Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2 4 ở lúa (Oryza sativa)

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Tiến Đạt PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4 Ở LÚA (Oryza sativa) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN * * Nguyễn Tiến Đạt PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4 Ở LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: TS Đỗ Thị Phúc Hà Nội, 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, người hướng dẫn, quan tâm tận tình bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Cảm ơn cô, người truyền cảm hứng niềm tin cho thí nghiệm, cơng việc Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô công tác Bộ môn Di truyền học quan tâm tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Các thầy cô bảo cho cẩn thận, kiên trì nghiêm túc nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn tới CN Trần Xuân An, CN Phạm Quỳnh Hoa, CN Ngô Thị Hạnh giúp đỡ thí nghiệm Các em ln quan tâm truyền đạt cho kinh nghiệm quý báu thực nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Protein Enzyme; Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ nhiều q trình thực đề tài Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, người tận tình giúp đỡ, bảo tạo điều kiện tốt để học tập Cảm ơn người ln động viên, khuyến khích tơi q trình học tập thí nghiệm Hà Nội, tháng 11 năm 2016 Nguyễn Tiến Đạt Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Lúa (Oryza sativa) 1.2 Giới thiệu họ protein vận chuyển ion xuyên màng HKT thực vật lúa 1.2.1 Họ protein HKT thực vật 1.2.2 Họ protein HKT lúa 1.2.3 Gen OsHKT2;4 1.2.4 Tình hình nghiên cứu gen OsHKT2;4 10 1.3 Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa hình nucleotide 11 1.3.1 Phƣơng pháp RFLP-PCR 11 1.3.2 Phƣơng pháp giải trình tự 14 1.4 Phƣơng pháp phân tích mức độ biểu gen 16 1.4.1 Lai Northern blot lai huỳnh quang chỗ 16 1.4.2 RT-PCR Real-time PCR 17 1.4.3 Các phƣơng pháp sử dụng chip 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu, hóa chất thiết bị 20 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.1.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Các phƣơng pháp sử dụng nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 22 2.2.2 Footer Page of 126 Các phƣơng pháp sử dụng phân tích biểu gen 26 Header Page of 126 CHƢƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 Phân tích đa hình gen Oshkt2;4 lúa 30 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 30 3.1.2 Khuếch đại gen OsHKT2;4 PCR 31 3.1.3 Giải trình tự gen OsHKT2;4 32 3.1.4 Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 33 3.2 Phân tích biểu gen 43 3.2.1 Kết trồng lúa thủy canh xử lý mặn 43 3.2.2 Kết tách chiết RNA tổng hợp cDNA 43 3.2.3 Phản ứng Real-time PCR phân tích mức độ biểu gen OsHKT2;4 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phụ lục Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MụC BảNG Bảng 1.1 Các protein họ HKT đƣợc biết Bảng 1.2 Họ gen HKT lúa (Oryza sativa) Bảng 2.1 Các giống lúa nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu đƣợc sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Hai nhóm giống lúa phân chia theo đa hình nucleotide 33 Bảng 3.2 Vị trí đa hình nucleotide nhóm 35 Bảng 3.3 Các đa hình amino acid tƣơng ứng với đa hình nucleotide 36 Bảng 3.7 Giá trị Fold change mẫu tách chiết từ giống Nipponbare Pokkali thời điểm 47 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây lúa (Oryza sativa) phận lúa .3 Hình 1.2 Một số chế vận chuyển Na+ hệ thống đáp ứng stress mặn thực vật Hình 1.3 Gen OsHKT2;4 sở liệu Phytozome 10 Hình 1.4 Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng nghiên