Nghiên cứu phân lập gen nac liên quan đến khả năng chịu hạn ở một số giống ngô địa phương hà giang việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Thái Nguyên, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Tác giả Nguyễn Văn Tƣờng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hồn thành đề tài Tơi xin cảm ơn kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên cán phòng DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành số thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên khuyến khích giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tƣờng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Những chữ viết tắt luận văn v Danh mục bảng luận văn vi Danh mục hình luận văn vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGÔ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại ngô 1.1.2 Đặc điểm sinh học ngô 1.1.3 Đặc điểm hóa sinh hạt ngơ 1.1.4 Giá trị kinh tế ngô 1.1.5 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam 1.2 HẠN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGƠ 11 1.2.1 Hạn ảnh hƣởng hạn trồng 11 1.2.2 Đặc tính chịu hạn ngô 12 1.2.3 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn ngô 14 1.2.4 Cơ sở sinh lý, hóa sinh di truyền tính chịu hạn ngơ 16 1.2.5 Các gen điều khiển phiên mã 19 1.2.6 NAC vai trị NAC với tính chịu hạn ngô 21 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU 25 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh 26 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 33 2.3.3 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 38 2.3.4 Phƣơng pháp xử lí trình tự gen 38 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 38 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 38 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HỐ SINH HẠT CỦA MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG NGHIÊN CỨU 39 3.1.1 Đặc điểm hình thái khối lƣợng hạt 39 3.1.2 Hàm lƣợng protein lipid 39 3.1.3 Hoạt tính α - amylase 41 3.1.4 Hoạt tính protease 41 3.1.5 Chiều dài rễ mẫu ngô địa phƣơng giai đoạn non 42 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON 43 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN NAC 46 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 46 3.3.2 Kết nhân gen NAC 47 3.3.3 Kết tách dòng gen NAC 48 3.3.4 Kết tách plasmid tái tổ hợp 49 3.3.5 Kết xác định trình tự gen NAC 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) ASTT Áp suất thẩm thấ u Bp Base pair (Cặp base) CTAB Cetyltrimethyl – amonium bromide Đtg Đồng tác giả CYS Cystatin NAC NAM - ATAF – CUC HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) LEA Late embryogenesis abundant protein (Protein tí ch lũy với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trì nh hì nh thành phôi) LTP Lipid transfer protein (Protein vận chuyển lipid) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) TAE Tris Acetate EDTA P5CS Pyroline – – carboylate synthase MX mồi xuôi MN mồi ngƣợc NAM No Apical Merstem CUC Cup Shaped Cotyledon JA Jasmonic acid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngô số khu vực giới giai đoạn 2009 - 2011 .8 Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngơ số quốc gia giới năm 2011 Bảng 1.3 Diện tích, suất, sản lƣợng ngô Việt Nam từ 2008 - 2011 10 Bảng 2.1 Nguồn gốc mẫu ngô nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng 26 Bảng 2.3 Cặp mồi nhân gen NAC 34 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen NAC 35 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen NAC vào vector 36 Bảng 3.1 Hình thái khối lƣợng hạt mẫu ngơ địa phƣơng 39 Bảng 3.2 Hàm lƣợng protein lipid mẫu ngô địa phƣơng 40 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme α – amylase mẫu ngô địa phƣơng 41 Bảng 3.4 Hoạt tính protease mẫu ngơ địa phƣơng 42 Bảng 3.5 Chiều dài rễ mẫu ngô địa phƣơng 43 Bảng 3.6 Khả chịu hạn giai đoạn non mẫu ngô địa phƣơng 44 Bảng 3.7 Phổ hấp phụ DNA bƣớc sóng 260 nm 280 