Từ thỏng 6/2011 đến thỏng 8/2011, tại phũng bảo quản mụ Bộ mụn Mụ - Phụi học, Trường Đại học Y Hà Nội.
2.2.4. Phƣơng phỏp xử lý số liệu:
Cỏc số liệu được xử lý theo phần mềm SPSS 16.0. Kiểm định sự khỏc biệt bằng test T ghộp cặp và test phi tham số. Sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ khi p < 0,05.
2.2.5. Kỹ thuật khống chế sai số:
• Chọn đối tượng nghiờn cứu theo đỳng tiờu chuẩn chọn.
• Tập huấn cho nhúm nghiờn cứu về kỹ thuật làm xột nghiệm, phõn tớch xột nghiệm và ghi chộp kết quả nghiờn cứu.
• Dụng cụ, mỏy múc: được chuẩn húa. Húa chất đảm bảo chất lượng.
2.2.6. Quy trỡnh nghiờn cứu:
1 ngày 10 ngày 30 ngày (***) 1 ngày 10 ngày 30 ngày (***) (***) (***) (***): Đỏnh giỏ cỏc chỉ số chất lượng
Hỡnh 2.1. Quy trỡnh nghiờn cứu
Tinh dịch tƣơi 1,5ml (A) 1,5ml (B) 0,5ml 0,5ml 0,5ml Lọc rửa 1,5ml (B0) 0,5ml 0,5ml 0,5ml A1 A2 A3 B1 B2 B3 S o s ỏn h S o s ỏn h So sỏnh So sỏnh So sỏnh
2.3. KỸ THUẬT VÀ CHỈ TIấU NGHIấN CỨU. 2.3.1. Kỹ thuật nghiờn cứu: 2.3.1. Kỹ thuật nghiờn cứu:
2.3.1.1. Kỹ thuật lấy và xột nghiệm tinh dịch:
Mẫu tinh dịch được bệnh nhõn tự lấy trong một phũng riờng bằng tay. Tinh dịch được đựng trong một cốc chuyờn dụng miệng rộng cú chia vạch thể tớch, đó ghi sẵn tờn bệnh nhõn và ngày giờ lấy mẫu. Cốc đựng tinh dịch được đặt trong tủ ấm 37oC, trong 30 phỳt để tinh dịch ly giải hoàn toàn. Sau đú mẫu tinh dịch được đỏnh giỏ cỏc chỉ số theo tiờu chuẩn WHO (1999), đang được ỏp dụng thường quy tại Bộ mụn Mụ Phụi học-Trường Đại học Y Hà Nội.
a. Khảo sỏt đại thể.
- Xỏc định độ ly giải tinh dịch (độ húa lỏng) bằng mắt thường. Bỡnh thường mẫu tinh dịch ly giải hoàn toàn trong 30 phỳt sau khi xuất tinh ở nhiệt độ 37oC.
- Xỏc định màu sắc tinh dịch bằng mắt thường: bỡnh thường mẫu tinh dịch đồng nhất, màu trắng sữa.
- Đo thể tớch tinh dịch bằng cốc đong cú chia độ theo thể tớch (ml).
- Xỏc định độ quỏnh tinh dịch bằng cỏch dựng pipette, hỳt nhẹ tinh dịch vào một pipette 5ml, sau đú để cho chảy tự do và ghi nhận độ kộo dài của giọt tinh dịch.
- Đo độ pH tinh dịch: dựng giấy chỉ thị màu pH, so màu với bảng so màu mẫu.
b. Khảo sỏt vi thể.
Đỏnh giỏ mật độ và độ di động tinh trựng dưới kớnh hiển vi quang học độ phúng đại 200 lần bằng buồng đếm Makler.
- Đỏnh giỏ tỉ lệ tinh trựng di động:
Đỏnh giỏ độ di động bằng cỏch khảo sỏt sự di động tự nhiờn của tinh trựng, sau đú tớnh tỷ lệ tinh trựng di động trờn tổng số tinh trựng trong cựng thể tớch.
WHO (1999) phõn chia mức độ di động của tinh trựng làm 4 loại: Loại A: Tinh trựng di động tiến tới nhanh.
Loại B: Tinh trựng di động tiến tới chậm. Loại C: Tinh trựng di động tại chỗ.
Loại D: Tinh trựng khụng di động.
