NGHIÊN cứu xác ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN và ỨNG DỤNG CHẨN đoán TRƯỚC SINH BỆNH HEMOPHILIA a

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Bệnh máu khó đơng hemophilia A bệnh di truyền alen lặn liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X khơng có alen tương ứng nhiễm sắc thể Y, người mẹ mang gen bệnh truyền bệnh cho 50% trai truyền gen bệnh cho 50% gái Bệnh di truyền qua nhiều hệ có nhiều người mắc bệnh gia đình Bệnh ảnh hưởng đến tâm sinh lý, thể chất trẻ nhỏ gánh nặng cho gia đình xã Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia Mặc dù thời gian qua, cơng tác chăm sóc bệnh nhân hemophilia A Việt Nam có nhiều tiến bộ, số lượng bệnh nhân chẩn đoán quản lí tăng lên đáng kể, nhiên chiếm chưa tới 30% tổng số người bị bệnh đa số người mang gen bệnh chưa chẩn đốn quản lí Việc phát người lành mang gen bệnh đóng vai trò quan trọng cơng tác tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh để giúp ngăn ngừa sinh bị bệnh giảm tỷ lệ mắc bệnh Mục tiêu đề tài: Phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân hemophilia A xác định đột biến gen F8 Ứng dụng kỹ thuật I-PCR giải trình tự gen chẩn đốn trước sinh cho thai phụ có nguy cao sinh bị bệnh hemophilia A Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài: Phát người phụ nữ mang gen bệnh xét nghiệm thông thường xác định hoạt tính yếu tố VIII máu gặp khó khăn hoạt tính yếu tố VIII họ khơng giảm giảm ít, dao động từ 50 – 150%, có khoảng 10% tổng số phụ nữ có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương A (c.1010 – 27G > A) cộng với đa hình STR intron 13 22 Phương pháp phân tích liên kết thực nhanh, tương đối rẻ tiền, đáng tin cậy để phát trường hợp bị bệnh hemophilia A phả hệ gia đình có nhiều người bị bệnh Tuy nhiên, phương pháp phân tích liên kết phát người lành mang gen gia đình có đột biến phát sinh q trình hình thành giao tử Chẩn đốn trước sinh bệnh hemophilia A Kết phân tích gen cho biết thai phụ có mang gen bệnh hay khơng yếu tố sàng lọc quan trọng Sau trình phân tích sàng lọc, thai phụ có nguy cao sinh bị bệnh hemophilia A tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích xác định đột biến Các nghiên cứu người lành mang gen bệnh Việt Nam Các nghiên cứu bệnh nước ta tập trung chủ yếu vào tỉ lệ mắc bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị tác động tâm lý bệnh bệnh nhân thành viên gia đình Như để ngỏ việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử việc phân tích, phát đột biến gen F8, người lành mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Gồm 50 gia đình bệnh nhân hemophilia A xác định đột biến gen F8 (tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội) bao gồm: - 50 người mẹ bệnh nhân - 116 thành viên nữ (bà ngoại, bà họ, bác gái, dì, chị, em gái ) có huyết thống với bệnh nhân - 12 thai phụ/166 thành viên gia đình bệnh nhân 6/12 thai phụ người lành mang gen bệnh, mang thai tuần thai thứ 12-18 - 20 người (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đình khơng có người mắc bệnh di truyền dùng để chuẩn hóa kỹ thuật làm mẫu đối chứng với mẫu nghiên cứu thực kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen Các đối tượng nghiên cứu lấy mẫu nghiên cứu: Máu tĩnh mạch có chống đông EDTA, dịch chọc ối (thai