ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Tươi NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Tươi NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.Đỗ Thị Phúc Hà Nội – 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Nếu khơng nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài Người cam đoan Nguyễn Thị Thu Tươi iii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Phúc người bảo, hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Bộ môn Di Truyền học - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giảng dạy trang bị cho kiến thức quý giá suốt thời gian học tập thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln chia sẻ, ủng hộ động viên suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2018 Nguyễn Thị Thu Tươi iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA 1.1.1 Khái quát đất nhiễm mặn 1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn Việt Nam 1.1.3 Ảnh hưởng đất nhiễm mặn đến sinh trưởng phát triển lúa .6 1.2 GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Ở THỰC VẬT 10 1.2.1 Giới thiệu chung họ gen SOS .10 1.2.2 Vai trò SOS khả chống chịu mặn trồng 12 1.2.3 Giới thiệu gen SOS1 lúa 14 1.3 HIỆN TƯỢNG METHYL HĨA ADN VÀ VAI TRỊ CỦA METHYL HĨA ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG 15 1.3.1 Khái quát tượng methyl hóa ADN .15 1.3.2 Mối liên quan methyl hóa ADN khả chống chịu điều kiện bất lợi thực vật 16 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN SOS1 Ở THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 18 1.4.1 Tình hình nghiên cứu Methyl hóa gen SOS1 18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu biểu gen SOS1 điều kiện mặn 18 1.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHYL HÓA 19 1.5.1 MSP (Methyl Specific PCR) 19 1.5.2 Giải trình tự bisulfite .21 1.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ 22 1.6.1 Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR) 22 1.6.2 RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang 23 1.6.3 RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) .23 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 25 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 25 v 2.1.2 Mồi phản ứng PCR 25 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Thiết bị dùng nghiên cứu .27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Trồng cây, xử lý mặn, thu mẫu phương pháp đánh giá kiểu hình .27 2.2.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng MSP 28 2.2.3 Nhóm phương pháp sử dụng nghiên cứu methyl hóa gen SOS1 .29 2.2.4 Nhóm phương pháp sử dụng nghiên cứu mức độ biểu gen SOS1 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KIỂU HÌNH 35 3.1.1 Đánh giá đặc điểm hình thái 35 3.1.2 Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa giống lúa 36 3.2 ĐÁNH GIÁ SỰ METHYL HÓA CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 38 3.2.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP 38 3.2.2 Đánh giá methyl hóa gen SOS1 40 3.2.3 Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn 41 3.3 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 44 3.3.