệ %
Biểu đồ 4.1: Chất lượng tinh trựng trước và sau lọc rửa
Mật độ tinh trựng giảm hẳn so với trước lọc rửa do quỏ trỡnh lọc rửa đó loại bỏ đi cỏc tinh trựng chết và cỏc tinh trựng cú hỡnh thỏi bất thường. Ngoài ra, mật độ tinh trựng giảm cũn do khả năng lọc khụng hoàn toàn của mụi trường.
Bất thường tinh trựng đa số là bất thường phối hợp: nhược tinh đi kốm với thiểu tinh và quỏi tinh [11], [46]. Vỡ vậy, việc lọc rửa cỏc mẫu tinh trựng này sẽ làm mật độ tinh trựng giảm đi rất nhiều. Điều này giải thớch cho kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi sau lọc rửa mật độ tinh trựng giảm đi hơn 2 lần so với trước lọc rửa.
Tỷ lệ tinh trựng di động, tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới và tỷ lệ hỡnh thỏi bỡnh thường của tinh trựng sau lọc rửa đều cao hơn hẳn so với trước lọc rửa. Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi phự hợp với cỏc tỏc giả Đào Thị Thỳy Phượng (2004) [10], Nguyễn Phương Thảo Tiờn (2007) [13] khi cỏc nghiờn cứu này được tiến hành trờn những mẫu tinh trựng bỡnh thường.
Tuy nhiờn, trong nghiờn cứu này chỳng tụi cú đỏnh giỏ tỷ lệ tinh trựng khụng bắt màu thuốc nhuộm eosin hay tỷ lệ tinh trựng sống sau nhuộm eosin.