cứu di truyền phân tử 13 Hình 1.5 Kỹ thuật giải trình tự phƣơng pháp Sanger cải biến 14 Hình 1.6 Các bƣớc phƣơng pháp Northern blot 17 Hình 1.7 Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR 18 Hình 1.8 Sử dụng chip Microarray phân tích biểu 19 Hình 2.1 Các bƣớc thí nghiệm nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 23 Hình2.2 Các bƣớc thực thí nghiệm phân tích biểu gen OsHKT2;4 26 Hình 2.3 Trồng lúa thủy canh xử lý mặn .27 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu 14 giống lúa 31 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen OsHKT2;4 .31 Hình 3.3 Kết giải trình tự đƣợc phân tích phần mềm Bioedit 32 Hình 3.4 Một phần kết so sánh trình tự cơng cụ MultAlin 34 Hình 3.5 Mơ hình dự đốn cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4 37 Hình 3.6 Phân bố góc quay amino acid mơ hình cấu trúc 3D qua phân tích Ramachandran Plot 38 Hình 3.7 Cấu trúc phân tử amino acid đa hình vị trí 53 253 39 Hình 3.8 Cấu trúc phân tử amino acid đa hình vị trí 342 40 Hình 3.9 Mơ hình dự đốn cấu trúc xuyên màng .41 Hình 3.10 Filter pore protein OsHKT2;4 hai nhóm giống lúa 42 Hình 3.11 Kết điện di kiểm tra RNA tổng số 44 Hình 3.12 Biểu đồ Association curve thể nhiệt độ gắn mồi .45 Hình 3.13 Biểu đồ Amplification curve mẫu gen OsHKT2;4 46 Footer Page of 126 Header Page of 126 Hình 3.14 Đồ thị biểu mức độ thay đổi nồng độ mRNA mẫu xử lý mặn so với mẫu đối chứng giống Nipponbare (A) giống Pokkali (B) 48 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT HKT High-affinity Potassium Transporter DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic acid cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid bp Basepair PCR Polymerase Chain Reaction RFLP-PCR Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate (Deoxynucleotide) ddNTP Dideoxynucleotide Fw Forward Rv Reverse Footer Page of 126 Header Page Luận 10 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt MỞ ĐẦU Tình hình biến đổi khí hậu giới diễn ngày phức tạp Việt Nam nƣớc chịu tác động tiêu cực nặng nề biến đổi khí hậu Với đƣờng bờ biển dài 3.260 km, với hệ thống sơng ngịi chằng chịt đổ biển qua nhiều cửa sơng, tình hình xâm nhập mặn, hệ biến đổi khí hậu ảnh hƣởng mạnh đến tình hình sản xuất nơng nghiệp nƣớc ta Ở đồng sơng Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất liền qua sông đến 70 km, dự báo đến tiếp tục tăng Hạn hán đất nhiễm mặn ảnh hƣởng đến 30 tỉnh thành nƣớc ta Đất nhiễm mặn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sinh trƣởng phát triển trồng, gây cân ion tích lũy Na+ Cl-, tăng cƣờng peroxide lipid, tăng sản phẩm dạng phản ứng oxy nhƣ gốc superoxide hydroxyl Để cải thiện suất điều kiện stress mặn thực vật nói chung lúa nói riêng, việc hiểu đƣợc chế phân tử đáp ứng stress mặn quan trọng Khả chịu mặn tính trạng đƣợc kiểm sốt nhiều gen Việc tìm hiểu mối liên hệ gen quan tâm khả đáp ứng với stress mặn có vai trị quan trọng lai tạo giống chịu mặn Có nhiều kênh vận chuyển màng tế bào thực vật giữ vai trị chế chống chịu mặn Trong số kênh vận chuyển Na+ K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium transporter) có vai trị quan trọng đáp ứng với stress mặn OsHKT2;4 thuộc nhóm họ protein HKT, OsHKT2;4 đƣợc biết đến với vai trò đồng vận chuyển Na+ K+.Tuy nhiên, nghiên cứu phân tử genmã hóa cho protein OsHKT2;4 giống lúa Việt Nam cịn hạn chế Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: “Phân tích đa hình di truyền mức độ biểu genOsHKT2;4 lúa QH.2014.T.CH - 60420121 Footer Page 10 of 126 Header Page Luận 22 of 126.văn 1.3.1.2 thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt RFLP-PCR RPLP-PCR phƣơng pháp phát triển sở phản ứng PCR thƣờng đƣợc sử dụng nghiên cứu đa hình di truyền Phƣơng pháp sử dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại có chọn lọc đoạn trình tự DNA, sau tiến hành phân cắt đoạn DNA enzyme cắt giới hạn Đa hình di truyền mẫu DNA đƣợc phân tích dựa khác băng DNA sau chạy điện di sản phẩm cắt enzyme cắt giới hạn [72].Sự khác băng DNA sau chạy điện di cho biết đa hình đoạn DNA phân tích Hình 1.4.Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng nghiên cứu di truyền phân tử [79] Ƣu điểm phƣơng pháp tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện, ứng dụng phân tích đa hình đơn nucleotide Tuy nhiên, nhƣợc điểm khơng xác định đƣợc xác trình tự gen, trình tự vị trí đa hình Mỗi enzyme QH.2014.T.CH - 60420121 13 Footer Page 22 of 126 Header Page Luận 23 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt giới hạn thƣờng nhận biết cắt trình tự đặc hiệu nên khó phân tích đƣợc gencó tính đa hình cao, phƣơng pháp khơng thích hợp cho phân tích gen có mức độ đa hình cao, địi hỏi sử dụng nhiều enzyme cắt 1.3.2 Phƣơng pháp giải trình tự Kỹ thuật giải trình tự công cụ mạnh mẽ nghiên cứu di truyền phân tử Từ phƣơng pháp giải trình tự Sanger, đến phƣơng pháp giải trình tự ngày đƣợc phát triển để đáp ứng với yêu cầu độ xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao [73] Phƣơng pháp giải trình tự DNA đƣợc mơ tả Sanger Coulson đƣợc gọi phƣơng pháp “cộng trừ” [54] Phƣơng pháp sử dụng DNA polymerase từ vi khuẩn Escherichia coli bacteriophage T4 với nucleoside triphosphate khác [19;20] Sản phẩm tạo polymerase đƣợc điện di gel acrylamide Do không hiệu phƣơng pháp này, nên năm sau ơng cộng mơ tả phƣơng pháp mang tính đột phá, giải trình tự oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp enzyme [55] Hình 1.5 Kỹ thuật giải trình tự phƣơng pháp Sanger cải biến[76] QH.2014.T.CH - 60420121 14 Footer Page 23 of 126 Header Page Luận 24 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Phƣơng pháp mở cách mạng lĩnh vực gen đƣợc biết đến nhƣ phƣơng pháp Sanger hay phƣơng pháp dideoxynucleotide Bao gồm enzyme xúc tác phản ứng trùng hợp deoxynucleotide triphosphate (dNTP) bổ sung với mẫu DNA quan tâm Phản ứng đƣợc kéo dài enzyme kết hợp dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) đƣợc đánh dấu vào chuỗi tổng hợp Do ddNTP khơng chứa nhóm 3’ - OH nên enzym xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết thúc Phản ứng đƣợc thực ống khác nhau, ống ngồi thành phần phản ứng PCR thơng thƣờng chứa loại ddNTP đƣợc đánh dấu Sau trình tổng hợp, sản phẩm gồm hỗn hợp DNA kích thƣớc khác đƣợc điện di gel polyacrylamide biến tính theo đƣờng chạy song song đƣợc đọc phóng xạ tự ghi Các phƣơng pháp giải trình tự enzyme khác đƣợc sử dụng để xác định trình tự đoạn nucleotide nghiên cứu di truyền [27] Vào năm 1977, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Allan Maxam Walter Gilbert phát minh phƣơng pháp hóa học xác định đƣợc trình tự nucleotide trongchuỗi DNA Theo phƣơng pháp này, trƣớc hết phân tử DNA đƣợc đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P đầu 5’, tạo đoạn đƣợc phát hình ảnh phóng xạ Sau nucleotide phân tử DNA đƣợc đánh dấu đƣợc xử lý với hóa chất khác làm biến đổi cắt phân tử DNA vị trí nucleotide khác Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, C Kết tạo thành đoạn oligonucleotide có chiều dài khác base [41] Các đoạn đƣợc điện di gel polyacrylamide hiển thị máy phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay phản ứng màu nhờ enzyme [4;53] Tổng hợp kết quả, ta thu đƣợc trình tự nucleotide mạch đơn DNA, từ ta biết đƣợc trình tự xếp nucleotide gen Ngày nay, việc giải trình tự đƣợc thực dễ dàng nhờ có hỗ trợ máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý phƣơng pháp Sanger có cải biến Trong ddNTP khơng đƣợc đánh dấu phóng QH.2014.T.CH - 60420121 15 Footer Page 24 of 126 Header Page Luận 25 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt xạ mà đƣợc đánh dấu chất huỳnh quang có màu khác cho loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm thành phần nhƣ: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận xử lý tín hiệu Các vạch điện di mao quản đƣợc phát sáng qua chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu ghi lại mã hóa thành nucleotide A, T, C, G [73] 1.4 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MứC Độ BIểU HIệN CủA GEN 1.4.1 Lai Northern blot lai huỳnh quang chỗ Phƣơng pháp lai Northern blot đƣợc đời vào năm 1977, kĩ thuật đƣợc sử dụng để phát định lƣợng phân tử RNA cụ thể hỗn hợp RNA Northern blot đƣợc ứng dụng để phân tích mẫu RNA từ mơ hay tế bào cụ thể để định lƣợng mức độ biểu gen quan tâm Phƣơng pháp Northern blot sử dụng mẫu RNA đƣợc biến tính thành sợi đơn Các phân tử RNA sau đƣợc phân tách theo kích thƣớc nhờ điện di Sau điện di, RNA băng đƣợc chuyển lên màng thấm Các màng thấm đƣợc lai với mẫu đầu dị đƣợc thiết kế sẵn, có trình tự bổ sung với chuỗi RNA quan tâm mẫu Các đầu dò đƣợc phát định lƣợng nhờ đƣợc gắn nhãn phóng xạ nhờ xác định đƣợc kích thƣớc nồng độ phân tử RNA quan tâm [34] Cùng với phát triển khoa học, cải tiến lai Northern blot đƣợc đời Tiêu biểu việc sử dụng huỳnh quang thay cho nhãn phóng xạ Ƣu điểm huỳnh quang an tồn, địi hỏi thiết bị máy móc phức tạp nhƣ sử dụng nhãn phóng xạ [78] QH.2014.T.CH - 60420121 16 Footer Page 25 of 126 Header Page Luận 26 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Hình 1.6 Các bƣớc phƣơng pháp Northern blot [78] Lai Northern blot lai huỳnh quang chỗ phƣơng pháp mạnh mẽ nhằm định tính bán định lƣợng mức độ biểu gen; phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền phân tử Tuy nhiên lai Northern blot đòi hỏi lƣợng mẫu tƣơng đối lớn, phƣơng pháp khó áp dụng cho trƣờng hợp gen có mức độ biểu thấp hay mức chênh lệch biểu giống tƣơng đối nhỏ 1.4.2 RT-PCR Real-time PCR Phƣơng pháp RT-PCR Real-time PCR phát triển từ phản ứng PCR nhằm phân tích định lƣợng chuỗi RNA quan tâm cách đặc hiệu Với ƣu điểm thao tác thí nghiệm đơn giản, thời gian thực ngắn, đặc hiệu độ nhạy cao, phân tích với lƣợng mẫu nhỏ, phƣơng pháp RT-PCR Real-time PCR ngày phổ biến phát triển nghiên cứu di truyền phân tử [3] QH.2014.T.CH - 60420121 17 Footer Page 26 of 126 Header Page Luận 27 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Phản ứng RT-PCR đƣợc sử dụng để phát biểu gen thơng qua q trình tổng hợp cDNA từ RNA enzyme phiên mã ngƣợc cDNA sau đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Sản phẩm RT-PCR đƣợc định lƣợng nhờ điện di gel agarose sau chạy phản ứng PCR sử dụng phản ứng Real-time PCR Real-time PCR cho phép phát định lƣợng sản phẩm khuếch đại phản ứng diễn dựa sở đánh dấu huỳnh quang, nồng độ sản phẩm đƣợc phân tích dựa cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang, từ tính tốn đƣợc nồng độ khn ban đầu [3;70] Real-time PCR cho phép định lƣợng nồng độ sản phẩm nồng độ khn với độ xác độ nhạy cao Phƣơng pháp Real-time PCR có thời gian thực ngắn với thao tác thí nghiệm, nhờ tránh đƣợc tƣợng nhiễm hay suy thối mẫu so với sử dụng phản ứng RT-PCR Nhờ đặc điểm ƣu việt, Realtime PCR đƣợc xem công cụ mạnh mẽ định tính định lƣợng mẫu sinh học phân học phân tử [10;22] Hình 1.7 Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR [77] QH.2014.T.CH - 60420121 18 Footer Page 27 of 126 Header Page Luận 28 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt 1.4.3 Các phƣơng pháp sử dụng chip Phƣơng pháp sử dụng chip Microarray phƣơng pháp dựa nguyên tắc lai phân tử, đoạn đầu dị mang thị đƣợc gắn lên bề mặt rắn liên kết hóa học Các dạng phân tử quan tâm đƣợc chạy qua giá thể gắn đầu dị Q trình lai phân tử diễn cách đặc hiệu đầu dò phân tử cần quan tâm, nhờ thị nhƣ phóng xạ hay huỳnh quang gắn đầu dị, ngƣời ta xác định đƣợc xác vị trí trình tự phân tử Phƣơng pháp thực để định tính định lƣợng lúc nhiều gen thời gian ngắn, với hiệu độ nhạy cao Tuy nhiên phƣơng pháp địi hỏi hệ thống máy móc phức tạp chi phí vận hành cao [71] Hình 1.8 Sử dụng chip Microarray phân tích biểu [71] QH.2014.T.CH - 60420121 19 Footer Page 28 of 126 Header Page Luận 29 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Ali S., Delphine M., Imran K., Bertrand M., Isabelle G., (2012), “The Rice Monovalent Cation Transporter OsHKT2;4: Revisited Inonic Selectivity”, Plant Physiology, 160, pp 498-510 Albright R A., Joh K., Morais-Cabral J H (2007) “Probing the structure of thedimeric KtrB membrane protein”,J Biol Chem 282, pp 35046–35055 Alwine J C., Kemp D J., Stark G R., (1977), “Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes” Proc Natl Acad Sci U.S.A, 74 (12),pp 5350-5354 Ansorge W., Rosenthal, A., Sproat B., Schwager C., Stegemann J., Voss H (1988),“Nonradioactive automated sequencing of oligonucleotides by chemical degradation”, Nucleic Acids Res., 16, pp 2203-2206 Apse M P., Aharon G S., Snedden W A., Blumwald E (1999), “Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis” Science 285, pp 1256–1258 Barish M E (1983) “A transient calcium-dependent chloride current in the immature Xenopus oocyte”, J Physiol 342, pp 309–325 Bassil E., (2011), “The Arabidopsis intracellular Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and development”, Plant Cell, 23, pp 224-239 Ben A S., Brini F., Sentenac H., Masmoudi K., Véry A A (2014), “Functional characterization in Xenopus oocytes of Na+ transport systems from durum wheat reveals diversity among two HKT1;4 transporters” J Exp Bot 65(1), pp 213–222 Boyer J S., (1982)“Plant productivity and environment”, Science, 218, pp 443-451 10 Bustin S A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M W (2005), “Quantitative real-time RT-PCR a perspective” J Mol Endocrinol 34 (3),pp 597-601 QH.2014.T.CH - 60420121 51 Footer Page 29 of 126 Header Page Luận 30 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt 11 Byrt C S., Platten J D., Spielmeyer W., James R A., Lagudah E S., Dennis E S.,Tester M., Munns R (2007),“HKT1;5-like cation transporters linkedto Na+ exclusion loci in wheat, Nax2 and Kna1” Plant Physiol 143, pp 1918–1928 12 Børresen A L (2002), “Mismatch detection using heteroduplex analysis”, Curr Protoc Hum Genet, 7(3) 13 Chauhan S., Forsthoefel N., Ran Y., Quigley F., Nelson D E., Bohnert H J (2000),“Na+/myo-inositol symporters and Na+/H+-antiport in Mesembryanthemum crystallinum” The Plant Journal 24, pp 511–522 14 Coskun D., Britto D T., Li M., Oh S., Kronzucker H J (2013), “Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis” Plant Physiol 162, pp 496–511 15 Corratgé C., Zimmermann S., Lambilliotte R., Plassard C., Marmeisse R., Thibaud J-B., Lacombe B., Sentenac H (2007) “Molecular and functional characterization of a Na+-K+ transporter from the Trk family in the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum” J Biol Chem 282, pp 26057–26066 16 Davenport R J., Munoz-Mayor A., Jha D., Essah P A., Rus A., Tester M (2007), “The Na+ transporter AtHKT1;1 controls retrieval of Na+ from the xylem in Arabidopsis” Plant Cell Environ 30, pp 497–507 17 Dinneny J.R., Long T.A., Wang J.Y., Jung J.W., Mace D., Pointer