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR .44 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng điều kiện mặn đến mức độ biểu gen SOS1 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vi BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic Cs Cộng DEGs Differentially expressed genes IRRI International Rice Research Institute NCBI National Center for Biotechnology Information MSP Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl) PCR Polymerase Chain Reaction RT-qPCR real-time reverse transcription polymerase chain reaction SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn) TBE Tris borate EDTA TE Tris – EDTA ScaBP8 Calcium Binding Protein SOS Salt Overly Sensitive vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tình trạng xâm nhập mặn đồng sơng Cửu Long Hình 1.2 Ảnh hưởng mặn đến hình thái lúa Hình 1.3 Các nhóm gen liên quan đến khả chịu mặn mức độ rễ, thân Hình 1.4 Con đường SOS tham gia trì cân ion rễ 11 Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 lúa 14 Hình 1.6 Sơ đồ đại diện đường methyl hóa cytosine, demethylation, mutagenesis cytosine 5-mC 16 Hình 1.7 Methylate-specific PCR 20 Hình 1.8 Xác định methyl hóa cách sử dụng methylSEQr™ AB Bisulfite Conversion Kit thiết bị CE để phân tích DNA 22 Hình 1.9 Sơ đồ real-time PCR TaqMan 24 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 31 Hình 3.1 Biểu đồ điểm xếp hạng trung bình giống lúa sau 14 ngày xử lý mặn.35 Hình 3.2 Biểu đồ đặc điểm sinh lý, sinh hóa giống lúa điều kiện thường sau 14 ngày xử lý mặn 100 mM NaCl 37 Hình 3.3 Cấu trúc gen SOS1 với vùng methyl hóa cao b c 38 Hình 3.4 Kết khảo sát methyl hóa vùng promoter gen SOS1 39 Hình 3.5 Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi methyl gen SOS1 40 Hình 3.6 Đánh giá methyl hóa gen SOS1 PCR (MSP) giống lúa tương ứng xử lý mặn (100 mM NaCl) giống đối chứng thời điểm 1, 3, 24 sau xử lý mặn 41 Hình 3.7 Kết giải trình tự gen SOS1 giống Nipponbare 43 Hình 3.8 Kết đo đường cong nóng chảy 45 Hình 3.9 Biểu gen SOS1 giống lúa phân tích phương pháp realtime PCR định lượng 46 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) ảnh hưởng trồng Bảng 1.2 Khả chịu mặn số loại trồng Bảng 1.3 Quan hệ EC suất lúa Bảng 2.1 Danh sách mồi sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Chỉ số scoring để đánh giá đặc điểm hình thái IRRI 28 Bảng 2.3 Các thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 3.1 Các vị trí nucleotit bị methyl hóa 43 ix MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu làm gia tăng tần suất lũ lụt, hạn hán, nước biển dâng thay đổi quy luật mùa vụ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống nhân sinh tác động trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp, đặc biệt sản xuất lúa nước Đất nhiễm mặn gây ảnh hưởng đến suất, chất lượng trồng vấn đề đất nhiễm mặn ngày thách thức lớn sản xuất lúa [26] Lúa lương thực quan trọng giới, nguồn lương thực ni sống 1/3 dân số giới Việt Nam với 75% dân số phụ thuộc chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo làm lương thực Tuy nhiên, tình trạng đất nhiễm mặn ngày gia tăng, suất lúa trồng vùng đất nhiễm mặn bị giảm, chí nhiều nơi bị trắng Do đó, đất trồng lúa bị xâm nhiễm mặn trở ngại khó khăn lớn nơng dân vấn đề gây tác động đến an ninh lương thực Quốc gia Như vậy, giải pháp chiến lược có tính bền vững để hạn chế ảnh hưởng nhiễm mặn đến sản xuất lúa gieo cấy giống lúa có khả chịu mặn [26] Methyl hóa ADN có vai trò quan trọng việc điều hòa biểu gen, làm tắt hoạt động transposon đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường Sự hiểu biết methyl hóa ADN gen giúp hiểu rõ vai trò gen khả chống chịu trồng Gen Salt Overly Sensitive (SOS1) chứng minh có vai trị quan trọng việc đào thải Na+ khỏi tế bào, góp phần vào khả chống chịu mặn trồng Tuy nhiên, điều hịa biểu gen SOS1 thơng qua chế methyl