Nghiên cứu chọn tạo giống hoa đồng tiền (gerbera jamesonii) bằng phương pháp đột biến kết hợp với nuôi cấy mô tế bào

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng, phát triển của các giống đồng tiền ngoài đồng ruộng .... Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý đột biến b

Trang 1

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM THỊ MAI

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG HOA ĐỒNG TIỀN (GERBERA JAMESONII) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN KẾT HỢP VỚI

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ ĐỨC THẢO

Hà Nội, 12/2015

Trang 2

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác Các số liệu chưa từng được công bố trong luận án, luận văn nào trước đây

Mọi dữ liệu trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Tác giả

Phạm Thị Mai

Trang 3

Lời cảm ơn!

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô và các cán bộ công tác tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lê Đức Thảo, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi trong quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các cán bộ, anh chị em, bạn

bè, đồng nghiệp trong Bộ môn Đột Biến và Ưu thế lai, Trại thí nghiệm Văn Giang - Hưng Yên thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Luận văn này được thực hiện bởi sự cho phép của Viện Di truyền Nông nghiệp,

Bộ môn Đột biến & Ưu thế lai và được thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ bức xạ kết hợp với công nghệ sinh học để tạo vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống hoa và giống đậu tương”, mã số KC.05.08/11-15 thuộc chương trình “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ năng lượng” của Bộ Khoa học và Công nghệ

Luận văn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2015 Tác giả

Phạm Thị Mai

Trang 4

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 3

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học của cây hoa đồng tiền 4

1.2 Yêu cầu sinh thái của cây hoa đồng tiền 6

1.3 Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới và ở Việt Nam 8

1.4 Tổng quan về phương pháp chiếu xạ gây đột biến tạo vật liệu khởi đầu trong chọn giống cây trồng 11

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu nghiên cứu 20

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.4 Nội dung nghiên cứu 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 21

2.6 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp theo dõi 25

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢNGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

Trang 5

3.1 Nghiên cứu gây đột biến bằng chiếu xạ tia Gamma trên mô sẹo giống hoa đồng

tiền in vitro 26

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các liều chiếu xạ đến khả năng tái sinh của cây hoa đồng tiền in vitro qua 5 thế hệ (M1V5) 29

3.3 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng, phát triển của cây con ngoài vườn ươm 34

3.4 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng, phát triển của các giống đồng tiền ngoài đồng ruộng 36

3.5 Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các giống hoa đồng tiền đột biến ngoài đồng ruộng 40

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

4.1 Kết luận 52

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 61

Trang 6

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

: 6 - Benzyl Amino Purin : Công thức

: Cộng sự

: Giống đồng tiền màu vàng (Gerbera Cabana) : Giống đồng tiền tím hồng (Gerbera Banesa) : Giống đồng tiền màu da cam (Gerbera Cherokee) : Giống hoa đồng tiền màu hồng (Gerbera Rosalin)

: Đối chứng : Hydro peroxide (nước ôxi già) : Gray

: Murashige and Skoogs, 1962

Trang 7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa đồng tiền 9 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chất 2,4-D tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống hoa đồng tiền (Sau

4 tuần nuôi cấy) 26

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ tia γ nguồn Co60 đến tỷ lệ sống và hình

thái của mô sẹo đồng tiền in vitro (Sau 4 tuần chiếu xạ) 27

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo các giống

đồng tiền sau 2 tháng nuôi cấy 29

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia γ nguồn Co60 đến hệ số nhân chồi và hình

thái chồi đồng tiền in vitro 30

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ tia γ nguồn Co60 tới khả năng ra rễ của

chồi đồng tiền in vitro (Sau 2 tuần nuôi cấy) 32

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ tia γ nguồn Co60 tới cây con đồng tiền ở giai đoạn vườn ươm 34

Bảng 3.7 Động thái tăng trưởng chiều cao của các giống đồng tiền ngoài đồng ruộng

36

Bảng 3.8 Động thái ra lá của các giống đồng tiền ngoài đồng ruộng 38 Bảng 3.9 Khả năng đẻ nhánh của các giống đồng tiền ngoài đồng ruộng 39 Bảng 3.10 Một số đặc điểm sinh trưởng, phát triển của giống đồng tiền đột biến ngoài

đồng ruộng 40

Bảng 3.11 Một số chỉ tiêu năng suất, chất lượng của các giống hoa đồng tiền chiếu xạ

ngoài đồng ruộng 42

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đếnkhả năng xuất hiện biến dị của các giống

đồng tiền ngoài đồng ruộng 45

Bảng 3.13 Các dòng biến dị có triển vọng thu được từ các giống đồng tiền nghiên cứu

47

Trang 8

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1.Các mô sẹo đồng tiền DT2 sau chiếu xạ 20 ngày 28

Hình 3.2 Hình thái chồi của giống đồng tiền DT2 sau 2 tuần cấy chuyển 31

Hình 3.3 Khả năng ra rễ của giống đồng tiền DT3 sau 2 tuần nuôi cấy 33

Hình 3.4 Cây con nuôi cấy mô hoàn chỉnh (giống đồng tiền DT3) 33

Hình 3.5.Cây hoa đồng tiền ngoài vườn ươm 35

Hình 3.6 Biến dị trên giống đồng tiền DT1 50

Trang 9

MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) là loại hoa xếp vị trí thứ 5 trong công nghiệp

hoa cắt cành Đây là một loại hoa đẹp, hình dáng, màu sắc phong phú đa dạng, hoa có