nm mẫu ngô nghiên cứu 46 Bảng 3.8 Hệ số tƣơng đồng di truyền gen NAC mẫu QB, VX, EU810024 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH SÁCH CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Trang Hình 2.1 Hình thái hạt mẫu ngô địa phƣơng 25 Hình 3.1 Đồ thị rada biểu diễn khả chịu hạn mẫu ngô nghiên cứu 45 Hình 3.2 Hình ảnh mẫu ngô nghiên cứu sau ngày gây hạn 45 Hình 3.3 Hình ảnh điện di DNA tổng số mẫu ngô địa phƣơng 46 Hình 3.4 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen NAC mẫu ngô VX, QB 47 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen NAC mẫu ngô VX QB 48 Hình 3.6 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen NAC 49 Hình 3.7 Kết so sánh gen NAC mẫu QB, VX EU810024 50 Hình 3.8 Kết so sánh đoạn mã hóa gen NAC mẫu nghiên cứu QB VX 52 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn protein NAC mẫu nghiên cứu QB, VX EU810024 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây ngô (Zea mays L.) ba lƣơng thực quan trọng kinh tế tồn cầu, góp phần ni sống gần 1/3 dân số tồn giới Ngơ thức ăn xanh ủ chua tốt cho chăn ni gia súc, gia cầm Ngồi ra, ngơ cịn nguyên liệu nhà máy sản xuất rƣợu, cồn, tinh bột dầu, đƣờng glucose, bánh kẹo Theo ƣớc tính có khoảng 670 mặt hàng khác ngành lƣơng thực, thực phẩm, dƣợc phẩm công nghiệp nhẹ đƣợc sản xuất từ ngô Ở Việt Nam, ngô lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa gạo nông dân vùng trung du miền núi phía Bắc lƣơng thực đồng bào dân tộc thiểu số vùng núi cao Ngô đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác Ngày giống ngơ lai có suất cao sở ứng dụng thành tựu khoa học kỹ thuật, đƣợc trồng phổ biến vùng miền nƣớc Trong giống ngơ địa phƣơng hạt dẻo, thơm ngon, có khả chịu hạn tốt nhƣng có suất thấp nên đƣợc quan tâm phát triển Mặt khác, nƣớc ta có 75% diện tích đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm khơng đồng vùng, tình trạng hạn hán thƣờng xuyên xảy Do đó, diện tích trồng giống ngơ địa phƣơng có xu hƣớng giảm, nhiều giống ngô quý bị dần Hơn nữa, số tỉnh miền núi nhƣ: Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Sơn La, Điện Biên, Cao Bằng đặc biệt Hà Giang khó khăn sản xuất lúa nƣớc nên phần lớn đồng bào dân tộc ngƣời nhƣ: dân tộc H.Mơng, Dao, Tày, Nùng sử dụng ngô làm lƣơng thực, thực phẩm thay gạo Nhƣng tập quán canh tác lạc hậu nên suất giống ngơ cịn thấp Nhân tố phiên mã NAC họ protein có chức đa dạng, giữ vai trò quan trọng việc điều hòa sinh trƣởng phát triển thực vật, trình lão hóa, phát triển hình thái, đƣờng truyền tín hiệu, điều chỉnh nội tiết tố phản ứng với tác động khác từ ngoại cảnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 tốt Từ kết trên, lựa chọn mẫu VX (chịu hạn tốt) mẫu QB (chịu hạn kém) để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm gen NAC 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN NAC 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số Lấy non mẫu ngô địa phƣơng sử dụng để tách chiết DNA tổng số Sau tách chiết tinh sạch, hàm lƣợng độ DNA đƣợc xác định phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ bƣớc sóng 260 nm 280 nm Đồng thời, DNA tổng số đƣợc điện di gel agarose 1% TAE 1X chụp ảnh máy soi gel để đánh giá chất lƣợng DNA Kết đƣợc thể hình 3.3 Hình 3.3 Hình ảnh điện di DNA tổng số mẫu ngô địa phƣơng (1: VX, 2: ĐV, 3: QB, 4: MV, 5: BM) Tiến hành kiểm tra độ tinh hàm lƣợng DNA tổng số phƣơng pháp đo máy quang phổ Kết thu đƣợc thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Phổ hấp phụ DNA bƣớc sóng 260 nm 280 nm mẫu ngô nghiên cứu Tên giống A260 A280 A260/280 Hàm lƣợng DNA (ng/μl) VX 0,326 0,167 1,952 815,00 MV 0,250 0,134 1,865 625,00 ĐV 0,263 0,139 1,892 657,50 QB 0,317 0,164 1,933 792,50 BM 0,255 0,136 1,875 637,50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 Từ bảng 3.7 cho thấy: tỷ số A269/A280 dao động khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ mẫu DNA tách chiết có độ tinh cao, sử dụng để tiến