S., Barron C., Brady S.M., Schiefelbein J.,Benfey P.N (2008),“Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress” Science 320, pp 942–945 18 Doyle D A., Morais C J., Pfuetzner R A., Kuo A., Gulbis J M., Cohen S L., Chait B T., MacKinnon R (1998), “The structure of the potassium QH.2014.T.CH - 60420121 52 Footer Page 30 of 126 Header Page Luận 31 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity” Science 280, pp 69–77 19 Englund P T (1971) “Analysis of nucleotide sequences at 3’ termini of duplex deoxyribonucleic acid with the use of the T4 deoxyribonucleic acid polymerase” J biol Chem 246, pp 3269-3276 20 Englund P T (1972) “The 3’-terminal nucleotide sequences of T7 DNA” J molec Biol 66, pp 209-224 21 Fairbairn D J., Liu W., Schachtman D P., Gomez-Gallego S., Day S R., Teasdale R D (2000) Characterisation of two distinct HKT1-like potassium transporters from Eucalyptus camaldulensis” Plant Mol Biol 43, pp 515–525 22 Fink L., Seeger W., Ermert L., Hanze J., Stahl U., Grimminger F., Kummer W., Bohle R M (1998), “Real-time quantitative RT-PCR after laserassisted cell picking” Nature Medicine 4, pp 1329–1333 23 Fukuda A., Nakamura A., Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H., Tanaka Y (2004),“Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+ antiporter from rice” Plant and Cell Physiology 45, pp 146–159 24 Galvan-Ampudia C S., et al (2013), “Halotropism is a response of plant roots to avoid a saline environment”, Curr Biol 23, pp 2044–2050 25 Garciadeblas B., Senn M.E., Banuelos M.A., Rodriguez-Navarro, (2003),“A Sodium transport and HKT transporters: The rice model” Plant J 34, pp 788-801 26 Gregoire C., Rémus-Borel W., Vivancos J., Labbé C., Belzile F., Bélanger R R (2012), “Discovery of a multigene family of aquaporin silicon transporters in the primitive plant Equisetum arvense” Plant J 72, pp 320–330 27 Griffin H G & Griffin A M (1993),“DNA sequencing - recent innovations and future trends” Appl Biochem.Biotechnol 38, 147-159 QH.2014.T.CH - 60420121 53 Footer Page 31 of 126 Header Page Luận 32 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt 28 Haferkamp I., Linka N (2012), “Functional expression and characterization of membrane transport Proteins” Plant Biol 14, pp 675–690 29 Hauser F., Horie T (2010), “A conserved primary salt tolerance mechanism K+, Mg2+, and Ca2+ Transport by OsHKT2;4 from Rice mediated by HKT transporters: a mechanism for sodium exclusion and maintenance of high K+/Na+ ratio in leaves during salinity stress” Plant Cell Environ 33, pp 552–565 30 Hedrich R (2012), “Ion channels in plants” Physiol Rev 92, pp 1777–1811 31 Horie T, Costa A, Kim TH, Han MJ, Horie R, Leung HY, Miyao A, Hirochika H, AnG, Schroeder JI (2007), “Rice OsHKT2;1 transporter mediates large Na+ influx component into K+-starved roots for growth” EMBO Journal 26, pp 3003-3014 32 Horie T., Dennis E B.,Costa A.,Kaneko T., Fiorella L S., Katsuhara M.,Julian I S (2011), “K+ Transport by the OsHKT2;4 Transporter from Rice with Atypical Na+ Transport Properties and Competition in Permeation of K+ over Mg2+ and Ca2+ Ions”, Plant Physiology 156, pp 1493–1507 33 Jabnoune M., Espeout S., Mieulet D., Fizames C., Verdeil J L., Conejero G.,Rodrıguez-Navarro A., Sentenac H., Guiderdoni E., Abdelly C (2009),“Diversity in expression patterns and functional properties in therice HKT transporter family” Plant Physiol 150,pp 1955–1971 34 Jump S S., Michalski C W.,Erkan M., Kleeff J., Friess H (2009) "Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues" Nat Protoc 4(1), pp.37-43 35 Kader M A., Seidel T., Golldack D., Lindberg S (2006), “Expressions of OsHKT1, OsHKT2, and