Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kĩ thuật PCR và đánh giá di truyền

Mở đầu Đầu năm 80 kỷ XX xuất công bố chuyển gen từ mở ra chân trời mới, chứa đựng tơng lai đầy hứa hẹn cải tiến trồng Nhiều giống trồng đợc chuyển gen để tạo đặc tính u việt, giúp cải thiện suất, chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn, lạnh, tăng chất lợng cải thiện môi trờng Từ kỹ thuật gen trở thành công cụ hữu hiệu đợc ứng dụng cải tiến giống trồng Sự phát triển nhanh chóng Công nghệ Sinh học đa thực vật chuyển gen sản phẩm chúng đến với thị trờng tiêu dùng Và kể từ kỹ thuật gen thực vật đợc thiết lập, thử nghiệm thành công ứng dụng đợc đầu t đợc tiến hành cách rộng rãi để giải vấn đề tồn Nông nghiệp Vì thực vật chuyển gen đợc trồng phổ biến đồng ruộng để làm tăng tính kháng bệnh, kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ hệ thống canh tác Từ cuối năm 1997, trồng biến đổi gen sản phẩm chúng đợc chấp nhận thơng mại hoá số quốc gia Ngày việc sản xuất sử dụng trồng chuyển gen ngày gia tăng, khẳng định tầm quan trọng sản xuất nông nghiệp số nghành khác Năm 2007 diện tích trồng tiếp tục tăng số, đạt 12% tơng đơng với 12,3 triệu hecta (30 triệu mẫu Trong tổng diện tích trồng 12 năm (19962007) đạt 690 triệu héc-ta (1,7 tỷ mẫu) Với mức tăng cha thấy gấp 67 lần từ 1996-2007, trở thành công nghệ trồng đợc áp dụng nhanh thời gian gần Ngày nay, chuyển gen đợc trồng ngày rộng rãi nhiều nớc giới Nhng câu hỏi an toàn việc sử dụng sản phẩm chuyển gen đồng thời đợc đặt trở thành vấn đề nóng bỏng với hàng loạt vấn đề liên quan xoay quanh nó, liệu chúng đợc sử dụng dới dạng khả rủi ro đến với sức khoẻ ngời, với đa dạng sinh học, tiềm -1- ẩn ô nhiễm môi trờng Việt Nam, đến thời gian xây dựng hoàn thiện quy chế quản lý an toàn sinh học chuyển gen kiểm soát sản phẩm biến đổi gen Tuy nhiên, để đa nhanh chuyển gen vào sản xuất Việt Nam việc nghiên cứu tạo chuyển gen, trồng thử nghiệm kiểm soát trồng biến đổi gen cần phải tiến hành trớc bớc Trong số trồng biến đổi gen thử nghiệm ngô đợc quan tâm đặc biệt ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Để đáp ứng tiêu kỹ thuật việc phát xác ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ nhanh chóng sử dụng dòng ngô phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc diệt cỏ Việt Nam Chúng thực đề tài Nghiên cứu, xác định ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ kĩ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ Mục đích đề tài: Thu thập liệu trồng biến đổi gen tìm hiểu cách tổng quan ngô chuyển gen Bớc đầu làm quen với kỹ thuật nghiên cứu chuyển gen Xác định đoạn trình tự đặc trng promoter CaMV-35S (195bp) có ngô chuyển gen Xác định gen PAT (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) gen kháng thuốc trừ cỏ glufosinate có ngô chuyển gen kỹ thuật PCR Đánh giá đặc điểm hình thái, tiêu nông sinh học đa dạng di truyền mức phân tử kĩ thuật PCR-RAPD số dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô u việt mang gen gen kháng thuốc trừ cỏ -2- Phần I: Tổng QUAN Tài Liệu 1.1 Giới thiệu ngô 1.1.1 Vài nét sơ lợc ngô Cây ngô có tên khoa học Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Gramineae Từ kỷ 16 Colombus mang hạt giống từ châu Mỹ sản xuất ngô lan tràn khắp giới trở thành loại ngũ cốc quan trọng cung cấp lơng thực cho loài ngời Hiện giới tồn hai hệ thống phân loại loại Zea Wilkes (1967) Nhóm Euchleana Iltis & Doebly (1984) Nhóm Luxuriantes Z penrennis (Hitch) Reeves & Mangelsdorf Z diploperennis Iltis Doebly & Guzman Z mexicana (Schrader) Kuntze Z perennis Hitch Reeves & Mangelsdorf Nòi Guatemala Nhóm Zea Z mays subsp Parviglumis Iltis & Doebly Nòi Huchuetenango Var Huchuetenangensis Iltis & Doebly Nòi Balsas Var Parviglumis Iltis & Doebly subsp Mexicana (Schrader) Iltis Nòi Chalco Nòi Chalco Nòi Cao nguyên trung phần Nòi Cao nguyên trung phần Nòi Nobogame Nòi Nobogame Nhóm Zea Z mays L Z mays subsp mays Từ loài Zea mays L, dựa vào cấu trúc nội nhũ hạt đợc phân thành loài phụ, sau dựa vào màu hạt màu lõi để phân thứ (varieta) Những loài phụ bao gồm: Zea mays Subsp indurata -3- - ngô đá - ngô ngựa Zea mays Subsp indentata - ngô nếp Zea mays Subsp ceratina - ngô nếp Zea mays Subsp saccharata - ngô bột Zea mays Subsp everta - ngô bột Zea mays Subsp amylacea - ngô bọc Zea mays Subsp tunecata Ngô có nguồn gốc từ Trung Mỹ song ngô thích nghi nhanh với điều kiện sinh thái khác Bắc bán cầu, ngô trồng Đan Mạch đến vĩ tuyến 55o-56o, Liên Xô cũ Canada