Đếm tổng cộng 200 tinh trựng trờn vi trường bằng mỏy bỏch phõn bạch cầu. Sau đú tớnh tỷ lệ phần trăm mỗi loại.
- Đỏnh giỏ mật độ tinh trựng:
Khụng cần pha loóng tinh dịch, bất động tinh trựng bằng nhiệt trước khi đếm, đơn vị tớnh: triệu tinh trựng/ ml tinh dịch.
- Đỏnh giỏ hỡnh thỏi:
Phiến đồ tinh dịch được nhuộm Giemsa, gồm cỏc bước:
Dàn phiến đồ → để khụ tự nhiờn → cố định bằng cồn 100% → nhuộm trong dung dịch giemsa.
Phõn loại hỡnh thỏi tinh trựng: đếm 200 tinh trựng dưới kớnh hiển vi cú độ phúng đại 1000 lần, khụng đếm những tinh trựng nằm chồng lờn nhau hoặc quấn vào nhau. Phõn loại tinh trựng bỡnh thường, bất thường đầu cổ, bất thường đuụi, bất thường phối hợp; tớnh tỷ lệ phần trăm mỗi loại.
Xỏc định cỏc loại tế bào khỏc trong phiến đồ: tinh trựng non, bạch cầu, vi khuẩn.
- Đỏnh giỏ tỷ lệ tinh trựng sống: phương phỏp nhuộm Eosin
Nguyờn lý: Những tinh trựng cũn sống được đỏnh giỏ qua tớnh nguyờn vẹn của màng bào tương tinh trựng. Khi tinh trựng chết, màng bào tương đầu tinh trựng bị tổn thương nờn đầu tinh trựng sẽ bắt màu thuốc nhuộm Eosin, cú màu hồng. Tinh trựng sống khụng bắt màu thuốc nhuộm sẽ trắng sỏng.
Kỹ thuật:
- Nhỏ thờm 20 àl Eosin 1%, trộn đều 2 giọt trong 30 giõy, đậy lamelle. - Đếm tổng số 200 tinh trựng dưới vật kớnh 40x, trờn nhiều vi trường để xỏc định tinh trựng sống.
c. Cỏch đỏnh giỏ mẫu tinh dịch bỡnh thƣờng: theo tiờu chuẩn tinh dịch đồ bỡnh thường của WHO (1999), cú bổ sung tiờu chuẩn của Kruger:
+ Thể tớch ≥ 2 ml. + pH ≥ 7,2. + Mật độ tinh trựng ≥ 20 triệu tt/ ml. + Độ ly giải < 30 phỳt. + Độ quỏnh nhỏ giọt bằng pipette Paster, giọt dài < 2cm. + Di động ≥ 25% di động tiến tới nhanh (loại A) hoặc ≥ 50% di động tiến tới nhanh và chậm (loại A+B) + Hỡnh thỏi bỡnh thường ≥ 15%. + Tổng số tinh trựng trong một lần xuất tinh ≥ 40 triệu. + Tỷ lệ sống ≥ 75%. + Bạch cầu < 1 triệu/ml.
2.3.1.2. Kỹ thuật chuẩn bị tinh trựng:
Mỗi mẫu tinh dịch được chia làm 2 phần:
• Phần khụng lọc rửa: 1,5ml tinh dịch, được chuẩn bị để bảo quản lạnh. • Phần lọc rửa: 1,5ml tinh dịch, được lọc rửa bằng phương phỏp thang nồng độ. Kỹ thuật lọc rửa được tiến hành theo qui trỡnh của Bộ mụn Mụ-Phụi học, Trường Đại học Y Hà Nội:
+ Cho 1ml Sil select 45% vào tube 15ml đỏy nhọn.
+ Cho nhẹ nhàng 1ml Sil select 90% xuống đỏy tube, dưới lớp Sil select 45%. + Cho 1,5ml tinh dịch lờn trờn cựng.
+ Hỳt bỏ dịch nổi, để lại khoảng 0,5ml cặn phớa dưới.
+ Cho cặn trờn vào tube cú chứa sẵn 2ml mụi trường Ferticult Flushing, trộn đều, ly tõm 400g trong vũng 10 phỳt, hỳt bỏ dịch nổi, để lại 0,5ml cặn. + Cho cặn trờn vào 1ml mụi trường Ferticult Flushing, trộn đều.
Tinh dịch đó được lọc rửa đem đỏnh giỏ cỏc thụng số như ban đầu, sau đú được bảo quản lạnh.
2.3.1.3. Kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trựng:
Cả mẫu tinh dịch tươi khụng lọc rửa và mẫu tinh dịch đó lọc rửa đều được bảo quản lạnh theo một quy trỡnh chung.
Mỗi một phần (1,5ml) tinh dịch tươi hoặc tinh dịch đó được lọc rửa được chia thành 3 phần bằng nhau để tiến hành nghiờn cứu ở 3 thời điểm khỏc nhau. Cỏc bước tiến hành gồm:
- Cho mụi trƣờng bảo quản lạnh vào tinh dịch:
Sử dụng mụi trường bảo quản lạnh Sperm FreezeTM (Ferti-Pro, Bỉ). Tinh dịch tươi đó ly giải hoàn toàn hoặc tinh dịch sau lọc rửa sẽ được bổ sung dung dịch Sperm Freeze bằng cỏch nhỏ từng giọt và lắc đều, theo tỷ lệ: 0,7ml/ 1ml tinh dịch. Sau đú, mẫu được để ở nhiệt độ phũng thớ nghiệm 15 phỳt. - Đúng gúi:
+ Dỏn nhón cú cỏc thụng số (tờn, tuổi, ngày, thỏng, năm, mó số) vào cryovial loại 1,8ml. Cryovial là tuýt nhựa chịu lạnh chuyờn dụng để bảo quản tinh trựng trong nitơ lỏng.
+ Mỗi phần tinh dịch đó pha mụi trường bảo quản được nạp vào 3 cryovial bằng pipette pasteur, sử dụng cho 3 giai đoạn nghiờn cứu, sau đú vặn chặt nắp của cryovial để đụng lạnh.
- Hạ nhiệt độ:
Sử dụng phương phỏp hạ nhiệt độ trong hơi nitơ lỏng của labo bảo quản mụ, Bộ mụn Mụ-Phụi Đại học Y Hà Nội (hạ nhiệt độ ở cổ bỡnh nitơ lỏng):
+ Mỗi giỏ nhụm chỉ cài 1 cryotube ở vị trớ thấp nhất của giỏ nhụm. + Đổ nitơ vào bỡnh trữ, cột nitơ cao 28 cm.
+ Hạ giỏ nhụm xuống cỏch mực nitơ 14 cm, dựng đầu dũ cảm nhiệt xỏc định để đạt được nhiệt độ -10oC, để trong 6 phỳt.
+ Hạ giỏ nhụm tiếp tục xuống cỏch mực nitơ 11cm, dựng đầu dũ cảm nhiệt xỏc định để đạt được nhiệt độ -120oC, để trong 20 phỳt.
+ Dỡm từ từ vào nitơ lỏng trong 5 phỳt: -120oC → -196oC. - Lƣu trữ: Trong bỡnh nitơ lỏng trữ mẫu chuyờn dụng.
- Tan đụng:
Nõng ống chứa lờn miệng bỡnh trữ, cài cố định. Lấy mẫu cần tỡm, đưa ra khỏi bỡnh trữ. Để mẫu vào tủ ấm 37oC trong 10 phỳt.
Tan đụng cỏc mẫu tinh dịch được bảo quản lạnh sõu để kiểm tra ở cỏc thời điểm: Sau bảo quản 1 ngày, 10 ngày, 30 ngày.
2.3.2. Cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu:
- Tỉ lệ tinh trựng di động (tiến tới và khụng tiến tới). - Tỉ lệ tinh trựng di động tiến tới.
- Tỉ lệ tinh trựng sống, chết.
- So sỏnh cỏc chỉ số trước và sau bảo quản:
+ Chỉ số CSF di động = % tinh trựng di động trước bảo quản% tinh trựng di động sau bảo quản x 100% + Chỉ số CSF di động tiến tới = % tinh trựng di động tiến tới trước bảo quản% tinh trựng di động tiến tới sau bảo quản x 100% + Tỷ lệ tinh trựng sống = % tinh trựng sống sau bảo quản
% tinh trựng sống trước bảo quản x 100%
+ Tỷ lệ TT hỡnh thỏi bỡnh thường = % TT cú hỡnh thỏi bỡnh thường sau bảo quản
% TT cú hỡnh thỏi bỡnh thường trước bảo quản x 100%.
- So sỏnh cỏc chỉ số giữa 2 mẫu tinh trựng được bảo quản: mẫu tinh trựng tươi và mẫu tinh trựng sau lọc rửa.