OsHVA are differentially regulated under NaCl stress in salt-sensitive and salt-tolerant rice (Oryza sativa L.) cultivars” Journal of Experimental Botany;57, pp 4257-4268 36 Kazuko Y S., Kazuo S (1994), “A Novel cis-Acting Elenent in an Arabidopsis Gene Is Inviloved in Responsiveness to Drought, Low- QH.2014.T.CH - 60420121 54 Footer Page 32 of 126 Header Page Luận 33 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Temperature, or High-Salt Stress”, American Society of Plant Physiologists, 6, pp 251-264 37 LanW Z.,WangW.,Wang S M., Li L G., Buchanan B B., Lin H X., Gao J P., Luan S (2010),“A rice high-affinity potassium transporter (HKT) conceals acalcium-permeable cation channel” Proc Natl Acad Sci USA 107, pp 7089–7094 38 Lu C A., Lim E K., Yu S M (1998) “Sugar response sequence in the promoter of a rice alpha-amylase gene serves as a transcriptional enhancer” J Biol Chem 273, pp 10120 39 MaH.,Chong K., Deng X.W.(2007) “Rice research: past, present and future” J Integr Plant Biol 49, pp 729-730 40 Maathuis F J M (2006),“The role of monovalent cation transporters in plant responses to salinity” Journal of Experimental Botany 57, pp 1137– 1147 41 Maxam A M., Gilbert W (1977),“A new method for sequencing DNA” Proc natn Acad Sci USA 74, pp 560-564 42 Mazel A., Leshem Y., Tiwari B S., Levine A (2004), “Induction of salt and osmotic stress tolerance by overexpression of an intracellular vesicle trafficking protein AtRab7 (AtRabG3e)” Plant Physiol 134, pp 118– 128 43 Marassi F M., Das B B., Lu G J., Nothnagel H.J., Park S H., Son W S., Tian Y., Opella S.J (2011), “Structure determination of membrane proteins in five easy pieces” Methods 55, pp 363–369 44 Muller P Y., Janovjak H., Miserez A R., Dobbie Z (2002),“Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RTPCR” BioTechniques 32, pp 1372–1379 QH.2014.T.CH - 60420121 55 Footer Page 33 of 126 Header Page Luận 34 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt 45 MunnsR.,Tester M (2008),“Mechanisms of salinity tolerance” Annu Rev Plant Biol 59, pp 651–681 46 Møller I S., Gilliham M., Jha D., Mayo G M., Roy S J., Coates J C., Haseloff J., Tester M (2009) “Shoot Na+ exclusion and increased salinity toleranceengineered by cell type-specific alteration of Na+ transport in Arabidopsis” Plant Cell 21, pp 2163–2178 47 Nugent T., Jones D.T., (2012),“Membrane protein structural bioinformatics” J Struct Biol.179, pp 327–337 48 Ohgaki R., Fukura N., Matsushita M., Mitsui K., Kanazawa H (2008), “Cell surface levels of organellar Na+/H+ exchanger isoform are regulated by interaction with RACK1” J Biol Chem 283, pp 4417–4429 49 Plett D.C., Møller I.S (2010), “Na+ transport in glycophytic plants: What we know and would like to know” Plant Cell Environ 33, pp 612-626 50 Pyo Y J., Gierth M., Schroeder J I., Cho M H (2010),“High-affinity K+ transportin Arabidopsis: AtHAK5 and AKT1 are vital for seedling establishmentand postgermination growth under low-potassium conditions” PlantPhysiol 153,pp 863–875 51 RenZ.H.,(2005), “A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter” Nat Genet 37, pp 1141-1146 52 Rengasamy P.,(2006), “World salinization with emphasis on Australia” J.Exp Bot 57, pp 1017-1023 53 Richterich P (1989),“Non-radioactive chemical sequencing of biotin labeled DNA” Nucleic Acids Res 17, pp 2181-2186 54 Sanger F., Coulson A R (1975),“A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase” J molec Biol 94, pp 441-448 QH.2014.T.CH - 60420121 56 Footer Page 34 of 126 Header Page Luận 35 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt 55 Sanger F., Nicklen S., Coulson A R (1977) “DNA sequencing with