hành nghiên cứu 3.3.2 Kết nhân gen NAC Sau tiến hành kiểm tra đảm bảo độ tinh DNA tổng số thu đƣợc, tiến hành nhân gen NAC mẫu ngơ, mẫu ngơ có khả chịu hạn tốt, mẫu ngơ có khả chịu hạn phƣơng pháp PCR Thành phần phản ứng PCR đƣợc thể bảng 2.4 Nhiệt độ gắn mồi đƣợc chúng tơi tính tốn dựa đặc điểm trình tự mồi thiết kế Tuy nhiên, trình thực tiến hành phản ứng PCR với điều kiện khác nhận thấy phản ứng PCR xảy tối ƣu điều kiện nhiệt độ gắn mồi 54oC Sau 30 chu kì phản ứng, kết nhân gen đƣợc kiểm tra gel agarose 1% với marker 1kb đƣợc thể hình 3.4 VX Marker QB 1100bp 500bp Hình 3.4 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen NAC mẫu ngô VX, QB Ghi chú: M marker 1kb (Guangzhou Geneshun Biotech Ltd) Qua hình 3.4 cho thấy băng DNA sáng rõ gọn đẹp So sánh với marker nhận thấy, khuếch đại đƣợc gen NAC mẫu ngô địa phƣơng VX QB với kích thƣớc khoảng 1100 bp, kích thƣớc với kích thƣớc dự kiến thiết kế cặp mồi đặc hiệu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 3.3.3 Kết tách dòng gen NAC Sản phẩm PCR nhân gen NAC có sản phẩm phụ khơng mong muốn, nucleotid dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme…Vì vậy, để trình biến nạp đạt cao nhất, chúng tơi tiến hành tinh (thôi gel) sản phẩm PCR kít: GeneJET Gel Extraction Kit hãng Thermo Sản phẩm PCR nhân gen NAC đƣợc làm kít thơi gel, sau đƣợc gắn vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5  phƣơng pháp sốc nhiệt 42oC Sau đó, ni vi khuẩn E.coli DH5  biến nạp môi trƣờng LB đặc nhƣ mô tả mục 2.3.2 Sau 16 nuôi ổn định 37o C, đĩa petri xuất khuẩn lạc màu xanh màu trắng Chọn khuẩn lạc có màu trắng, hình trịn đĩa thạch chuyển sang ni qua đêm mơi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin) Lấy dịch nuôi khuẩn thực phản ứng colony - PCR với cặp mồi M13 để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn Sản phẩm colony - PCR đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% TAE 1X Kết điện di sản phẩm colony - PCR đƣợc thể hình 3.5 1.3 1.4 M 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4 1300bp Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen NAC mẫu ngô VX QB Ghi chú: Marker 1kb (hãng Guangzhou Geneshun Biotech Ltd) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 3.3.4 Kết tách plasmid tái tổ hợp Chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR tách plasmid tái tổ hợp Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di gel agarose 1% TAE 1X Kết điện di tách plasmid đƣợc thể hình 3.6 VX Marker QB Hình 3.6 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen NAC M: marker 1kb (Guangzhou Geneshun Biotech Ltd) VX: Plasmid mang gen NAC mẫu ngô VX QB: Plasmid mang gen NAC mẫu ngơ QB Kết điện di hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide gen NAC 3.3.5 Kết xác định trình tự gen NAC Để xác đị nh trì nh tƣ̣ nucleotide của ge n NAC đã tách dòng, gửi đọc trình tự nucleotide gen NAC thiết bị giải trì nh tƣ̣ tƣ̣ động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer viện Công nghệ Sinh học Kết quả đƣợc phân tí ch bằng phần mềm BioEdit Kết xác định trình tự gen đƣợc so sánh phần mềm BLAST của Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen NAC mà chúng tơi phân lập có độ tƣơng đồng cao so với trình tự gen NAC NCBI Nhƣ vậy, trình tự gen NAC mẫu ngơ nghiên cứu đƣợc xác định xác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 Chúng sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự gen NAC mẫu ngơ nghiên cứu với mẫu có mã số EU810024 ngân hàng gen NCBI, kết so sánh trình bày hình 3.7 Hình 3.7 Kết so sánh gen NAC mẫu QB, VX EU810024 Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu QB dài 1041 bp tính từ mã mở đầu đến mã kết thúc, với exon intron Exon dài 471 bp, exon dài 468 bp; intron dài 102 bp (từ vị trí 472 đến 573); kích thƣớc gen NAC mẫu QB với mẫu đăng kí Ngân hàng gen với mã số EU810024 Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu VX 1035 bp (ngắn mẫu QB nucleotide); Exon