phụ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang 2.3 Địa điểm nghiên cứu + Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, trường Đại học Y Hà Nội + Thời gian từ 1/2012 – 6/2014 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu: 50 bệnh nhân hemophilia A xác định đột biến gen F8 Xây dựng 50 phả hệ Phát người lành mang gen bệnh chắn (Mẹ, chị, em gái… ) Khơng mang Xác định người có nguy cao mang gen bệnh (Mẹ, chị, em gái… ) Mang thai Xét nghiệm gen F8 - Kỹ thuật I-PCR(đảo đoạn int22) - Giải trình tự gen (đột biến điểm, đoạn nhỏ) thai Không xét nghiệm gen Mang gen bệnh Không mang gen bệnh Tư vấn di truyền phòng bệnh Tư vấn đình thai nghén Khơng chẩn đốn trước sinh Có đột biến Khơng đột biến Chẩn đốn trước sinh Tư vấn giứ thai 2.4 Quy trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu - Phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu - Phản ứng PCR khuếch đại 26 exon gen F8 - Kỹ thuật giải trình tự gen phát đột biến điểm đoạn nhỏ - Kỹ thuật I-PCR (Inversion-PCR) xác định đột biến đảo đoạn intron 22 - Nuôi cấy tế bào ối 2.5 Đề tài tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu Y học Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo quan hệ với bệnh nhân Quan hệ với bệnh nhân Mẹ bệnh nhân Các thành viên nữ (bà, bác, dì chị em gái) Tổng n 50 116 166 Tỷ lệ % 30,1 69,9 100 Nhận xét: Trong 166 thành viên nữ 50 gia đình bệnh nhân hemophilia A có 50 người mẹ, chiếm tỷ lệ 30,1% 116 người bao gồm bà, bác, dì chị em gái bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 69,9% 3.2 Kết phát người lành mang gen bệnh hemophilia A 3.2.1 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh qua phân tích phả hệ Bảng 3.2 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh phát dựa vào phả hệ Tình trạng mang gen Thành viên gia đình Mẹ bệnh nhân Thành viên nữ khác Tổng Mang gen bệnh bắt buộc (n,%) Có nguy cao mang gen bệnh (n,%) Tổng (n,%) 20 (40%) 23 (20%) 43 (26%) 30 (60%) 93 (80%) 123 (74%) 50 116 166 Nhận xét: Phân tích phả hệ cho thấy 20/50 người mẹ (chiếm tỷ lệ 40%) 23/116 thành viên nữ (chiếm tỷ lệ 20%) mang gen bệnh bắt buộc; 30/50 người mẹ (chiếm tỷ lệ 60%) 93/116 thành viên nữ người có nguy cao mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 80%); 43/166 người chắn 10 mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 26%) 123/166 người có nguy cao mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 74%); 3.2.2 Kết tách chiết DNA DNA tổng số từ máu toàn phần tách theo phương pháp phenol/chloroform Nồng độ DNA tổng số tách có giá trị từ 150 – 1200 ng/l độ tinh mẫu đạt yêu cầu với tỷ lệ mật độ quang đo bước sóng 260/280 nm nằm khoảng 1,8-2,0 3.2.3 Kết phát người lành mang gen bệnh phương pháp phân tích gen 3.2.3.1 Kết phát người lành mang gen F8 đột biến đảo đoạn intron22 559 bp 500 487 bp bp M: Marker 100bp : Mẹ bệnh nhân (II3) 1: Người bình thường (chứng âm) 4: Bác gái bệnh nhân (II1) 3: Bệnh nhân (III4) 5: Dì bệnh nhân (II5) 6: Chị gái họ bệnh nhân (III2) Hình 3.4 Hình ảnh multiplex PCR xác định đột biến intron 22 gia đình bệnh nhân HA02 Nhận xét: DNA người bình thường vị trí giếng số có băng kích thước tương ứng 487 bp DNA bệnh nhân HA02 bị đột biến đảo đoạn intron 22 giếng số có băng kích thước tương ứng 559 bp DNA người mẹ, bác gái chị gái họ bệnh nhân giếng số 