2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIấN CỨU.
- Nghiờn cứu chỉ nhằm mục đớch bảo vệ, nõng cao sức khỏe cho người bệnh và đúng gúp một phần cho lĩnh vực hỗ trợ sinh sản.
- Cỏc mẫu tinh dịch nghiờn cứu được lấy từ nguồn bệnh nhõn đến làm xột nghiệm tinh dịch đồ tại Bộ mụn Mụ - Phụi học và được sự cho phộp của Chủ nhiệm bộ mụn.
- Cỏc mẫu tinh dịch sẽ được hủy bỏ ngay sau quỏ trỡnh nghiờn cứu.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
Từ thỏng 6/2011 đến thỏng 8/2011, 30 mẫu tinh dịch nghiờn cứu đó được lấy tại phũng xột nghiệm của Bộ mụn Mụ - Phụi, Trường Đại học Y Hà Nội. Những mẫu tinh dịch này được đỏnh giỏ dựa theo tiờu chuẩn của WHO (1999) và đỏp ứng được tiờu chuẩn chọn mẫu của nghiờn cứu, được bảo quản lạnh sõu ở nhiệt độ -196oC, trong nitơ lỏng theo hai phương phỏp: bảo quản mẫu tươi khụng lọc rửa và bảo quản mẫu sau khi lọc rửa. Cỏc mẫu tinh dịch được đỏnh giỏ sau cỏc khoảng thời gian bảo quản : 1 ngày, 10 ngày và 30 ngày.
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU TINH DỊCH NGHIấN CỨU.
3.1.1. Phõn bố mẫu nghiờn cứu theo tỷ lệ tinh trựng di động (PR).
Căn cứ theo tiờu chuẩn đỏnh giỏ tinh dịch đồ của WHO 2010, chỳng tụi lấy giỏ trị 32% là ranh giới để phõn loại mẫu nghiờn cứu.
Trong số 30 mẫu nghiờn cứu, cú 11 mẫu cú tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới dưới 32% (chiếm 37%) và 19 mẫu cú tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới từ 32% đến 50% (chiếm 63%) (biểu đồ 3.1).
37% 63%
PR < 32%
32% ≤ PR < 50%
3.1.2. lứa tuổi.
Trong nhúm bệnh nhõn nhược tinh cú tuổi > 40, cú đến 50% bệnh nhõn cú tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới dưới 32% tức là bệnh nhõn cú tinh trựng rất yếu (theo WHO 2010).
Nhúm bệnh nhõn nhược tinh gặp nhiều nhất cú độ tuổi từ 30-40 tuổi. Đõy cũng là độ tuổi thường gặp của bệnh nhõn đến khỏm vụ sinh.
Phõn bố bệnh nhõn theo độ tuổi được thể hiện ở biểu đồ 3.2.
63%
17% 20% Tuổi ≤ 30
30< Tuổi ≤ 40 40< Tuổi ≤50
Biểu đồ 3.2: lứa tuổi.
3.2. CHẤT LƢỢNG MẪU TINH TRÙNG SAU LỌC RỬA.
Sau khi lọc rửa, cỏc chỉ số chất lượng tinh trựng đó cú sự thay đổi đỏng kể so với trước lọc rửa (bảng 3.1).
Bảng 3.1: So sỏnh một số chỉ số về chất lượng tinh trựng trước và sau lọc rửa Thời điểm Chỉ số chất lƣợng TT Trƣớc rửa (X ± SD) Sau rửa (X ± SD) p Mật độ (tr/ ml) 73,63 ± 37,07 32,47 ± 26,37 < 0,001 Di động (%) 49,10 ± 8,14 86,37 ± 9,83 < 0,001 Di động tiến tới (%) 36,90 ± 7,80 68,83 ± 13,03 < 0,001 Tỷ lệ TT khụng (%) 74,63 ± 11,56 59,37 ± 18,40 < 0,001 Tỷ lệ TT hỡnh thỏi bỡnh thường (%) 11,07 ± 4,40 18,80 ± 6,63 < 0,001 Bảng 3.1 cho thấy:
- Mật độ tinh trựng sau lọc rửa giảm nhiều so với trước lọc rửa. Sự khỏc biệt này cú ý nghĩa thống kờ (p < 0,001).