hóa ADN điều kiện mặn chưa nghiên cứu lúa Chính vậy, chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu methyl hóa mức độ biểu gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn lúa (Oryza sativa)” nhằm đánh giá methyl hóa ADN mức độ biểu gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn lúa, đồng thời đặt sở khoa học bước đầu nghiên cứu chế điều hòa biểu gen SOS1 thơng qua chế methyl hóa ADN điều kiện mặn Hình 3.6 Đánh giá methyl hóa gen SOS1 PCR (MSP) giống lúa tương ứng xử lý mặn (100 mM NaCl) giống đối chứng thời điểm 1, 3, 24 sau xử lý mặn Chú thích: Giếng M: Sản phẩm phản ứng MSP sử dụng cặp mồi methyl hóa cytosine; Giếng U: Sản phẩm phản ứng MSP sử dụng cặp mồi khơng methyl hóa cytosine Kết điện di cho thấy khơng có khác biệt đáng kể tình trạng methyl hóa vùng mã gen SOS1 tất giống lúa nghiên cứu Dưới điều kiện thường điều kiện mặn thời điểm khác nhau, khuếch đại quan sát cặp mồi thiết kế cho methyl cytosine vùng mã hóa, cho thấy gen SOS1 bị methyl hóa cao đảo CpG 3.2.3 Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn Để kiểm tra vị trí xác Cytosine bị methyl hóa (đảo CpG, CHG hay CHH) chúng tơi tiến hành giải trình tự bisulfite (sử dụng sản phẩm MSP khuếch đại từ Nipponbare thu sau xử lý mặn) Sản phẩm MSP (25μl) tinh cách sử dụng Gel Purification Kit (ThermoScientific) gửi giải trình tự 1st Base Company (Singapore) Trạng thái methyl hóa ADN thu cách so sánh trình tự ADN xử lý với bisulfit với ADN chưa xử lý, chuyển đổi từ C sang T cho thấy C khơng bị methyl hóa, không chuyển đổi từ C sang T cho thấy C bị methyl hóa Kết giải trình tự bisulfite tồn đoạn trình tự methyl hóa cao (đoạn b) giống Nipponbare đoạn trình tự tương ứng mẫu đối chứng trình bày hình 3.7: 41 A f B A B A B 42 A B Hình 3.7 Kết giải trình tự gen SOS1 giống Nipponbare Chú thích: Hình 3.7A : Kết giải trình tự bisulfite sử dụng cặp mồi Methyl Hình 3.7B: Kết giải trình tự mẫu đối xứng khơng xử lý bisulfite Các vị trí khoanh vùng hình 3.7A thể vị trí Cytosine bị methyl hóa xử lý bisulfite Sau so sánh đoạn trình tự nucleotit để tìm vị trí Cytosine bị methyl hóa chúng tơi thu bảng sau: Bảng 3.1 Các vị trí nucleotit bị methyl hóa Vị trí nu 59 128 142 149 Vùng trình tự có C bị methyl hóa Đảo CpG Đảo CpG Đảo CpG Đảo CpG Kết cho thấy hai cặp mồi MSP methyl cytosines đặc hiệu quan sát đảo CpG, không xảy vùng CHG CHH Như mô tả trước đây, mức độ methyl hóa sử dụng để phân biệt giống chịu mặn Ví dụ, 10 ngày sau xử lý mặn, giống lúa mỳ có khả chịu mặn có mức độ methyl hóa cao giống lúa mỳ nhạy cảm với mặn [56] Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng giống lúa có mức độ chịu mặn khác nhau, 43 bao gồm giống chịu mặn (Pokkali, Nếp Nõn Tre) giống nhạy cảm muối (Nipponbare, Dâu Ấn Độ), kết cho thấy khơng có khác biệt tình trạng methyl hóa giống lúa chịu mặn giống mẫn cảm sau xử lý mặn (1, 24 sau nhiễm mặn) 3.3 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 3.3.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR Để đánh giá mức độ biểu gen sau tách chiết ARN tổng số, tổng hợp cADN sử dụng phản ứng Real time RT-PCR dùng dye SYBR-Green, trước hết cần phải thiết kế mồi 3.3.1.1.Thiết kế mồi Trình tự gen SOS1 (LOC_Os12g44360) Actin lấy từ sở liệu ngân hàng gen lúa Rice Genome Annotation project Sau Cặp mồi SOS1-Forward/ SOS1Reverse thiết kế phần mềm Primer Blast để sử dụng cho phản ứng PCR nhân đoạn trình tự gen SOS1 từ cDNA giống lúa Nipponbare, Pokkali, Nếp Nõn Tre Dâu Ấn Độ xử lý mặn Trình tự mồi