chainterminating inhibitors” Proc natn Acad Sci USA 74, pp 5463-5467 56 SchachtmanD.P., Schroeder J.I.,(1994), “Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants” Nature 370, pp 655-658 57 Shane W., Matthew G., Maria H (2013), “Plant High-Affinity Potassium (HKT) Transporters Involved in Salinity Tolerance: Structural Insights to Probe Differences in Ion Selectivity”, Int J Mol Sci 14, pp 7660-7680 58 Sharpe R G., Hims M M., Harbach R E., Butlin R K (1999) “PCR-based methods for identification of species of the Anopheles minimus group: allele-specific amplification and single-strand conformation polymorphism”, Med Vet Entomol., 13(3), pp 265-273 59 Sunarpi H., Horie T., Motoda J., Kubo M., Yang H., Yoda K., Horie R., Chan W Y., Leung H Y., Hattori K (2005), “Enhanced salt tolerance mediated by AtHKT1 transporter-induced Na unloading from xylem vessels to xylem parenchyma cells” Plant J 44, pp 928–938 60 Takahashi N., Goto N., Okada K.,Takahashi H (2002), “Hydrotropism in abscisic acid, wavy, and gravitropic mutants of Arabidopsis thaliana” Planta 216, pp 203–211 61 Wenli L., Michael O (2013), “Current analysis platforms and methods for detecting copy number variation”, Physiol Genomics, 45(1), pp 1-16 62 Xiayu R., Xuelin H., Zhicheng Z., Xin L (2013), “An improvement of the 2ˆ(– delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis”, Biostat Bioinforma Biomath, 3(3): 71–85 63 Yi S., Weigui L., Wanhuang L., Liying M., Mohammed H K (2015), “Model of Cation Transportation Mediated by High-Affinity Potassium QH.2014.T.CH - 60420121 57 Footer Page 35 of 126 Header Page Luận 36 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Transporters (HKTs) in Higher Plants”, Biological Procedures Online 17(1), pp 1-13 64 Yao X., Horie T., Xue S., Leung H-Y., Katsuhara M., Brodsky D E., Wu Y.,Schroeder J I (2010),“Differential sodium and potassium transport selectivitiesof the rice OsHKT2;1 and OsHKT2;2 transporters in plant cells”.Plant Physiol 152,pp 341–355 65 Yoo S D., Cho Y H., Sheen J (2007), “Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis” Nat Protoc 2, pp 1565–1572 66 Hoa P Q., Tran X An., Trang N T N., Anh T T T., Yen H H., Van N T H., Hanh T T., Phuc D T (2016), “Investigation of polymorphisms in the coding region of OsHKT1 gene in relation to salinity in rice” Rice Science 23, pp 334-338 67 Phuc D T., Minh N V., Yen H H (2016),“Assessment of natural variation in OsHKT1;2 gene in rice (Oryza sativa)” VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 32: 189-193 Tiếng Việt 68 Đặng Ngọc Hoa, Đỗ Thị Phúc (2015) “Nghiên cứu đa hình phân tích yếu tố cis thuộc vùng promoter gen OsHKT1;4 lúa” Tạp chí Khoa học, ĐHQGHN, số 31, 129-135 69 Đỗ Thị Phúc, Phạm Quỳnh Hoa (2016) “Nghiên cứu mức độ biểu gen OsHKT2;1 đáp ứng điều kiện mặn lúa phƣơng pháp RTPCR bán định lƣợng” Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, số 2, 54-58 Website 70 https://aem.asm.org/content/64/7/2572/F1.expansion.html QH.2014.T.CH - 60420121 58 Footer Page 36 of 126 ... * * Nguyễn Tiến Đạt PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2 ;4 Ở LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 6 042 0121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán... Oshkt2; 4 lúa 30 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 30 3.1.2 Khuếch đại gen OsHKT2; 4 PCR 31 3.1.3 Giải trình tự gen OsHKT2; 4 32 3.1 .4 Phân tích đa hình gen OsHKT2; 4 33 3.2 Phân. .. đề tài: ? ?Phân tích đa hình di truyền mức độ biểu genOsHKT2 ;4 lúa QH.20 14. T.CH - 6 042 0121 Footer Page 10 of 126 Header Page Luận 11 of 126.văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt (Oryza sativa)? ??