tới vỹ tuyến 58 o Nam bán cầu, ngô đợc trồng New Zealand đến vĩ tuyến 42o-43o (Humlam John, 1942, Necula GH cs, 1957) Ngô trồng thích ứng rộng Theo Necula G H (1957) ngô trồng độ cao 3900m Tuy nhiên xa khỏi xích đạo độ cao giảm Ví dụ nh Peru (16o nam) ngô trồng đợc độ cao 3900m, Bắc Carolia (34o-37o bắc) trồng đợc 1200m, Châu nh thung lũng Kasmir 2000m, Châu Âu (khoảng 45o-48o bắc) độ cao 500-800m [10] Trên phạm vi giới, nhà khoa học chia sinh thái ngô thành vùng chính: Ôn đới Cận nhiệt đới Nhiệt đới cao (trên độ cao 2000m so với mặt biển) Nhiệt đới thấp (dới 2000m) Theo phân loại này, Việt Nam nằm vùng sinh thái nhiệt đới thấp Các giống từ vùng nhiệt đới thấp biểu thích ứng thông qua khả chống chịu suất, kể thảo nguyên cao phía Bắc vụ đông Đồng Bắc Bộ 1.1.2 Nguồn gen đa dạng di truyền ngô Ngô trồng đợc thu thập, mô tả bảo tồn tốt từ trung tâm đa dạng di truyền Từ năm 1943, quỹ Rockefeller hợp tác với nớc Mỹ La tinh thu thập nguồn gen ngô từ trung tâm đa dạng chính, tạo sở cho tập -4- đoàn ngô Mexico, Colombia Brazil Ngày có khoảng 15.000 mẫu giống ngô đợc thu thập từ nớc khác giới Việt Nam, nguồn gen ngô đợc bảo tồn Viện nghiên cứu ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự 3.000 dòng [10] Tập đoàn ngô Mexico trung tâm xuất ngô có đa dạng tối đa có bốn nòi đợc xác lập là: A Nhóm nòi địa cổ đại: Ngời ta cho nhóm xuất phát từ ngô bọc nguyên thuỷ Mexico Các nòi nhóm khác phát triển độc lập địa bàn môi trờng khác chúng tổ tiên Bốn nòi nhóm Palomero toluqueno, Arrocillo amarillo, Chapalote Nal-tel B Nhóm nhập nội tiền Columbus: Các nòi nhóm đợc nhập vào Mexico từ Trung Nam Mỹ vào thời tiền sử Bốn nòi là: Cacahuacintle, Harinoso de Ocho, Oloton ngô C Nhóm lai tiền sử: Nhóm bao gồm nòi đợc coi tạo từ việc lai tạp nòi địa cổ đại với nòi nhập nội tiền Columbus, hai nhóm với Teosinte Hiện tám nòi là: Conico, Reventador, Tablonicillo, Tehua, Tepecintla, Comiteco, Jala Zapalote chico D Nhóm đại: Bao gồm nòi phát triển gần cha đạt đến trạng thái ổn định, nhiên có đặc điểm phân biệt xác định Có bốn nòi đợc gọi là: Chalqueno, Celaya, Conico Norteno Bolita Từ ta thấy rõ biến dị to lớn đợc xảy nh Đó nòi giống sản sinh nguồn gen ngô giới đa dạng di truyền Sự đa dạng di truyền ngô đợc thể tất tính trạng cờ bắp đặc điểm cây, biến động thể chiều cao cây, chiều cao đóng bắp đặc điểm (dài lá, chiều rộng lá, số cây, số -5- bắp), màu thân dạng lóng Sự biến động cờ thể độ dài cờ, cuống cờ, độ nhánh dài, số nhánh cấp hai ba, đờng kính bắp số hàng hạt Đặc biệt biến động đa dạng nội nhũ hạt, từ ta phân biệt dạng ngựa, đá rắn, bột, đờng, nếp, nổ bọc Sự biến động thể kích thớc hạt, màu hạt chất lợng hạt Việt Nam ngô trồng nhập nội phong phú nguồn gen có hạn hẹp Theo nghiên cứu phân loại ngô địa phơng Việt Nam (GS.TS Ngô Hữu Tình, 1995) từ năm 60 đến cho thấy, ngô Việt Nam tập trung chủ yếu vào hai loài phụ đá rắn nếp Ngày để đánh giá đa dạng di truyền loài, ngời ta không dựa vào đặc điểm thực vật học dễ nhận biết riêng rẽ mà cần phân tích sở nhiều tính trạng để phân biệt nhóm cách biệt di truyền thông qua khoảng cách Ơclit khoảng cách Mahalanobis Gần công nghệ sinh học góp phần đắc lực việc xác định đa dạng di truyền thông qua kỹ thuật Isozyme đa hình độ dài phân đoạn cắt hạn chế (RFLP Restriction Flagment Length Polymorphis), RAPD (Đa hình đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) 1.1.3 Đặc điểm hình thái ngô Rễ: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho rễ họ hòa thảo Ngô có ba loại rễ chính: Rễ mầm: Gồm rễ mầm sơ sinh (rễ phôi) rễ thứ sinh, hai loại rễ mầm tạo thành hệ rễ tạm thời cung cấp nớc chất dinh dỡng cho ngô khoảng thời gian 2-3 tuần Sau vai trò nhờng lại cho hệ rễ đốt Rễ đốt (rễ phụ cố định): Xuất đốt thấp thân, mọc vòng quanh đốt dới mặt đất Ngô rễ đốt lúc 3-4 có số lợng lớn từ 8-16 rễ đốt Ban đầu rễ đốt có chiều hớng ăn ngang sau ăn sâu xuống đất Rễ đốt giúp ngô hút nớc chất dinh dỡng suất đời ngô -6- Rễ chân kiềng: Rễ chân kiềng mọc xung quanh đốt gốc sát mặt đất Rễ chân kiềng to, nhẵn, phân nhánh, rễ lông hút phần mặt đất Rễ giúp chống đỡ bám chặt vào đất, chúng tham gia hút nớc thức ăn Thân, lá: Ngô thuộc họ hòa thảo, song có thân chắc, có đờng kính từ 2-4cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái chăm sóc Thân có chiều cao khoảng 1,5-4m Thân ngô có nguồn gốc từ chồi mầm (plumule), bao phủ bao mầm (coleotyl) nằm phôi hạt ngô Từ thân phát sinh nhánh hay thân phụ từ đốt dới đất Số nhánh thờng biến