cần đảm bảo khơng chứa cấu trúc bậc hai, khu vực giàu G/C A/T phân bố đồng khơng có trình tự bổ trợ hai đầu 3’ để tránh tượng tự mồi Sử dụng phần mềm Primer-Blast thiết kế mồi bảng 2.1 3.3.1.2 Đánh giá độ đặc hiệu mồi Sau thiết kế mồi cho phản ứng RT-qPCR tiến hành blast trình tự mồi gen SOS1 gen Actin sở liệu NCBI để xác định vị trí bắt cặp mồi gen Kết cho cặp mồi nhân đoạn trình tự mong muốn chứng tỏ rằng, mồi thiết kế mồi đặc hiệu Để kiểm tra độ đặc hiệu mồi phản ứng, chúng tơi tiến hành phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) thực cách giữ nhiệt độ 95°C 15 giây trước gia tăng nhiệt từ 60°C lên 95°C, kết thu hình 3.8 44 Hình 3.8 Kết đo đường cong nóng chảy Các nhóm đường cong hiển thị biểu đồ bên trái kết phân tích đường cong nóng chảy gen Actin 1, nhóm đường cong bên phải kết phân tích đường cong nóng chảy gen SOS1 Trục nằm ngang giá trị nhiệt độ, trục thẳng đứng giá trị cường độ huỳnh quang ( -dRn/dT) Đỉnh đường cong hiển thị nhiệt độ nóng chảy ADN Quan sát giá trị thu biểu đồ cho thấy, nhiệt độ nóng chảy gen Actin gen SOS1 tương tự 770C, đường cong nóng chảy tạo thành đỉnh Điều chứng minh mồi thiết kế đặc hiệu cho gen SOS1, Actin tiến hành phân tích kết thí nghiệm sau 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng điều kiện mặn đến mức độ biểu gen SOS1 Mức độ biểu gen SOS1 khảo sát mức độ phiên mã sử dụng phương pháp realtime PCR Các giống lúa trồng sử dụng phương pháp thủy canh Sau 14 ngày trồng điều kiện bình thường, giống lúa xử lý mặn nồng độ 100 mM NaCl tiến hành thu mẫu thời điểm sau xử lý mặn giờ, 24 Kết mức độ biểu gen so sánh giống xử lý mặn giống đối chứng thể theo giá trị fold change Phân tích biểu gen SOS1 thực cách sử dụng Realtime RTPCR với giống lúa tương ứng điều kiện thường độ mặn thời điểm khác (1, 24 sau xử lý mặn) để xác định ảnh hưởng stress mặn ngắn hạn biểu gen Như thể hình 3.9, biểu gen SOS1 khơng thay đổi sau giảm theo thời gian Pokkali đồng thời tăng lên sau xử lý mặn trước 45 giảm sau 24 xử lý mặn Nếp Nõn Tre Đặc biệt, sau 24 xử lý mặn, hai giống chịu mặn cho thấy giảm biểu gen SOS1, trái ngược với giống mẫn cảm, Nipponbare Dâu Ấn Độ, có gia tăng biểu gen SOS1 sau 24 Hình 3.9 Biểu gen SOS1 giống lúa phân tích phương pháp realtime PCR định lượng Quan sát giá trị Fold change thu mẫu lúa thời điểm ta thấy: Tại thời điểm thu mẫu sau xử lý mặn: Biểu gen SOS1 giống lúa Pokkali không đổi, Nếp Nõn Tre Dâu Ấn Độ tăng dần giống Nipponbare lại biểu giảm Tại thời điểm thu mẫu sau xử lý mặn: Biểu gen SOS1 giống Pokkali Dâu Ấn Độ giảm hai giống lại Nếp Nõn Tre Nipponbare tăng lên, đặc biệt tăng mạnh giống Nipponbare Tại thời điểm thu mẫu 24 sau xử lý mặn: Biểu gen SOS1 giống Pokkali Nếp Nõn Tre giảm hai giống Nipponbare Dâu Ấn Độ lại tăng lên (tăng mạnh giống Dâu Ấn Độ) 46 Khi so sánh giống thời điểm cho thấy: Ở Giống Pokkali: Biểu gen SOS1 Pokkali giảm dần sau thời điểm thu mẫu giờ, 24 Giống Nếp Nõn Tre: Biểu gen SOS1 tăng dần thời điểm giờ, sau giảm thời điểm 24 Giống Nipponbare: Biểu gen SOS1 Nipponbare giảm sau tăng thời điểm giờ, 24 cao Giống Dâu Ấn Độ: Biểu gen SOS1 tăng sau giảm sau giờ, tiếp tục tăng thời điểm 24 Chúng quan sát thấy, nhóm lúa chịu mặn, sau 24 biểu gen SOS1 có xu hướng giảm biểu gen SOS1 nhóm lúa mẫn cảm có xu hướng tăng lên • Thảo luận : Stress mặn làm thay đổi biểu gen thơng qua q trình methyl hóa ADN [17] Điều chứng minh methyl hóa ADN promoter liên quan đến mức độ biểu gen [61] Methyl hoá promoter liên quan đến ức chế hoạt