3, có vạch kích thước tương ứng 487 559 bp, 12 - Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA16 (trước phân tích gen) Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA16 có trai bị bệnh hemophilia A (bệnh nhân mã số HA16 – IV6), có tiền sử gia đình khơng rõ ràng, bà ngoại (II6), bà họ (II1), mẹ (III9), bác gái (III3, III5, III7), dì (III11, III13) chị họ bệnh nhân (IV1, IV2, IV4, IV5) người lành mang gen bệnh 13 - Kết phát người lành mang gen bệnh Hình 3.7 Hình ảnh giải trình tự gen gia đình mã số HA16 Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 người mẹ, bác chị họ bệnh nhân HA16 xuất đỉnh chồng lên sau điểm đột biến c.4997insA, chứng tỏ mẹ, bác chị họ bệnh nhân mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử - Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA16 (sau phân tích gen) 14 Hình 3.8 Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA16 3.2.3.4 Kết phát người lành mang gen F8 đột biến xóa đoạn nhỏ - Kết phân tích gen gia đình bệnh nhân mã số HA66 Hình 3.16 Hình ảnh giải trình tự gen gia đình mã số HA66 Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự exon gen F8 người mẹ (II 1) bệnh nhân HA66 xuất đỉnh chồng lên vị trí đột biến phát bệnh nhân (c 468 – 480del15bp), chứng tỏ 15 người mẹ bệnh nhân mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử - Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA66 sau phân tích gen Hình 3.17 Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA66 (sau phân tích gen) Nhận xét: Trong thành viên nữ (I1, II1) gia đình bệnh nhân HA66 có nguy cao mang gen bệnh xác định được: thành viên nữ có mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử (II 1), thành viên nữ (I1 – bà ngoại bệnh nhân) không mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử * Kết phân tích gen gia đình bệnh nhân mã số HA92 Bệnh nhân HA92 có đột biến thêm nucleotid A exon 14 (c 3864-70 insA) gây thay acid amin Glycin thành Arginin vị trí codon 1271 lệch khung dịch mã tồn acid amin lại (P Gly1271Argfs*7) - Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA92 16 Hình 3.18 Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA92 Nhận xét: Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA92 có trai bị bệnh hemophilia A (bệnh nhân mã số HA92), tiền sử gia đình trước khơng có bị bệnh giống bệnh nhân, bà ngoại (I1), mẹ (II1), dì (II3) chị họ bệnh nhân (III2, III3) người lành mang gen bệnh - Kết phát người lành mang gen bệnh Hình 3.19 Hình ảnh giải trình tự gen gia đình mã số HA92 Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 người mẹ (II 1) dì (II3) bệnh nhân HA92 giống trình tự gen người bình thường, chứng tỏ mẹ dì bệnh nhân không mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử Từ kết không cần phân tích gen 17 chị họ bệnh nhân (III2, III3) đột biến bệnh nhân khơng phải đột biến di truyền 3.2.3 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh Bảng 3.3 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh Mang gen bệnh Thành viên gia đình Phân tích Phân tích phả hệ gen Mẹ bệnh nhân 20 14 Thành viên nữ khác 23 32 Tổng 43 46 Tổng (n,%) 34 (68) 55 (47,4) 89 (54) Không mang gen bệnh (n,%) Tổng 16 (32) 61 (52,6) 77 (46) 50 116 166 Nhận xét: 34/50 (68%) người mẹ mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử 16/50 