động từ 1-10 Nhánh có hình dạng tơng tự nh thân Thân ngô trởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm đốt kết thúc cờ Số lóng chiều dài lóng tiêu quan trọng việc phân loại giống ngô Lóng mang bắp có rãnh dọc cho phép bắp bám phát triển bình thờng Sau bao mầm mọc lên khỏi mặt đất, bắt đầu lần lợt mở Mỗi đợc cấu tạo (phiến lá), bẹ ôm chặt lấy thân lỡi (thìa lìa) Lá giống khác thay đổi số, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc thân Số đặc điểm ổn định có quan hệ chặt chẽ với số đốt thời gian sinh trởng Để tính số ngô giai đoạn ta đếm số có bẹ nhìn thấy đợc mắt Bông cờ bắp: Ngô loại có hoa khác tính gốc Hai quan sinh sản đực (bông cờ) (bắp) nằm cây, song vị trí khác Hoa đực: Hoa đực thờng đợc gọi cờ nằm đỉnh Hoa đực xếp thành chùm gồm trục nhiều nhánh, hoa đực đợc mọc thành nhỏ gọi chét, gié Trong nhỏ có hai hoa, hoa cuống dài hoa cuống ngắn Bao quanh phận hoa có hai mày nhỏ mày tơng ứng với bắc hoa mày tơng ứng với -7- đài hoa Khi hoa chín mày phồng lên, nhị dài ra, bao phấn tách khỏi hoa tung phấn hình trứng có đờng kính khoảng 0,1 mm Mỗi nhỏ có hai hoa, hoa có nhị đực, hị đực có bao phấn, bao phấn có ô ô chứa khoảng 1000-2500 hạt phấn Mỗi cờ có từ 7001400 hoa Nh tổng cộng cờ cho 10-30 triệu hạt phấn Khi bắt đầu nở, hoa 1/3 phía đỉnh trục tung phấn trớc, sau tung phấn theo thứ tự từ xuống dới từ vào Hoa cái: Hoa tự (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách lá, song 1-3 chồi khoảng thân tạo thành bắp Hoa có cuống gồm nhiều đốt ngắn, đốt cuống có bi bao bọc Lá bi thờng phiến Trên trục hoa (cùi, lõi ngô), hoa mọc đôi nhỏ Mỗi nhỏ có hai hoa, nhng hoa thoái hóa, hoa tạo thành hạt Phía hoa có hai mày mày mày Ngay sau mày quan sát thấy dấu vết nhị đực hoa thứ hai thoái hóa, bầu hoa, bầu hoa có núm vòi nhụy vơn dài thành dâu Hạt: Hạt ngô thuộc loại dính gồm năm phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ chân hạt Vỏ hạt bao quanh hạt, màng nhẵn Lớp alơron nằm dới vỏ hạt, bao lấy nội nhũ phôi Nội nhũ phần hạt chứa tế bào dự trữ chất dinh dỡng Nội nhũ có hai phần: nội nhũ bột nội nhũ sừng Tỷ lệ phục thuộc vào chủng ngô giống ngô khác 1.1.4 Tình hình định hớng phát triển ngô Việt Nam Việt Nam, ngô lơng thực quan trọng thứ hai sau lúa, có phát triển rộng khắp, liên tục đạt đỉnh điểm vào năm 2005 Theo tổng quan nông nghiệp năm 2005 Nguyễn Sinh Cúc (NN PTNT 1/2006) sản xuất ngô năm 2005 có tiến vợt bậc: Diện tích đạt 1039 nghìn ha, suất đạt 35,5 tạ/ha sản lợng đạt 3,69 triệu tấn, làm thay đổi tỷ trọng cấu sản lợng thực từ 5,7% năm 2000 lên 9% năm 2005 [1] -8- Những tiến sản xuất ngô Việt nam thể rõ nét giai đoạn 20 năm thực đờng lối đổi Đảng Trong suất 20 năm qua (19852004) diện tích, suất sản lợng ngô Việt Nam tăng liên tục với tốc độ cao Tỷ lệ tăng trởng bình quân hàng năm suốt 20 năm diện tích 7,5%/năm, suất 6,7%/năm sản lợng 24,5%/năm, cao nhiều 10 năm trớc đất nớc ta thống 1975-1985 (các tỷ lệ tơng ứng giai đoạn 4,2%; 3,9% 10,0%) Nếu lấy số liệu tuyệt đối năm (1985) sau 20 năm đổi (2004) thấy diện tích ngô tăng 2,5 lần, suất 2,3 lần sản lợng 5,9 lần [1] Tuy nhiên, suất ngô Việt Nam năm 2004 (34,9 tạ/ha) thấp suất bình trung bình giới (48,5 tạ/ha), thấp nhiều so với Mỹ (100,0 tạ/ha) Trung Quốc (51,1 tạ/ha) song vợt đợc suất bình quân khối nớc phát triển (31,3 tạ/ha) Mặc dầu vậy, khách quan mà nói: Sản xuất ngô Việt Nam thời kỳ đổi có phát triển vợt bậc, toàn diện đáng trân trọng 1.2 Cây trồng biến đổi gen 1.2.1 Khái niệm trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen trồng công nghệ sinh học trồng đợc biến đổi mặt di truyền nhằm làm cho trồng mang số đặc tính quý trồng tự nhiên Công nghệ cho phép gen riêng biệt chọn lọc đợc chuyển từ thể sang thể khác nh loài liên quan với Các tính trạng thờng đợc chuyển vào trồng nh tính kháng côn trùng, kháng nấm bệnh, kháng vi khuẩn, kháng thuốc trừ cỏ, kháng mặn, cho suất cao, chất lợng sản phẩm tốt Đây phơng hớng quan trọng giải vấn đề an toàn lơng thực cho nhân loại góp phần giảm thiểu loại nông dợc phân bón hoá học, bảo vệ môi trờng sinh thái bền vững -9- Sự biến đổi mặt di truyền thờng bao gồm chèn đoạn ADN, tái tổ hợp mảnh ADN nhỏ vào hệ gen trồng bị biến đổi Cấu trúc gen chèn điển hình GMC (Genetically Modified Crops) đợc tạo nên phận: Đoạn promoter (đoạn khởi động) có chức điều khiển hoạt động gen cấu trúc, đợc ví nh công tắc bật/mở để đọc gen chèn vào Gen đợc chèn (gen bị biến đổi) thực chất gen cấu trúc mã hoá cho đặc điểm chọn lọc riêng