động promoter cách can thiệp vào việc gắn thêm yếu tố phiên mã [47] ảnh hưởng đến khởi đầu phiên mã Mặc dù, có vài nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng methyl hóa ADN vùng mã hóa biểu gen, cho biết methyl hóa ADN vùng mã gen có ảnh hưởng tiêu cực đến biểu gen thực vật [24, 59] Methyl hóa ADN vùng mã hóa gen ảnh hưởng đến mức độ biểu gen cách kiểm soát kéo dài phiên mã [19] Trong nghiên cứu này, đánh giá methyl hóa vùng trình tự mã hóa gen SOS1 kết hợp với đánh giá mức biểu gen Tuy nhiên, kết cho cho thấy khơng có mối liên hệ tình trạng methyl hóa trình tự mã hóa gen SOS1 với mức biểu gen SOS1 (salt overly sensitive) chứng minh có liên quan đến khả chịu mặn thực vật cách thải loại ion Na+ khỏi tế bào Trong nghiên cứu này, sau 24 xử lý mặn, hai giống lúa chịu mặn (Pokkali, Nếp Nõn Tre) cho thấy mức biểu gen SOS1 giảm, hai giống mẫn cảm mặn (Nipponbare, Dâu Ấn Độ) đáp ứng với điều kiện mặn cách tăng mức độ biểu gen Lý để giải thích cho 47 kết mâu thuẫn thí nghiệm biểu tiến hành với mẫu Với nhóm mẫn cảm, mức biểu gen SOS1 tăng lên giúp thải loại ion Na+ qua tế bào mô nhiều, cịn với nhóm chịu mặn biểu SOS1 giảm gen SOS1 hoạt động thải loại Na+ từ phần rễ 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã đánh giá đặc điểm kiểu hình giống lúa sử dụng phương pháp đo điểm kiểu hình lá, kết xác định giống lúa Nếp Nõn Tre Dâu Ấn Độ tương ứng thuộc nhóm kháng mặn giống mẫn cảm mặn Đối với giống Pokkali Nếp Nõn Tre, cho thấy khơng có ảnh hưởng đáng kể điều kiện mặn đến chiều cao cây, số nhánh, hàm lượng chlorophyll diện tích đặc điểm lại bị giảm đáng kể quan sát giống mẫn cảm, Nipponbare Dâu Ấn Độ Đã đánh giá mức độ methyl hóa hai vùng chứa exon thuộc gen SOS1 bốn giống lúa điều kiện bình thường mặn nhân tạo MSP-PCR giải trình tự bisulfite cho thấy đảo CG bị methyl hóa giống bốn giống lúa hai điều kiện Phân tích mức độ biểu gen SOS1 realtime RT-PCR cho thấy có thay đổi mức độ biểu gen SOS1 bốn giống lúa theo thời gian điều kiện mặn nhân tạo Kiến nghị Từ kết thu nghiên cứu, chúng tơi có kiến nghị sau: Giải trình tự bisulfite tồn vùng mã hóa promoter gen SOS1 để khảo sát methyl hóa toàn diện Đánh giá mức độ biểu gen SOS1 mẫu rễ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ khoa học công nghệ (2016), Xâm nhập mặn ĐBSCL-những giải pháp ứng phó hiệu điều kiện biến đổi khí hậu, tr 1-2 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thơn (2015), Báo cáo tổng kết tình hình sản xuất nông nghiệp năm 2015, tr.17-29 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2017), Xâm nhập mặn vùng ĐBSCL, hạn hán miền Trung, Tây Nguyên giải pháp khắc phục, tr 1-3 Mai Văn Trịnh, Hà Mạnh Thắng, Đỗ Thu Hà, Bùi Thị Phương Loan, Lương Hữu Thành, Phạm Quang Hà (2015), Thực trạng môi trường đất Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 42-49 Sở Nông nghiệp Phát triển nông thôn An Giang (2013), Báo cáo biến đổi khí hậu tác động đến Nơng nghiệp, Rạch Giá, Kiên Giang, tr 13-21 Tài liệu Tiếng Anh Abdel R., A.M.M Zayed, B.A, S.M Shehata (2004), Response of two rice cultivars to potassium fertilizer under saline soil, Journal of Egypt Agric., Res., 82(1), pp 209-217 Akbar, M.F.N Ponnamperuma (1982), Saline soils of South and Southeast Asia as potential land, IRRI Los Banos, Philipines Akita S (1986), Physiological bases of differential response to salinity in rice cultivars, IRRI, Los Banos, Philippines Amirjani R., Mohammad (2010), Effect of NaCl on some physiological parameter of rice, Eur