dài 471 bp, exon dài 468 bp; intron dài 96 bp (từ vị trí 472 đến 567) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 Kết so sánh mẫu QB, VX, EU810024 cho thấy, hệ số tƣơng đồng di truyền dao động khoảng 98,4-99,5% Kết đƣợc thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Hệ số tƣơng đồng di truyền gen NAC mẫu QB, VX, EU810024 EU810024 EU810024 QB VX 100 99,5 98,4 100 98,5 QB VX 100 Tuy chiều dài gen NAC mẫu nghiên cứu có khác nhƣng exon1, exon2, đoạn mã hóa mẫu nhƣ Sự sai khác kích thƣớc gen nằm vùng intron Đoạn mã hóa amino acid mẫu nghiên cứu mẫu Ngân hàng gen dài 939 bp Đoạn mã hóa mẫu nghiên cứu sai khác nucleotide vị trí: 420 (T→C), 435(T→C), 504 (T→C), 541 (G→A) với hệ số tƣơng đồng 99,5% Kết thể hình 3.8 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 Hình 3.8 Kết so sánh đoạn mã hóa gen NAC mẫu nghiên cứu QB VX Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 Trình tự amino acid suy diễn protein NAC mẫu ngô QB, VX EU810024 dài 312 amino acid (trừ mã kết thúc) Kết so sánh trình tự amino acid protein NAC mẫu QB, VX EU810024 đƣợc thể hình 3.9 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn protein NAC mẫu nghiên cứu QB, VX EU810024 Kết cho thấy, trình tự amino acid protein NAC mẫu so sánh khác vị trí 181 với hệ số tƣơng đồng 99,6% Trình tự amino acid protein NAC mẫu QB mẫu EU810024 tƣơng đồng 100% Từ kết thu nhận sau xác định trình tự gen, chúng tơi nhận thấy trình tự gen trình tự amino acid mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao với trình tự gen NAC có mã số EU810024 ngân hàng gen quốc tế NCBI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.Kết luận 1.1 Khối lƣợng 100 hạt mẫu ngô địa phƣơng dao động khoảng (27,9g ± 0,18) đến (29,6g ± 0,30) Chiều dài rễ giai đoạn non dao động từ 18,33 31,70 cm 1.2 Các mẫu ngơ nghiên cứu có hàm lƣợng protein hạt dao động từ: (9,16% ± 0,006) đến (10,05% ± 0,045) Hàm lƣợng lipid dao động khoảng (3,18 ± 0,060%) đến (3,42% ± 0,091) Mẫu ngơ VX có hoạt tính  - amylase mạnh (0,008 đvhđ/mg) mẫu ngơ QB có hoạt tính  - amylase yếu (0,004 đvhđ/mg) Mẫu ngơ có hoạt tính protease cao mẫu VX (0,013 đvhđ/mg) mẫu ngơ có hoạt tính protease thấp mẫu QB (0,007 đvhđ/mg) 1.3 Khả chịu hạn mẫu ngơ có khác nhau, mẫu ngô VX mẫu chịu hạn tốt nhất, mẫu ngô QB mẫu chịu hạn 1.4 Chiều dài gen NAC mẫu ngô QB 1041 bp, cịn mẫu ngơ VX 1035 bp Hệ số tƣơng đồng di truyền trình tự nucleotide gen NAC mẫu nghiên cứu với EU810024 khoảng 98,4 - 99,5% 1.5 Trình tự amino acid protein NAC mẫu nghiên cứu EU810024 dài 312 amino acid hệ số tƣơng đồng amino acid mẫu nghiên cứu 99,6% Trình tự amino acid protein NAC mẫu QB mẫu EU810024 tƣơng đồng 100% Đề nghị Tiếp tục xác định thêm trình tự gen NAC giống ngơ khác để có sở so sánh, xác định thị phân tử phục vụ cho việc chuyển gen để tạo đƣợc giống ngơ có khả chịu hạn tốt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngô Việt Anh (2005), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hố sinh hạt, khả chịu hạn tính đa dạng di truyền số giống ngô nếp địa phương, Luận văn thạc sĩ sinh học Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Bùi Mạnh Cƣờng, Trần Hồng Uy, Ngơ Hữu Tình, Lê Q Kha, Nguyễn Thị Thanh (2002), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số dịng ngơ đƣờng phản ứng RAPD - markers”, Tạp chí Di truyền ứng dụng, tr.16 - 22 Bùi Mạnh Cƣờng (2003), “Sử dụng thị RAPD nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn giống ứng dụng để chọn lọc tổ hợp ngô lai suất cao phục vụ sản xuất”, Công nghệ sinh học, tr.745-749 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo Dục Trần Thị Phƣơng Liên (1999), “Phân lập gen dehydrin liên quan đến khả chịu hạn đậu tƣơng”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội, tr 1348 - 1349 Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình ngơ, Nxb Nơng nghiệp 10 Chu Hồng Mậu, Ngô Việt Anh (2005), “Đánh giá chất lƣợng hạt khả phản ứng hạn số giống ngơ địa phƣơng miền núi”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nông thôn số 66, tr 20 - 22 11 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 12 Chu Văn Mẫn, Ứng dụng tin sinh học (2003), NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53 - 163 13 Trần Văn Minh (2004), Cây ngô nghiên cứu sản xuất, Nhà xuất nông nghiệp 14 Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội 15 Phạm Thị Thanh Nhàn (2007), Nghiên cứu đặc tính chịu hạn mơi trường nuôi cấy in vitro số giống ngô địa phương miền núi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên 16 Dƣơng Văn Sơn (1996), Nghiên cứu số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội sử dụng công tác chọn tạo giống, Luận án PTS khoa học nông nghiệp 17 Ngơ Hữu Tình (1997), Cây ngơ, NXB Nơng nghịêp Hà Nội 18 Ngơ Hữu Tình, Bùi Mạnh Cƣờng, Ngơ Minh Tâm (2002), “Xác định khoảng cách di truyền - nhóm ƣu lai - cặp lai suất cao thị RAPD”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 4, tr 289 - 291 19 Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả chịu hạn phân lập gen Cystatin số giống đậu xanh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái nguyên 20 Phan Thị Vân, Ngơ Hữu Tình, Ln Thị Đẹp (2005), “Đánh giá nhanh khả chịu hạn dòng tổ hợp ngô lai luân giao giai đoạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn 2/2005 21 Võ Quốc Việt (1996), Nghiên cứu số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội điều kiện Bắc Thái, Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH 22 Alexandrov,N.N., Brover,V.V., Freidin,S.,Troukhan,M.E.,Tatarinova,T.V., Zhang,H., Swaller,T.J., Lu,Y.P., Bouck,J lavell,R.B.and Feldmann,K.A(2013), “Insights into corn genes derived from large-scale cDNA sequencing”, Plant Mol Biol 69 (1-2), pp 179 - 194 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 23 Dekova I, Christor, Angelova M (1987), “Effect of Abscisis acid DNA water stress on stomata biliuos DNA some indices of water status in maize plant”, Plant growth pp 655 - 668 24 Delessert C, Kazan K, Wilson IW, Van Der Straeten D, Manners J, Dennis ES, Dolferus R, (2005), “The transcription factor ATAF2 represses the expression of pathogenesis-related genes in Arabidopsis”, Plant J, 43(5), pp 745 - 757 25 Dongxia Yao, Qiang Wei, Wenying Xu, Ryan D Syrenne, Joshua S Yuan, Zhen Su, (2012), “Comparative genomic analysis of NAC transcriptional factors to dissect the regulatory mechanisms for cell wall biosynthesis”, BMC Bioinformatics.pp 567 - 575 26 Gawel N.J., Jarret R.L., 1991, Genmic DNA isolation, Http:// www.igd.carnell.edu/pretoria % 20 lad % 20 mannual.doc 27 Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen, JiamingGuo and Youzhi Ma (2009), “Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco”, Journal of Experimental Botany, 60(13), pp 3781 - 3796 28 Larque- Saavedra a, Rodriquez M (1989), ”Evidences for material in heritance of abscisis acid in relation to drought tolerance in zea mays L”, PhyionBouenos- Aires, pp 145 - 150 29 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”, Theor Appl Genet, 110(8), pp 1355 - 1362 30 Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M., Peng Y., (2007), “Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea”, Plant Sci, 172 (1), pp 120 - 130 31 Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y., (2008), “Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants”, Cell Res, 18(10), pp 1047 - 1060 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 32 Lu PL, Chen NZ, An R, Su Z, Qi BS, Ren F, Chen J, Wang XC, (2007), “ A novel drought-inducible gene, ATAF1, encodes a NAC family protein that negatively regulates the expression of stress-responsive genes in Arabidopsis” Plant mol boil, 63(2), pp 289 - 305 33 Michael W Christiansen, Preben B Holm, Per L Gregersen, (2011), “Characterization of barley (Hordeum vulgare L.) NAC transcription factors suggests conserved functions compared