biệt Đoạn terminator (đoạn kết thúc) có chức nh tín hiệu dừng để đọc gen chèn Ngoài vài yếu tố khác có mặt cấu trúc đoạn ADN chèn chức chúng thờng để điều chỉnh ổn định chức gen để chứng minh có mặt cấu trúc ADN chèn GMC để có kết hợp dễ dàng thành phần khác cấu trúc đoạn ADN chèn Cấu trúc đoạn ADN chèn phải tơng hợp với hệ gen thể nhận để có di truyền ổn định 1.2.2 Những vấn đề liên quan đến trồng biến đổi gen 1.2.2.1 Lợi ích trồng biến đổi gen Thực trạng phát triển nhanh chóng trồng biến đổi gen năm qua chứng tỏ chúng có mặt mạnh trội hẳn trồng không biến đổi gen Sau lợi ích mà chúng đem lại cho ngời thời gian kể từ trồng biến đổi gen xuất nay: Lợi ích nghiên cứu bản: Việc sử dụng GMC góp phần to lớn việc phát gen quan trọng, xác định đợc chức gen Lợi ích cải tạo giống trồng: Nhờ có công nghệ gen mà nhiều giống trồng đợc tạo với đặc tính trồng tự nhiên nh -10- Bảng 7: Một số đặc điểm hình thái đặc điểm nông sinh học dòng giống ngô kháng thuốc diệt cỏ (vụ Thu Đông 2007) Tên dòng Thời gian sinh trởng (ngày) Cao TB (cm) Cao bắp TB (cm) Số TB Dài cờ TB (cm) CG3-D1 110 104,8 50,3 16 CG4-D1 115 89,2 43,3 CG3-D2 110 91,8 CG3-D3 110 CG3-D4 Màu cờ Màu râu Màu dạng hạt Đặc điểm khác 26,6 Trắng xanh Hồng ĐV, LT, RN Cây yếu, tha, bắp nhỏ, kết hạt 16 14,1 Nâu Hồng ĐV, LĐ Cây yếu, tha, bắp nhỏ 53,0 16 24,3 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, tha, bắp nhỏ 102,2 38,2 17 27,4 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ 110 86,6 44,9 16 21,6 Trắng xanh Hồng ĐV LT BRN Cây yếu, bắp nhỏ, hạt CG3-D5 110 105,2 46,4 16 27,0 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, tha, bắp nhỏ CG3-D6 110 102,6 51,2 16 24,8 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, tha, bắp nhỏ CG3-D7 110 112,1 56,6 17 33,4 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D8 110 111,3 48,8 17 31,8 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D9 110 98,6 57,8 17 28,4 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ, kết hạt CG4-D2 115 86,2 51,0 16 13,2 Nâu Hồng ĐV, LĐ Cây yếu, tha, bắp nhỏ CG3-D10 110 108,4 54,0 17 26,0 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ, kết hạt CG3-D11 110 102,6 52,2 17 24,3 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D12 110 112,4 48,6 17 32,0 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ ĐV: đá vàng; LT: lõi trắng; LĐ: lõi đỏ; BRN: bán ngựa Nhìn chung dòng ngô nghiên cứu có thời gian sinh trởng từ 110-115 ngày (vụ Thu Đông 2007), dòng ngô nghiên cứu có chiều cao trung bình thấp dao động từ 86,2-112,4cm, 16-17 lá, yếu bắp nhỏ, khă kết hạt Các dòng ngô sử dụng trực tiếp vào thí nghiệm tạo giống lai -48- 3.4.2 Kết phân tích đa hình ADN kỹ thuật PCR-RAPD dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ Để tiến hành phân tích đánh giá mức độ đa hình di truyền dòng, sản phẩm PCR đợc điện di gen agarose 1% Dới kết phân tích PCR-RAPD với số mồi đặc trng + Mồi OPA12 Hình 10: Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi OPA12 Các giếng từ 1-14 tơng ứng với thứ tự dòng ngô Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD (hình 10) 14 dòng ngô với mồi OPA12 có 11 loại băng với kích thớc khác từ 400-2000bp đợc nhân lên (bảng 8) Trong đó, mẫu số (CG3-D4) có số băng ADN đợc nhân nhiều băng, mẫu số (CG3-D2) có băng đợc nhân Mẫu số (CG3-D2) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 400 bp, 1600 bp băng vắng mặt (duy nhất) vị trí 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp 1500 bp Tính đa hình đợc thể xuất hay không xuất băng ADN so sánh dòng với mồi OPA12 11 băng cho đa hình Bảng 8: Các băng ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPA12 -49- TT 10 11 Tổng 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 5 1 1 1 1 Thứ tự dòng 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 7 10 1 1 0 1 1 11 1 0 1 1 12 1 1 0 13 1 1 1 14 1 1 1 (số đoạn ADN đợc nhân, Số đoạn ADN không đợc nhân) + Mồi OPM12 Hình 11: Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi OPM12 Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD dòng ngô với mồi OPM12 có loại băng với kích thớc khác từ 200-700bp đợc nhân lên Trong đó, mẫu số (CG3-D4) mẫu số (CG3-D5) có số băng ADN đợc nhân nhiều phân đoạn mẫu số (CG3-D2) mẫu số (CG3-D7) băng -50- đợc nhân Mẫu số (CG3-D4) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 700 bp mồi OPM12 băng nhân lên cho đa hình Bảng 9: Các băng ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPM12 Thứ tự dòng TT 10 11 