Journal of Biol Sci, 31, pp 6-16 10 Applied Biosystems (20017), Methylation Analysis by Bisulfite Sequencing: Chemistry, Products and Protocols from Applied Biosystems, All rights reserved 11 Baek D., Jiang J., Chung J S , Wang B., Chen J., Xin Z , Shi H (2011), Regulated AtHKT1 gene expression by a distal enhancer element and DNA methylation in the promoter plays an important role in salt tolerance, Plant Cell Physiol 52, pp.149–161 50 12 Boyko A., and Kovalchuk I (2008), Epigenetic control of plant stress response, Environ, Mol, Mutagen, 49, pp 61–72 13 Bressan R., Bohnert H., Zhu J.K (2009), Abiotic stress tolerance: from gene discovery in model organisms to crop improvement, Mol Plant 2(1), pp 1–2 14 Castillo E., T.T.T Huynh, N.H.T Thai, T.K.P Tran (2003), Phenological and physiological responses of a rice cultivar to level and timing of salinity stress In: Preston, N and Clayton, H eds Rice-shrimp farming in the Mekong Delta: biophysical and socioeconomic issues, ACIAR Technical Report, pp 89-101 15 Chan S W., Henderson I R., Jacobsen S E (2005), Gardening the genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana, Nat, Rev, Genet 6, pp 351–360 16 Chinnusamy V., Jagendorf A., Zhu J K (2005), Understanding and improving salt tolerance in plants, Crop Sci 45, pp.437–448 17 Chinnusamy V., Zhu J K (2009), Epigenetic regulation of stress response in plants, Curr Opin Plant Biol 12, pp 133-139 18 Choi C S., Sano H (2007), Abiotic-stress induces demethylation and transcriptional activation of a gene encoding a glycerophosphodiesterase-like protein in tobacco plants, Mol Genet Genome, 277, pp 589-600 19 Choi J K., Bae J B., Lyu J., Kim T.Y and Kim Y J (2009), Nucleosome deposition and DNA methylation at coding region boundaries, Genome Biol 10, R89 20 Dinneny J.R., Long T.A., Wang J.Y., Jung J.W., Mace D., Pointer S., Barron C., Brady S.M., Schiefelbein J., and Benfey P.N (2008), Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress, Sci, Signalling, pp.320-942 21 Do P T , Drechsel O , Heyer A G , Hincha D K and Zuther E (2014), Changes in free polyamine levels, expression of polyamine biosynthesis genes, and performance of rice cultivars under salt stress: a comparison with responses to drought, Front, Plant Sci, 5, pp.182 22 En Li and Yi Zhang (2018), DNA Methylation in Mammals, Copyright © 2014 Cold Spring Harbor Laboratory Press; all rights reserved 23 Herman JG et al (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands, Proc Natl Acad Sci USA, 93, pp.9821–9826 51 24 Hohn T., Corsten S., Rieke S., Muller M and Rothnie H (1996), Methylation of coding region alone inhibits gene expression in plant protoplasts, Proc, Natl, Acad, Sci, 93, pp.8334-8339 25 Hongtao J., José M., Batelli G., Michael J V O., Ray A B., and Xia Li, (2003), The Salt Overly Sensitive (SOS) Pathway: Established and Emerging Roles, Mol, Plant, 2, pp 275–286 26 Hossain M.A., Uddin M K., Ismail M.R., Asharafuzzamain M (2012), Response of glutamine synthetase-glutamate synthase cycle enzymees in tomato leaves under salinity stress, Int, Journal of Agric, Biol, 14, pp 509-515 27 Inja N B L., Beom-Ki K., In-Sun Y., Kyung-Hwan K., Taek-Ryoun K (2017), Salt Tolerance in Rice: Focus on Mechanisms and Approaches, ScienceDirect Rice Science, 24(3), pp.123-144 28 Jan Kotuby A., Rich K., Boyd K ( 2000), Salinity and plant tolerance, Utah State University Extension 29 Jian-Kang Zhu (2000), Genetic Analysis of Plant Salt Tolerance