người mẹ (32%) không mang gen F8 đột biến 55/116 (47,4%) thành viên nữ khác (bao gồm: bà, bác gái, dì, chị em gái bệnh nhân) mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử; 61/116 (52,6%) thành viên nữ khác không mang gen F8 đột biến 89/166 thành viên nữ người lành mang gen bệnh, chiếm tỷ lệ 54%; 77/166 thành viên nữ không mang gen bệnh, chiếm tỷ lệ 46% 3.3 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh Hemophilia A 3.3.1 Đặc điểm chung thai phụ tham gia nghiên cứu Bảng 3.6 Một số đặc điểm chung thai phụ tham gia nghiên cứu Đặc điểm n Tổng số thai phụ tham gia nghiên cứu 12 15 tuần Số thai phụ không mang gen F8 đột biến Số thai phụ mang gen F8 đột biến 18 Nhận xét: Có 12 thai phụ tham gia vào nghiên cứu, có thai phụ xác định người lành mang gen bệnh mang thai tuần 12 – 18 Chẩn đoán qua siêu âm cho thấy thai nhi giới tính nam thai nhi giới tính nữ Những thai phụ sau tư vấn có nguyện vọng làm chẩn đoán trước sinh 3.3.2 Xác định độ tinh DNA tách chiết từ tế bào ối 6/12 thai phụ thực chẩn đoán trước sinh tiến hành chọc ối tuần thứ 15 thai kỳ Bệnh viện phụ sản Trung ương hướng dẫn siêu âm DNA tách chiết từ tế bào ối tiến hành kiểm tra độ tinh máy Nano drop Mẫu DNA thu có độ tinh cao, dao động 1,8 – 1,9 nồng độ khoảng 200 – 540 ng/l 3.3.3 Kết chẩn đoán trước sinh * Kết chẩn đoán trước sinh gia đình bệnh nhân HA04 Bệnh nhân HA04 có đột biến thêm nucleotid A exon 14 (c.4550insA) làm lệch khung dịch mã toàn acid amin từ vị trí codon 755 protein yếu tố VIII - Phả hệ gia đình bệnh nhân HA04: Gia đình bệnh nhân HA04 có trai bị bệnh hemophilia A (bệnh nhân mã số HA04 – III 1), phả hệ gia đình có người cậu (II3) bị bệnh, thai phụ - người mẹ bệnh nhân (II1) người lành mang gen bệnh bắt buộc, thai phụ phân tích gen cho kết mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử Việc chẩn đoán trước sinh cho thai phụ cần thiết thai nhi có giới tính nam - Kết xác định giới tính thai nhi (III2) Kỹ thuật PCR tiến hành với cặp mồi cho phép khuyếch đại vùng gen xác định giới tính SRY (có kích thước 254 bp) đặc hiệu NST Y Kết cho thấy thai nhi (III2) có giới tính nam 19 - Kết xác định đột biến thai nhi (III2) Dựa vào vị trí đột biến điểm mẫu DNA bệnh nhân HA04, mẫu DNA tách chiết từ tế bào ối thai phụ II (thai nhi III2) phân tích để xác định đột biến đứa trẻ sau sinh kiểm tra kết chẩn đốn trước sinh phân tích gen Hình 3.25 Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 DNA thai nhi (III2) trước sau sinh Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 DNA thai nhi III trước sinh khơng có đột biến giống đột biến phát bệnh nhân kết kiểm tra sau sinh cho phép khẳng định người em trai bệnh nhân HA04 (III2) không bị đột biến exon14 gen F8 Bảng 3.8+9 Kết phát đột biến mẫu ối trước sinh chẩn đoán sau sinh Kết n Giới tính Chẩn đốn Thai nhi bị bệnh Nam trước sinh Thai nhi không bị bệnh Nam (n=6) Thai nhi không mang gen bệnh Nữ Chẩn đốn Có đột biến gen F8 sau sinh Không đột biến gen F8 Nam (n=4) Chưa thực chẩn đoán sau sinh nam, nữ Nhận xét: Có 2/6 mẫu DNA tách chiết từ tế bào ối mang gen F8 đột 20 biến tư vấn đình thai nghén; 4/6 mẫu DNA khơng mang gen F8 đột biến đó: mẫu thực chẩn đoán sau sinh cho kết phù hợp với chẩn đốn trước sinh (khơng có đột biến gen F8); mẫu chưa thực chẩn đoán sau sinh chưa sinh CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về đặc điểm đối tượng nghiên cứu 166 thành viên nữ 50 gia đình bệnh nhân hemophilia A tham gia nghiên cứu bao gồm 50 người mẹ, chiếm tỷ lệ 30,1% 116 người bao gồm bà, bác, dì chị em gái bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 69,9%, nhiều người số người độ tuổi sinh đẻ 18 tuổi Việc xác định sớm tình trạng mang gen với trẻ nhỏ giúp bà mẹ quan tâm đến sớm từ chu kỳ kinh nguyệt xem có kéo dài khơng, có rong kinh khơng, có đau bụng khơng … giúp người trưởng thành có kiến thức, kế hoạch cho tương lai mình, chủ động phòng tránh yếu tố nguy gây chảy máu sở khoa học giúp chẩn đoán trước sinh tư vấn di truyền, tránh sinh bị bệnh hemophilia A 4.2 Về kết phát người lành mang gen bệnh hemophilia A 4.2.1 Về tỷ lệ phát người lành mang gen dựa vào phân tích phả hệ Đối với trường hợp bệnh nhân có tiền sử gia đình rõ ràng, dựa vào kết phân tích phả hệ xác định chắn tình trạng mang gen thành viên nữ gia đình bệnh nhân Dựa vào kết phân tích phả hệ nghiên cứu phát 20/50 người mẹ mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 40%); 30/50 người mẹ người có nguy cao mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 60%); 23/116 thành viên nữ mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 20%); 93/116 thành viên nữ người có nguy cao mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 80%) Kết nghiên cứu cho thấy 43/166 người chắn mang gen bệnh, chiếm tỷ lệ 26% Như tỷ lệ phát người mang gen bệnh dựa 21 vào phân tích phả hệ thấp khơng áp dụng cho trường hợp bệnh đơn lẻ gia đình 4.2.2 Về quy trình kỹ thuật tách chiết DNA tổng số Tách chiết DNA bước quan trọng quy trình áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử Nếu tách chiết DNA tốt, đảm bảo độ tinh sạch, phân tử DNA không bị đứt gãy, không bị tạp nhiễm phản ứng thu kết có độ xác cao Với sản phẩm DNA không tinh sạch, phản ứng PCR bị ức chế tạp nhiễm tạo sản phẩm không đặc hiệu Các mẫu DNA nghiên cứu có nồng độ cao độ tinh nằm khoảng cho phép từ 1,8-2,0 (bảng 3.1) Đó điều kiện tiên đảm bảo kết kỹ thuật quy trình nghiên cứu 4.2.3 Về kết phát người lành mang gen bệnh phương pháp phân tích gen 4.2.3.1 Phát người lành mang gen F8 đột biến đảo đoạn intron22 Đột biến đảo đoạn intron 22 xảy tái tổ hợp vùng int 22h (vùng lặp lại gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 hai vùng đồng nằm telomere, vị trí 400 kb đầu 5’ gen F8 Hiện tượng đảo đoạn dẫn đến đứt gãy gen F8 hậu gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân Đột biến chiếm 45-50% bệnh nhân Hemophilia A thể nặng Việc xác định đột biến đảo đoạn intron 22 bệnh nhân hemophilia A cung cấp cho sở để tiến hành phân tích phát người lành mang gen kỹ thuật I-PCR Kết hình 3.4 cho thấy người mẹ, bác gái chị họ bệnh nhân người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử Dì bệnh nhân không mang gen bệnh Mặc dù người mẹ xác định mang gen bệnh bắt buộc chúng tơi tiến hành phân tích mẫu DNA người mẹ, coi mẫu chứng dương cho tình trạng mang gen trạng thái dị hợp tử cho thành viên nữ khác gia 22 đình Điều chứng tỏ khơng có khác biệt điều kiện thực bước quy trình phát đột biến đảo đoạn kết phân tích gen đáng tin cậy Kết nghiên cứu cung cấp thông tin cho bác sỹ lâm sàng tư vấn cho người mẹ, bác, chị gái bệnh nhân cần làm