12 13 14 Tổng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 2 3 2 2 (Số đoạn ADN đợc nhân, Số số đoạn ADN không đợc nhân) 0 0 + Mồi S208 Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi S208 Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD dòng ngô với mồi S208 có loại băng với kích thớc khác từ 100-1700bp đợc nhân lên Trong đó, mẫu số 11 (CG4-D2) có số băng ADN đợc nhân nhiều băng mẫu số (CG3-D1) có băng đợc nhân mồi S208 có băng đa hình băng -51- đơn hình đợc nhân lên Mẫu số (CG3-D8) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 1700 bp Bảng 10: Các băng ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi S208 Thứ tự dòng TT Tổng 0 1 0 2 10 11 12 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 4 (Số đoạn ADN đợc nhân, Số đoạn ADN không đợc nhân) 13 0 1 14 0 0 0 Bảng 11: Thống kê mồi xuất băng đa hình TT Tên mồi OPA12 S202 OPA15 S201 OPM12 OPM9 OPA18 BIO12 S208 10 OPM18 Số mồi đa hình 10 Đơn hình 0 0 0 Đa hình 11 46 Băng cá biệt 1 0 Kết phân tích PCR_RAPD 14 dòng ngô với tổng 20 mồi thuộc nhóm OPA, OPM, BIO nhóm S cho thấy có 10 mồi cho băng đa hình rõ mồi: OPA12, S202, OPA15, S201, OPM12, OPM9, OPA18, BIO12, -52- S208 OPM18 (bảng 11) Thống kê kết phân tích tính đa hình kỹ thuật PCR_RAPD với 10 mồi bảng 12 Bảng 12: Kết PCR-RAPD dòng ngô với 10 mồi cho băng đa hình T Tên T dòng CG3-D1 CG4-D1 CG3-D2 CG3-D3 CG3-D4 CG3-D5 CG3-D6 CG3-D7 CG3-D8 10 CG3-D9 11 CG4-D2 12 CG3-D10 13 CG3-D11 14 CG3-D12 Tổng Số băng ADN thu đợc mồi OPA12 S202 OPA15 S201 OPM12 7 8 7 93 0 0 3 11 5 5 7 2 63 2 2 2 2 2 2 2 28 2 3 2 2 22 OPM9 OPA18 BIO12 S208 0 1 0 2 1 10 7 6 80 2 3 34 4 3 52 OPM18 Tổng 1 0 4 34 25 38 19 25 35 32 31 31 27 39 33 33 32 27 427 Các số liệu thu đợc bảng 12 cho thấy: Với 140 phản ứng PCR nhân lên đợc tổng số 427 băng thuộc 56 loại băng có kích cỡ khác Trong đó, có 51 băng cho đa hình chiếm 91,07%, băng đơn hình chiếm 8,93% Kích thớc băng có chiều dài nhỏ khoảng 200 bp băng có kích thớc lớn khoảng 4000bp Xuất băng cá biệt có băng xuất mẫu băng khuyết mẫu xuất 13 dòng lại Mồi OPA12 nhân lên đợc tổng số băng nhiều 93 băng mẫu số (CG3D2) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 400 bp, 1600 bp băng vắng mặt (duy nhất) vị trí 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp 1500 bp; Mồi OPM18 nhân lên đợc 80 băng; Mồi OPA15 nhân lên đợc 63 băng mẫu CG3-D12 xuất -53- băng cá biệt kích thớc khoảng 2100 bp; Mồi S208 nhân lên đợc 52 băng mẫu CG3-D8 xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 1700 bp; Mồi BIO12, OPM18 nhân lên đợc 34 băng; Mồi S201 nhân lên đợc 28 băng; Mồi OPM12 nhân lên đợc 22 băng mẫu số (CG3-D4) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 700 bp; Mồi S202 nhân lên đợc 11 băng; Mồi OPM9 nhân lên đợc 10 băng Số băng nhân lên trung bình cho 10 mồi 42,7 băng/mồi 3.4.3 Mối quan hệ dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ dựa phân tích RAPD Số liệu thu đợc từ 10 mồi RAPD đợc thống kê phân tích phần mềm NTSYSpc 2.02, từ thiết lập đợc bảng hệ số tơng đồng di truyền (bảng 13) sơ đồ hình quan hệ di truyền 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ (hình 13) Bảng 13: Hệ số tơng đồng di truyền dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ 10 11 12 13 14 1.00 0.57 0.41 0.51 0.57 0.54 0.69 0.64 0.57 0.52 0.56 0.52 0.50 0.57 1.00 0.42 0.53 0.62 0.66 0.60 0.60 0.47 0.63 0.65 0.65 0.59 0.51 1.00 0.51 0.42 0.41 0.47 0.51 0.35 0.41 0.48 0.48 0.50 0.48 1.00 0.50 0.72 0.64 0.64 0.48 0.42 0.52 0.41 0.54 0.52 1.00 0.55 0.69 0.65 0.63 0.72 0.65 0.58 0.67 0.63 1.00 0.70 0.57 0.43 0.47 0.54 0.51 0.56 0.55 1.00 0.77 0.56 0.55 0.56 0.56 0.61 0.61 -54- 10 11 12 13 14 1.00 0.56 0.59 0.60 0.48 0.57 0.61 1.00 0.57 0.50 0.39 0.43 0.50 1.00 0.63 0.71 0.65 0.60 1.00 0.60 1.00 0.58 0.75 1.00 0.57 0.66 0.68 1.00 Hình 13 Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ Qua bảng 13 hình 13 cho thấy hệ số tơng đồng di truyền 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ cặp dao động từ 0,35 đến 0,77 Hai dòng số (CG3-D6) số (CG3-D7) có hệ số tơng đồng di truyền cao 0,77 Dòng số (CG4-D1) số 11 (CG4-D2) có nguồn gốc từ dòng CG4 có hệ số tơng đồng cao 0,65 (phù hợp với nghiên cứu đánh giá hình thái) Dòng số (CG3-D2) dòng số (CG3-D8) có hệ số tơng đồng thấp 0,35 Hệ số tơng đồng di truyền cặp dòng dao động từ 0,35 đến 0,77 chứng tỏ dòng ngô tạo từ nguồn vật liệu ban đầu đa dạng phong phú Qua kết sử lý số liệu cho thấy mức tơng đồng 55% chia 14 dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ thành nhóm u lai: Nhóm gồm dòng: dòng số (CG3-D1), số (CG3-D3), số (CG3D5), số 7(CG3-D6) dòng số (CG3-D7) đợc chia làm nhóm phụ: Nhóm 1.1: gồm dòng số 1, số số Cả dòng có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ban đầu CG3 Hệ số tơng đồng cặp dòng nhóm -55- cao dao động từ 0,64-0,77 Trong hai dòng số số có hệ số tơng đồng di truyền cao 0,77 Nhóm 1.2 gồm có dòng số dòng số có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ban đầu CG3 có hệ số tơng đồng cao 0,72 Nhóm gồm dòng: dòng số (CG4-D1), số 11 (CG4-D2), số (CG3D4), số 10 (CG3-D9), số 12 (CG3-D10), số 13 (CG3-D11) dòng số 14 (CG3D12) dòng số dòng số 11 có nguồn gốc từ CG4, dòng lại có nguồn gốc từ CG3, đợc chia làm nhóm phụ: Nhóm 2.1: gồm có dòng số dòng số 11 có hệ số tơng đồng cao 0,65 Nhóm 2.2: gồm có dòng số dòng số 10 có hệ số tơng đồng cao 0,72 Nhóm 2.3: gồm có dòng số 12 , dòng số 13 số 14 có hệ số tơng đồng cặp cao dao động từ 0,66-0,75 Nhóm 3: có dòng số (CG3-D8) có hệ số tơng đồng với dòng lại dao động từ 0,35-0,63, hệ số tơng đồng thấp 0,35 dòng số dòng số Nhóm 4: có dòng số (CG3-D2) có hệ số tơng đồng với dòng lại thấp dao động từ 0,35-0,51 Nh vậy, sở phân tích đa dang di truyền mức độ phân tử ADN kỹ thuật PCR_RAPD kết hợp với phân tích hình thái cho thấy khác đặc điểm hình thái v khác biệt di truyền dòng ngô Các dòng có nguồn gốc thờng có quan hệ gần gũi với v nhóm Những dòng có hệ số tơng đồng di truyền thấp dòng có nguồn gốc khác Dựa kết phân tích đa dạng di truyền hình thái phân tử để thiết kế sơ đồ lai backcross nhằm tạo đợc dòng ngô u việt mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc trừ cỏ -56- Phần IV Kết Luận Và Kiến Nghị 4.1 Kết luận Đã tách chiết đợc 180 mẫu ADN 180 dòng ngô Đã xác định đợc có mặt promoter 35S có kích thớc 195bp 14/180 dòng ngô hệ thứ đợc tạo cách tự thụ cỡng từ nguồn vật liệu CG3 (mang gen kháng thuốc trừ cỏ) CG4 (mang gen kháng sâu kháng thuốc trừ cỏ) Đã xác định đợc có mặt gen PAT (đoạn trình tự đặc trng có độ dài 231 bp) dòng ngô Đã đánh giá đợc số đặc điểm hình thái, tiêu nông sinh học đa dạng di truyền mức phân tử kĩ thuật PCR-RAPD 14 dòng ngô nghiên cứu phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô u việt mang gen gen kháng thuốc trừ cỏ 4.2 Kiến nghị Trong vụ tiếp theo: Tiếp tục kiểm tra có mặt gen kháng thuốc trừ cỏ khác dòng ngô phát có promoter 35S (nhng gen PAT) Kiểm tra khả kháng thuốc trừ cỏ dòng ngô mang gen PAT phơng pháp phun thuốc trừ cỏ nhóm glufosinate đồng ruộng Giữ nguồn vật liệu dòng thuần, tiếp tục nghiên cứu tạo dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ công tác backcross (lai ngợc) để chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ sang dòng ngô u việt nhằm tạo dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ có đặc điểm nông sinh học tốt, phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc trừ cỏ -57- Phần V Tài Liệu THAM Khảo 5.1 Tài liệu tiếng Việt Bùi Mạnh Cờng (2007) Công nghệ sinh học chọn tạo giống Ngô NXB Nông nghiệp Bùi Mạnh Cờng, Trần Hồng Uy, P W J Taylor, R Ford, Nguyễn Thị Thanh, Lê Quý Kha (2000) Nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng ngô đờng phơng pháp RAPD marker Tạp chí Di truyền học ứng dụng, số 1/2000, tr 16-22 Nguyễn Thuý Điệp (2003) Xét nghiệm ADN trồng sản phẩm biến đổi gen Luận văn thạc sĩ Công nghệ Sinh học Phan Xuân Hào, Bùi Mạnh Cờng, Nguyễn văn trờng, Đào Bích Thảo Phân tích đa dạng di truyền dòng mối quan hệ hệ số di truyền với suất tổ hợp lai ngô đợc thể thông qua thị SSR Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, số 6/2005, tr 22-25 Thạch Mai Hoàng (2000) Tác động trồng biến đổi gen tới môi trờng Tạp chí Sinh học ngày nay, số 28, tr 17-19 Nguyễn Thị Lang (2002) Phơng pháp nghiên cứu công nghệ sinh học NXB Nông nghiệp Phạm Bình Quyền, Nguyễn Nghĩa Thìn (1999) Đa dạng sinh học NXB ĐH Quốc gia HN Khuất Hữu Thanh (2006) Kỹ thuật gen: nguyên lý ứng dụng NXB KHKT Nguyễn Quang Thạch (2005) Giáo trình CNSH Nông nghiệp NXB Nông nghiệp 10 Ngô Hữu Tình, Trần Hồng Uy, Bùi Mạnh Cờng, Võ Đình Long, Lê Quý Kha, Nguyễn Thế Hùng (1997) Cây ngô, nguồn gốc, đa dạng di truyền trình phát triển NXB Nông nghiệp -58- 11 Khuất Hữu Trung cs (2007) Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lan Kiếm mức độ phân tử kỹ thuật PCR_RAPD Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, số 14/2007, tr 26-30 12 Trung tâm Thông tin t liệu khoa học công nghệ Quốc gia Cây trồng biến