Using Arabidopsis, Department of Plant Sciences, University of Arizona, Tucson, Arizona 85721 30 Kenneth K., Tanji., Neeltje C., Kielen (2012), Agricultural drainage water management in arid and semi-arid areas Food and Agriculture Organization Of The United Nations 31 Khan N.A (2003), NaCl-inhibited chlorophyll synthesis and associated changes in ethylene evolution and antioxidative enzymee activities in wheat, Journal of Biologia Plantarum, 47, pp 437- 440 32 Laboratory of Experimental Medicine and Endocrinology (LEGENDO), Catholic University of Leuven, U.Z Gasthuisberg, Leuven, Belgium (2003), The Use of Real-Time Reverse Transcriptase PCR for the Quantification of Cytokine Gene Expression, Journal of Biomolecular Techniques 14, pp.33–43 33 Lauchli A., S.R Grattan (2007), Plant Growth and Development Inder Salinity Stress In: Advances in Molecular Breeding Towards Salinity and Drought Tolerance, Springer, Netherlands 52 34 Liu J.P., Ishitani M., Halfter U., Kim C.S., and Zhu J.K (2000), The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes a protein kinase that is required for salt tolerance, Proc, Natl Acad, Sci, USA, 97, 3730–3734 35 Livak K J , Schmittgen T D (2001), Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-∆∆𝐶𝑡 Method, Methods 25, pp 402– 408 36 Maas E., G Hoffman (1997), Crop salt tolerance current assessment, ASCE Journal of Irrig and Drainage Div, pp 115-134 37 Munns R., and Tester M (2008), Mechanisms of salinity tolerance, Annu, Rev, Plant, Biol, pp.651–681 38 Oh D H., Leidi E., Zhang Q., Hwang S.M., Li Y., Quintero F.J., Jiang X., D’Urzo M.P., Lee S.Y., Zhao Y., Bahk J D., Bressan R A., Yun D J., Pardo J M., Bohnert H J (2009), Loss of halophytism by interference with SOS1 expression, Plant Physiol 151, pp 210–222 39 Ota K., T Yasue (1962), Studies on the salt injury to crops, XV The effect of NaCl solution upon photosynthesis of paddy seed, Bull Fac Agric.Gifu Univ, 16, pp l-16 40 Pham Quynh Hoa, Nguyen Dinh Thanh, Do Thi Phuc, Analysis of DNA Methylation Status of the OsSOS1 Gene under Salt Stress in Rice, VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vol 32, No 1S (2016), pp.253-257 41 Ponnamperuma F.N., A.K Bandyopadhya (1980), Soil salinity as a constraint on food production in the humid tropics In: Priorities for alleviating soil relatedconstraints to food production in the tropics, IRRI, pp 129-157 42 Qiu Q S., Guo Y., Dietrich M A., Schumaker K S., Zhu J K (2002), Regulation of SOS1, a plasma membrane Na1/H1 exchanger in Arabidopsis thaliana, by SOS2 and SOS3, Proc Natl Acad Sci USA 99, pp 8436–8441 43 Quintero F.J., Ohta M., Shi H., Zhu J.K., Pardo J M (2002), Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na1 homeostasis, Proc Natl Acad Sci USA 99, pp 9061–9066 44 Rakesh Singal and Gordon D Ginder, pp.4059-4070 53 DNA methylation, Blood 1999 (93), 45 Shi H., Quintero F.J., Pardo J.M., Zhu J K (2002),The putative plasma membrane Na+/H+ antiporter SOS1 controls long-distance Na+ transport in plants, Plant Cell 14, pp 465–477 46 Shoji T., Suzuki K., Abe T., Kaneko Y., Shi H., Zhu J.K., Rus A., Hasegawa P.M., and Hashimoto T (2006), Salt stress affects cortical microtubule organization and helical growth in Arabidopsis, Plant Cell Physiol, 47, pp.1158–1168 47 Siegfried Z and Simon I (2010), DNA methylation and gene expression, WIREs Syst Biol Med 2, pp 362-371 48 Singh R.K (2006), Breeding for salt tolerance in rice, IRRI, pp 197-238 49 Soni