- Tỷ lệ tinh trựng di động, tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới và tỷ lệ hỡnh thỏi tinh trựng bỡnh thường sau lọc rửa đều tăng cú ý nghĩa thống kờ so với trước lọc rửa (p < 0,001).
- Tỷ lệ tinh trựng khụng bắt màu thuốc nhuộm eosin sau lọc rửa giảm đi cú ý nghĩa thống kờ so với trước lọc rửa (p < 0,001).
Quan sỏt trờn tiờu bản nhuộm eosin, ở những mẫu tinh dịch được lọc rửa, khả năng di động của tinh trựng tăng lờn rừ rệt nhưng tỷ lệ tinh trựng khụng bắt màu eosin lại giảm đi cú ý nghĩa thống kờ. Đồng thời, cỏc vụn tế bào và tinh tương gần như được loại bỏ hoàn toàn.
Hỡnh 3.1. Hỡnh ảnh vi thể mẫu tinh dịch trước lọc rửa (nhuộm Eosin; 400X).
Hỡnh 3.2. Hỡnh ảnh vi thể mẫu tinh dịch sau lọc rửa (nhuộm Eosin; 400X).
1. Tinh trựng sống; 2. Tinh trựng chết
3.3. ẢNH HƢỞNG CỦA VIỆC BẢO QUẢN LẠNH SÂU ĐỐI VỚI CÁC MẪU NHƢỢC TINH ĐÃ ĐƢỢC LỌC RỬA. MẪU NHƢỢC TINH ĐÃ ĐƢỢC LỌC RỬA.
3.3.1. Khả năng di động của tinh trựng sau bảo quản lạnh ở những mẫu nhƣợc tinh đó đƣợc lọc rửa. nhƣợc tinh đó đƣợc lọc rửa.
Sau BQL, khả năng di động của tinh trựng giảm, đặc biệt là giảm rừ rệt tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới (bảng 3.2)
Bảng 3.2: So sỏnh tỷ lệ (%) TT di động và tỷ lệ (%) TT di động tiến tới trước và sau BQL 1 ngày, 10 ngày, 30 ngày.
Thời điểm nghiờn cứu Cỏc chỉ số
Trƣớc BQ Sau BQ
1 ngày 10 ngày 30 ngày
TT di động (%) (X ± SD) 86,37 ±9,83 24,2 ±13,90 17,8 ±11,25 12,7 ± 9,23 p (so với trước BQ) - < 0,001 < 0,001 < 0,001 TT di động tiến tới (%) (X ± SD) 68,8 ±13,03 11,67 ±9,77 8,50 ±7,24 5,53 ±4,23 p (so với trước BQ) - < 0,001 < 0,001 < 0,001 Bảng 3.2 cho thấy:
- Tỷ lệ tinh trựng di động và tỷ lệ tinh trựng tiến tới sau bảo quản ở tất cả cỏc khoảng thời gian bảo quản đều giảm. Sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ với p < 0,001.
- Tỷ lệ tinh trựng di động và tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới sau bảo quản cú giỏ trị trung bỡnh thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 30 ngày, cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày và đều thấp hơn so với trước bảo quản.
- Sau thời gian BQL 1 ngày, tỷ lệ tinh trựng di động và tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới đó giảm đi rất nhiều so với trước bảo quản (p < 0,001).
3.3.2. Khả năng sống của tinh trựng sau bảo quản lạnh ở những mẫu nhƣợc tinh đó đƣợc lọc rửa. nhƣợc tinh đó đƣợc lọc rửa.
Sau BQL, khả năng sống của tinh trựng giảm (bảng 3.3)
Bảng 3.3: So sỏnh tỷ lệ (%) tinh trựng sống trước và sau bảo quản lạnh
1 ngày, 10 ngày, 30 ngày.
Thời điểm nghiờn cứu Chỉ số
Trƣớc BQ
Sau BQ
1 ngày 10 ngày 30 ngày
Tỷ lệ (%) TT sống (X± SD) 59,37 ±18,40 28,80 ± 13,45 21,63 ±10,37 14,40 ± 8,84 p (so với trước BQ) - < 0,001 < 0,001 < 0,001 Bảng 3.3 cho thấy:
- Tỷ lệ tinh trựng sống sau bảo quản ở tất cả cỏc khoảng thời gian bảo quản đều giảm. Sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ với p < 0,001.
- Tỷ lệ sống của tinh trựng sau bảo quản: cú giỏ trị trung bỡnh thấp nhất ở