đổi gen - Tình hình nghiên cứu ứng dụng quan điểm phát triển Số 4/2003 5.2 Tài liệu tiếng Anh 13 Arne Holst-Jensen (2001) GMO detection methods and vatidation National Veterinary Institute, Section of Food & Feed Microbiology, Ullevaalsveien 68, P.O.Box 8156 Dep 0033 Oslo, Norway 14 Bertheau Y., Diolez A., Kobilinsky A., Magin K (2002) Detection methods and performance criteria for gennetically modified organisms J AOAC Int 2002 May-Jun, 85 (3), pp 801-808 15 Brodmann P D., Ilg EC, Berthoud H., Herrmann A (2002) Real-Time quantitative polymerase chain reaction methods for four genetically modified maize varieties and maize DNA content in food J AOAC Int 2002 May-Jun, 85 (3), pp 646-653 16 Devos K M., and Gale M D (1992) - The use of Random Amplified Polymorphic DNA markers in Wheat Theor Appl Genet 84, pp 567-572 17 Hsu Y L., Lih C., Daniel Y C S (2000) Detection of genetically modifiedsoybeans and maize by the polymerase chain reaction method Journal of Food and Drug Analysis, (3), pp 200-207 18 Huebner P., Studer E., Luethy J (1999) Quantitation of genetically modified organisms in food Nature Biotechnol, 17, pp 1137-1138 19 Jaroslava Ovesna, Lenka Dùdicovà, Jiri Horácek, Eva Sadilová, Ladislav Kucera, Ludmila Mésková (2002) Comparison of different PCR-based protocols for detection of Roundup Ready soybean Czech J.Genet.Plant Breed, 38(1)/2002, pp 55-63 -59- 20 Javed Akhter Mohammed Qutub, Norman Burnham, Mohammed Akhtar (2001) Genetically modified foods :health and safety issues Annals of Saudi Medicine, 21 (3-4), pp 161-164 21 Keatley K L., (2000) Controversy over genetically modified organisms: the governing laws and regulation Qual Assur 2000 Jan-Mar, 8(1), pp 3336 22 Love J., M Knight A M., Mcaleer M A., and Todd J A (1990) Towards construction of a high resolution map of the mouse genome using PCRanalyzed microsatellite Nucl Acid Res 18 (14), pp 4123 4130 23 Markus L., Anke B., Fabrice E., Lothar K., Heinz S., Guy V., D., E., (2000) Validation of a method based on Polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs Eur Food Res Technol 2001, 212, pp 497-504 24 Martens (2000) Safety evaluation of genetically modified foods Int Arch Environ Health 2000, 73 (Suppl), pp 14-18 25 Matsuoka T., H Kunbara, H Akiyama, H Miura, Y Goda, Y Kusakabe, K Isshiki, M Toyoda, A Hino (2001) A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize J Food Hyg Soc Japan, 42, pp 24-32 26 McCough S., R Chen X., Panaud O., Ternykh S., Xu Y., Cho Y., G Huang N., Ishii T., and Blair M (1997) Microsatellite markers development mapping and application in rice genetics and breeding, Plant Mol Biol 35, pp 89 99 27 Melody, M Aguiba (2003) Congress bills press for labeling of GM products Manila Bulletin, 8-Mar-2003 28 Meyer R, F Chardonnens, P Hubner, J Luthy (1996) Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of -60- soya in processed meat products Z Lebensm Unters Forsch , 203, pp 339-344 29 Mitten D H., MacDonald R, Klonus D (1999) Regulation of foods derived from genetically engineered crops Curr Opin Biotechnol, 10, pp 298-302 30 Morgante M., and Olivieri A M (1993) PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics Plant J.1, pp 175 182 31 Moseley B E., (1999) The safety and social acceptance of novel foods Int J Food Microbiol 1999, 50, pp 25-31 32 Nobuaki S., Keiko M., Sachiko O., Wataru H., Makoto K., Shigeru U., and Kousaku M (1998) Safety assessment of genetically engineered food: Detection and monitoring of Glyphosate-tolerant Soybeans Biosci Biotechnol Biochem 1998, 62(7), pp 1461-1464 33 Obara-Okeyo P & S Kako, 1998 Genetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers Euphytica 99, pp 95-1001 34 Ramon D (2000) Genetically modified foods: a case of information or misinformation Int Microbiol 2000, 3, pp 1-2 35 Stewart C., Richards H., and Halthill M (2000) Transgenic plants and biosafety: science, misconceptions and public perceptions Biotechniques, 29/2000, pp 832-843 36 Studer E., C Rhyner, J Luthy, P Hubner (1998) Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybeans and maize Z Lebensm Unters Forsch , 207(A), pp 207-213 37 Vos P., Hoggers R., Becker M., rejain M., Lee T., Hornes M., Friejtera P.J., Peleman J., Kuiper M and Zabeau M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting Nucl Acid Res 23, pp 4407 4414 -61- 5.3 Website 38 http://www.agbiotech.com.vn/ 39 http://www.cast-science.org/ 40 http:// www.gmo.gov.vn 41 http://www.isaaa.org 42 http://www.ncst.ac.vn/index.asp 43 http://www.sciencedirect.com 44 http:// www.sinhhocvietnam.com 45 http://www.vast.ac.vn/ 46 http://www.worldwatch.org/pubs/vs/2002/economy.html -62- [...]