to both monocots and dicots”, BMC Res Notes, pp 302 34 Nakashima K, Tran LS, Van Nguyen D, Fujita M, Maruyama K, Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, (2007), “ Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”, Plant J, 51 (4), pp 617 - 630 35 Ooka H, Satoh K, Doi K, Nagata T, Otomo Y, Murakami K, Matsubara K, Osato N, Kawai J, Carninci P, Hayashizaki Y, Suzuki K, Kojima K, Takahara Y, Yamamoto K, Kikuchi S,(2003) “Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana”, DNA Res,10 (6), pp 239 - 247 36 Pekic S, Zaric L (1985), “The role of hormone in the reaction of plants to water deficit DNA drought”, Agrohemja, pp 49 - 65 37 Pekic S, Quarrie S.A (1987), “Abscisis acid accumulation in lines of maize deffering in drough resistances: acomparison of intact DNA detached leaves ”, J Plant physiol, (127),pp 203 - 217 38 Rawlings N.D, Barrett A.J., (1994), "Families of cysteine peptidases", Methods enzymol, 244, pp 461 - 486 39 Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang CZ, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR, Creelman R, Pilgrim M, Broun P, Zhang JZ, Ghandehari D, Sherman BK, Yu GL, (2000), “Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes”, Plant Science, pp 2105 - 2110 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 40 Souer E, van Houwelingen A, Kloos D, Mol J, Koes R, (1996), “ The No Apical Meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries” , Plant J, (2), pp 159 - 170 41 Soderlund,C., Angelova,A., Descour,A., Collura,K., Kudrna,D., Bomhoff,M., Boyd,L.,Currie,J., Wissotski,M.,Ashley,E.,Morrow,D.,Fernandes,J., Walbot,V and Yu,Y(2013), “Sequencing, mapping, and analysis of 27,455 maize full-length cDNAs” PLoS Genet (11),pp 1123 -1124 42 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simopson S D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi - Shinozaki K., (2007), “Co expression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis.” Plant J, (1), pp 46 - 63 43 Trysellius Y., Huttmark D., (1997), "Cysteine proteinase 1, a chatepsin L-like enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cell line mbn-2", Insect molecular Biol, 6(2), pp 173 - 181 44 Xiao Wang, James N Culer, (2012) , “DNA binding specificity of ATAF2, a NAC domain transcription factor targeted for degradation by Tobacco mosaic virus”, BMC Plant Biol, pp 157 45 Fang Y, You J, Xie K, Xie W, Xiong L, (2008) “Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice”, Mol Genet Genomics, pp 535 - 546 46 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2005), “AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis”, Plant Cel, 17(12), pp 3470 - 3488 47 Waldron C., Wegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J.A.,(1993), "Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, An eight-domain cystein proteinase inhibitor", plant molecular biology 23(4), pp 801 - 812 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 48 White,C.N and Rivin,C.J.(2013), “Sequence and regulation of a late embryogenesis abundant group protein of maize” Plant Physiol 108 (3),pp 1337 - 1338 49 Zhang,Y and Li,C,(2006), “Sequence analysis of genes related to drought stress tolerance and study on their applications in maize”, Unpublished, pp 515 - 516 MỘT SỐ TRANG WEB 50 http: //www.faostat.fao.org 51 http://www.vaas.org.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... KHOA HỌC NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN... quan đến khả chịu hạn ngô địa phƣơng Xuất phát từ lí trên, lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu phân lập gen NAC liên quan đến khả chịu hạn số giống ngô địa phƣơng Hà Giang - Việt Nam? ?? Mục tiêu đề tài... gây hạn nhân tạo - Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen NAC liên quan đến khả chịu hạn mẫu ngô địa phƣơng nghiên cứu - Tách dịng xác định trình tự gen NAC mẫu ngô nghiên cứu: mẫu ngô có khả chịu hạn