chẩn đoán trước sinh cho lần mang thai sau 4.2.3.2 Phát người lành mang gen F8 đột biến điểm Đột biến điểm gen F8 bệnh nhân hemophilia A đột biến điểm để phát tình trạng mang gen thành viên nữ gia đình bệnh nhân Chúng tơi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phân tích tồn 26 exon gen F8 nhằm xác định xác tình trạng mang gen bệnh trạng thái hợp tử Đây kỹ thuật đại xác 4.2.3.3 Phát người lành mang gen F8 đột biến đoạn gen Đối với trường hợp bệnh nhân có đột biến thêm xóa đoạn nhỏ 50bp, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen F8 để phát người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử nhằm tiết kiệm chi phí Hình ảnh giải trình tự exon gen F8 người mẹ (II 1) bệnh nhân HA66 xuất đỉnh chồng lên vị trí đột biến phát bệnh nhân, chứng tỏ mẫu DNA người mẹ có alen bình thường alen đột biến 15 nucleotid vị trí c 468 – 480del15bp người mẹ mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử 4.2.3.4 Trường hợp bệnh nhân hemophilia A có người mẹ khơng mang gen bệnh Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 người mẹ (II 1) dì (II3) bệnh nhân HA92 giống trình tự gen người bình thường, chứng tỏ mẹ dì bệnh nhân không mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử Từ kết khơng cần phân tích gen chị họ bệnh nhân (III2, III3) đột biến bệnh nhân đột biến di truyền Như người mẹ mang gen F8 hồn tồn bình thường, đột 23 biến exon 14 gen F8 bệnh nhân HA92 đột biến phát sinh 4.2.4 Về tỷ lệ người lành mang gen bệnh hemophilia A Nghiên cứu thực với 50 gia đình bệnh nhân hemophilia A xác định đột biến điểm cho thấy có 34/50 người mẹ mang gen F8 đột biến dạng dị hợp tử chiếm tỷ lệ 68 % 16/50 người (chiếm tỷ lệ 32 %) không mang gen F8 đột biến, kết dựa cỡ mẫu nhỏ nên chưa thể có kết luận, nhiên bước đầu cho thấy phù hợp với quy luật di truyền bệnh (2/3 trường hợp đột biến di truyền, 1/3 đột biến phát sinh) Kết xác định tình trạng mang gen người mẹ quan trọng: mẹ mang gen bệnh bệnh có tính chất di truyền, trai nhận gen bệnh từ mẹ, gen bệnh người mẹ nhận từ hệ trước Kết nghiên cứu chứng tỏ tỷ lệ đột biến phát sinh bệnh nhân hemophilia A Việt Nam 32% Điều giải thích yếu tố bên ngồi tác động lên trình phát sinh giao tử thể người bố người mẹ điều kiện môi trường sống, tập quán ăn uống, chiến tranh để lại nhiều chất độc hại môi trường, Kết xét nghiệm gen cho thấy có 55/116 thành viên nữ dạng dị hợp tử (chiếm tỷ lệ 47,4 %); 61/116 thành viên nữ không mang gen đột biến (chiếm tỷ lệ 52,6%) Nghiên cứu Shetty S (2001) 102 gia đình bệnh nhân hemophilia A (Ấn Độ) thấy tỷ lệ người lành mang gen bệnh cao so với nghiên cứu chúng tơi (64,5%), tỷ lệ gia đình có tiền sử bệnh nghiên cứu khác nhau, mà thành viên nữ gia đình có tiền sử bệnh rõ ràng có nguy mang gen bệnh cao Chúng phát 89/166 thành viên nữ (bao gồm bà ngoại, mẹ, bác, dì, chị em gái bệnh nhân…) người lành mang gen bệnh hemophilia A Kết phát quan trọng với 89 người nữ khơng nghi ngờ mà chắn mang gen, họ cần làm thêm xét nghiệm định lượng hoạt tính yếu tố VIII 24 huyết để xác định nguy chảy máu Kết cho thấy người nữ cần thiết có kế hoạch dự phòng để đảm bảo sức khỏe nói chung sức khỏe sinh sản nói riêng nhằm nâng cao chất lượng sống Nghiên cứu khẳng định 77/166 người chắn không mang gen bệnh 4.3 Về kết chẩn đoán trước sinh Trước đây, thai