P., Kumar G., Soda N., Singla-Pareek S L., Pareek A (2013), Salt overly sensitive pathway members are influenced by diurnal rhythm in rice, Plant Signal Behav pp 24738 50 Steward N., Ito M., Yamaguchi Y., Koizumi N., Sano H (2002), Periodic DNA methylation in maize nucleosomes and demethylation by environmental stress, J BiolChem 277, pp.37741-37746 51 Tester M., Davenport R (2003), Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants, Ann, Bot 91, pp.503–527 52 Verslues P.E., Batelli G., Grillo S., Agius F., Kim Y.S., Zhu J., Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., and Zhu J.K (2007), Interaction of SOS2 with Nucleoside Diphosphate Kinase and catalases reveals a point of connection between salt stress and H2O2 signaling in Arabidopsis thaliana, Mol, Cell, Biol, 27, pp.7771– 7780 53 Wang W S., Zhao X Q., Pan Y J., Zhu L H., Fu B Y., and Li Z (2011b), DNA methylation changes detected by methylation-sensitive amplified polymorphism in two contrasting rice genotypes under salt stress, J.Genet, Genomics, 38, pp.419– 424 54 Wang Y.N., Zhang W.S., Li K.X., Sun F.F., Han C.K., Wang Y., and Li X (2008), Salt-induced plasticity of root hair development is caused by ion disequilibrium in Arabidopsis thaliana, J Plant, Res, pp 121, 87–96 54 55 Yaish W M (2013), DNA methylation-associated epigenetic changes in stress tolerance of plants, G.R Rout and A.B Das (eds.), Molecular Stress Physiology of Plants, pp 427-440 56 Yaish W M (2013), DNA methylation-associated epigenetic changes in stress tolerance of plants, G.R Rout and A.B Das (eds.), Molecular Stress Physiology of Plants, pp 427-440 57 Yan H., Kikuchi S., Neumann P., Zhang W., Wu Y., Chen F., Jiang J (2010), Genome-wide mapping of cytosine methylation revealed dynamic DNA methylation patterns associated with genes and centromeres in rice, Plant J 63, pp.353–365 58 Yoshida S., Forno D., Cock J.H., Gomez H (1976) Laboratory manual for physiological studies of rice, Int, Rice Res, Inst, pp 61-62 59 Zhang X., Yazaki J., Sundaresan A., Cokus S., Chan S W., Chen H., Henderson I R., Shinn P., Pellegrini M., Jacobsen S E., Ecker J R (2006), Genome-wide highresolution mapping and functional analysis of DNA methylation in arabidopsis, Cell 126(6), pp.1189–1201 60 ZhiKang Li, WenSheng W., Ya-Jiao P., Xiu-Qin Z., Dwivedi D., Ling-Hua Z., Ali J., Bin-Ying F (2011), Drought-induced site-specific DNA methylation and its association with drought tolerance in rice (Oryza sativa L.), Journal of Experimental Botany, Vol 62, No 6, pp 1951–1960 61 Zhu J.K (2002), Salt and Drought Stress Signal Transduction in Plants, Annu Rev Plant Biol 53, pp.247-273 62 Zilberman D., Gehring M., Tran R.K., Ballinger T., Henikoff S (2007), Genomewide analysis of Arabidopsis thaliana DNA methylation uncovers an interdependence between methylation and transcription, Nat Genet 39 (1), pp.61– 69 55 ... điều hịa biểu gen SOS1 thơng qua chế methyl hóa ADN điều kiện mặn chưa nghiên cứu lúa Chính vậy, chúng tơi lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu methyl hóa mức độ biểu gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn. .. mặn lúa (Oryza sativa) ” nhằm đánh giá methyl hóa ADN mức độ biểu gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn lúa, đồng thời đặt sở khoa học bước đầu nghiên cứu chế điều hòa biểu gen SOS1 thơng qua chế methyl. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Tươi NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60420121