... nhạy cảm thuốc di t cỏ hoặc phân huỷ thuốc di t cỏ Glyphosat Tính kháng do sản xuất quá mức EPSPS, đích của thuốc di t cỏ này Tính kháng thuốc đợc cải biến bằng biến nạp đặc trng với gen EPSPS kháng glyphosat và thuốc lá với gen glyphosat oxidoreductaza mã hoá enzym phân huỷ glyphosat Axit phenoxycarboxylic Cây bông và thuốc lá có tính kháng đợc tạo thành bằng (nh 2,4-D và 2,4,5-T) biến nạp với gen tfdA... và kháng thuốc di t cỏ có năng suất cao và thích nghi tốt với các vùng sinh thái khác nhau Đây là đề tài/dự án thuộc chơng trình trọng điểm Phát triển ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp thực hiện từ tháng 10 năm 2006 1.4 Những vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ cỏ và một số dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ 1.4.1 Một số vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ. .. DT10 và DT13, cây cải dầu và bắp cải [38] Đối với cây lúa, đã tạo đợc lúa biến đổi gen giống Nàng Hơng Chợ Đào và 2 dòng cây biến đổi gen GUS A và hph Kết quả đã thu đợc những cây trồng biến đổi gen và lu giữ chúng trong điều kiện invitro và trong điều kiện nhà kính -17- 1.3 Cây ngô biến đổi gen 1.3.2 Tình hình sản xuất cây ngô biến đổi gen trên thế giới Trên thế giới thì di n tích cây ngô biến đổi gen. .. (chiếm 63% di n tích đất trồng cây CNSH toàn cầu) Các giống phổ biến nhất là chịu đợc thuốc glyphosate và glufosinate [41] Bảng dới đây (bảng 3) cho thấy các nớc đã chuẩn y các loại cây trồng chịu đợc thuốc di t cỏ chính dùng làm thực phẩm Bảng 2: Một số ví dụ về sự kháng thuốc di t cỏ Thuốc di t cỏ Cơ chế phát triển tính kháng thuốc di t cỏ -20- Triazin Tính kháng thuốc là do sự thay đổi gen psbA mã... trng hạt của gen Gluteline lúa và thiết kế các gen Cry Xa21 vào Plasmid pCAMBIA nhằm làm chủ nguồn gen có giá trị để tạo ra chủng vi khuẩn Agrobacterium cho việc chuyển gen vào thực vật Hoàn thiện quy trình chuyển gen CryIA(b), CryIA(c) kháng côn trùng, gen Chitinase kháng bệnh nấm, gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vi khuẩn và gen Bar kháng thuốc di t cỏ thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào cây lúa giống... nhau có thể làm cho cây trồng trở nên kháng thuốc di t cỏ có thể nêu ra là: Tạo ra một loại protein mới giải độc thuốc di t cỏ Thay đổi protein mục tiêu của thuốc di t cỏ do vậy mà protein này sẽ không bị tác động bởi thuốc di t cỏ Sản xuất quá mức protein mục tiêu nhạy cảm thuốc di t cỏ sao cho vẫn có d để duy trì các chức năng tế bào bất chấp sự có mặt của thuốc di t cỏ Cho cây khả năng bất hoạt... Ôxtralia, Canađa, Nhật Bản, Hoa kỳ cỏ chính dùng làm thực phẩm 1.4.2 Một số gen kháng thuốc trừ cỏ Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT), Bar Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) là một trong những gen kháng thuốc trừ cỏ đã đợc chuyển vào một số cây trồng nh ngô và đậu tơng Gen này chống chịu đợc với thuốc trừ cỏ glufosinate, đợc phân lập từ... súng bắn gen Dòng GA21 l ngô Roundup Ready, chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate Glyphosate l 1 loại thuốc trừ cỏ đợc biết sau ny, đây l loại thuốc trừ cỏ có hệ thống phân loại rõ nét m nó đã đợc sử dụng rộng rãi để kiểm soát không chọn lọc đối với các loi cỏ dại 1 năm v lâu năm Dòng GA21 có khả năng kháng thuốc trừ cỏ nhờ chuyển gen EPSPS nội sinh của ngô vo genome của cây, enzym mã hoá của gen ny không... cây trồng sống sót trong khi mà ứng dụng khác của glufosinate có thể gây chết 1.4.3 Một số dòng ngô mang gen kháng thuốc di t cỏ Event Bt16 Phơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen Dòng Bt16 đợc cải biến di truyền để kháng thuốc trừ cỏ ammoniumglufosinate (hay phosphinothricin), thnh phần hoạt tính của thuốc di t cỏ Basta, Finale, Buster, Harvest v Liberty Ammonium-glufosinate l một chất di t cỏ. .. hình di truyền ở sinh vật nói chung và ở ngô nói riêng -33- Phần II Vật Liệu Và PHƯƠNG Pháp NGHIÊN Cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là một 180 dòng ngô đợc tạo ra từ 2 dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ thu thập từ Achentina ký hiệu CG3 và CG4; Cặp mồi 35S1/35S2 sử dụng trong phản ứng PCR để khuyếch đại đoạn trình tự đặc trng của promoter CaMV-35S (195bp) có trong ngô chuyển gen; Cặp