phụ mang gen bệnh thường tư vấn nên sinh gái, thai nhi trai khuyến cáo nên đình thai nghén để tránh sinh bị bệnh Hemophilia A Ngày nay, tiến sinh học phân tử cho phép phát xác người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử để thực tư vấn hôn nhân di truyền gia đình có nguyện vọng Các thai phụ có nguy cao sinh bị bệnh hemophilia A (người lành mang gen bệnh) khuyến khích thực chẩn đốn trước sinh có hội sinh trai khỏe mạnh Kết chẩn đoán trước sinh thực nghiên cứu này: Có 2/6 mẫu DNA tách chiết từ tế bào ối mang gen F8 đột biến; 4/6 mẫu không mang gen F8 đột biến; 2/4 mẫu khơng đột biến thực chẩn đốn sau sinh cho kết phù hợp với chẩn đoán trước sinh (khơng có đột biến gen F8) Trong trường hợp thai phụ người lành mang gen bệnh mang thai giới tính nam tâm sinh cho dù có bị bệnh hay khơng vấn đề chẩn đốn trước sinh có đặt hay khơng? Chúng tơi cho nên làm chẩn đoán trước sinh biết trước thai nhi bị bệnh thai phụ sinh không can thiệp thủ thuật để lấy thai dễ gây chảy máu cho thai nhi Biết trước thai nhi bị bệnh máu khó đơng giúp bác sỹ sản khoa có định đắn khi thai phụ chuyển Việc phát người lành mang gen bệnh để quản lý, điều trị áp dụng phương pháp sàng lọc, chẩn đốn trước sinh điều vơ cần thiết, nhằm cải thiện chất lượng sống cho 25 người phụ nữ mang gen bệnh quan trọng làm giảm số trẻ sinh bị bệnh hemophilia A di truyền KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đưa số kết luận sau: Phát người lành mang gen F8 bị đột biến Trong 50 gia đình có bị bệnh hemophilia A xác định đột biến: - 34/50 người mẹ mang gen F8 đột biến dạng dị hợp tử, chiếm tỷ lệ 68% 16/50 người mẹ (chiếm tỷ lệ 32%) không mang gen F8 đột biến - 55/116 thành viên nữ (gồm bà ngoại, bác, dì, chị, em gái …) mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử, chiếm tỷ lệ 47,4 %; 61/116 thành viên nữ không mang gen bệnh, chiếm tỷ lệ 52,6% Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A 6/12 thai phụ người lành mang gen bệnh thực chẩn đoán trước sinh: 4/6 mẫu ối (thai nhi) không bị đột biến gen F8 nên thai phụ tư vấn di truyền giữ thai 2/4 trường hợp chẩn đốn sau sinh cho kết khơng đột biến gen F8 phù hợp với chẩn đoán trước sinh; 2/6 mẫu ối (thai nhi) mang gen yếu tố VIII đột biến nên thai phụ tư vấn đình thai nghén KHUYẾN NGHỊ Cần sớm phát người lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân hemophilia A để có kế hoạch quản lý, theo dõi tư vấn di truyền Cần thực chẩn đoán trước sinh tất trường hợp mẹ người lành mang gen bệnh mang thai giới tính nam để xác định thai nhi có bị bệnh hay khơng để từ có định đình thai nghén sớm tốt khơng cần có kế hoạch dự phòng 26 chảy máu cho thai phụ thai nhi lúc sinh ... không mang gen F8 đột biến Số thai phụ mang gen F8 đột biến 18 Nhận xét: Có 12 thai phụ tham gia vào nghiên cứu, có thai phụ xác định người lành mang gen bệnh mang thai tuần 12 – 18 Chẩn đoán qua... x a đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15% Tùy thuộc vào kiểu vị trí đột biến gen F8 mà gây thể bệnh nặng nhẹ khác Người lành mang gen bệnh hemophilia A Người lành mang gen bệnh hemophilia A người mang. .. ối trước sinh chẩn đoán sau sinh Kết n Giới tính Chẩn đốn Thai nhi bị bệnh Nam trước sinh Thai nhi không bị bệnh Nam (n=6) Thai nhi không mang gen bệnh Nữ Chẩn đốn Có đột biến gen F8 sau sinh