độ bền lâu và đặc biệt là khả năng ra hoa quanh năm, tỷ lệ hoa thương phẩm cao, kỹ thuật trồng trọt, chăm sóc đơn giản, ít tốn công Vì thế diện tích trồng hoa đồng tiền ngày càng được mở rộng, lượng tiêu thụ và giá cả ngày một tăng(Nguyễn Văn Hồng, 2009) [9]

Nhờ đặc điểm ưu việt đó, mặc dù mới du nhập vào nước ta song hoa đồng tiền

đã được người tiêu dùng rất ưa chuộng và hiện đang là loại hoa có giá trị kinh tế cao Nắm bắt được thực trạng đó rất nhiều người làm vườn đã chuyển sang trồng hoa đồng tiền và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người sản xuất

Trước đây, hoa đồng tiền chủ yếu được nhân giống bằng tách chồi(Lê Huy Hàm

và cs, 2012) [7] Phương pháp này thực hiện khá đơn giản, ít tốn kém song chất lượng cây giống ban đầu thường thấp, nhanh bị thoái hóa do nấm bệnh và virut Trong nhiều năm trở lại đây, cùng với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, với ưu điểm hệ

số nhân giống cao, chất lượng được đảm bảo nên cây giống in vitrođồng tiền đã dần

thay thế cây giống tách chồi

Trong chọn giống, lai giống nhân tạo dù có tiềm năng vô hạn trong việc tạo ra các

tổ hợp có đặc tính mới mà có thể được chọn lọc trong quần thể phân ly nhưng nó chỉ là

sự phân bổ lại và tái tổ hợp nguồn gen sẵn có(Nguyễn Minh Công, 2005) [4] Vấn đề

là sự giới hạn nguồn gen trong tự nhiên và tỷ lệ đột biến tự nhiên rất thấp, chỉ khoảng

10-7 Ngược lại, phương pháp đột biến có thể cải tiến tính trạng đơn mà không gây ra

sự tổn thương sâu trong bộ gen, đồng thời làm tăng nguồn tài nguyên di truyền cho lai giống nhân tạo và các biến dị di truyền mới có khả năng thích ứng tốt Việc sử dụng kỹ thuật đột biến trong cải tiến giống cây trồng trong những thập kỷ qua cho thấy nó là phương pháp chọn giống hiệu quả nhằm cải tiến năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu với các yếu tố sinh học và phi sinh học Bởi vậy phương pháp đột biến đang được sử dụng một cách hiệu quả trong cải tiến giống cây trồng (Trần Duy Quý, 1997) [13]

Trang 10

Đối với cây hoa, việc xử lý đột biến có nhiều thuận lợi hơn so với các loại cây lương thực do tính chất sử dụng của nó ít dẫn đến sự lo ngại về sức khoẻ của con người(Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Đức Thảo, 2007) [11] Ngoài ra, các mục tiêu của việc

xử lý đột biến trên cây hoa thường liên quan đến một số chỉ tiêu chính như màu sắc hoa, kích thước hoa, tính chống chịu,… Khi xuất hiện biến dị, nhà chọn giống có thể chọn lọc cá thể, nhân vô tính để đánh giá các dòng thu được Do đó, thời gian cho chọn giống thường ngắn hơn so với các cây trồng khác Vì vậy, có thể nói rằng, phương pháp chọn giống hoa bằng xử lý đột biến là một phương pháp đầy triển vọng trong công tác chọn tạo giống hoa mới cho sản xuất(Lê Đức Thảo, 2009) [15]

Công nghệ xử lý đột biến in vitro bằng các tác nhân vật lý đã trở thành công cụ

hữu hiệu trong chọn tạo giống cây trồng(Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2015) [1] Phương pháp này tạo ra nguồn biến dị di truyền phong phúvà hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn giống Trong số các tác nhân vật lý được sử dụng hiện nay thì tia Gamma là tác nhân thường được sử dụng rộng rãi nhất Một số đặc điểm thường được quan tâm khi chọn giống hoa, cây cảnh đột biến là: thay đổi màu sắc hoa, đặc điểm hình thái hoa, màu sắc

lá, giảm thời gian sinh trưởng, tăng cường khả năng chống chịu sâu bệnh, khắc phục những nhược điểm của giống cũ…(Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Đức Thảo, 2007) [11] Kỹ thuật chọn giống với sự hỗ trợ của đột biến cùng với công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã có đóng góp đáng kể nâng cao chất lượng giống hoa

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

chọn tạo giống hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) bằng phương pháp đột biến kết hợp với nuôi cấy mô tế bào”

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý đột biến bằng tia Gamma đến sinh trưởng,

phát triển của một số giống hoa đồng tiềntrong in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý đột biến bằng tia Gamma đến sinh trưởng, phát triển của một số giống hoa đồng tiềnở giai đoạn vườn ươm và ngoài đồng ruộng

Trang 11

- Theo dõi đánh giá khả năng xuất hiện biến dị ngoài đồng ruộng và xác định những dòng biến dị có triển vọng phục vụ cho công việc chọn tạo giống hoa đồng tiền mới

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ sống, khả năng tái sinh chồi, hệ số nhân, khả năng sinh trưởng, phát triển và khả năng xuất hiện biến dị của

cây hoa đồng tiềnin vitro sau chiếu xạ

- Đánh giá được ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây con nuôi cấy mô ở giai đoạn vườn ươm

- Đánh giá được ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến khả năng sinh trưởng, phát triển, các tính trạng nông sinh học và khả năng xuất hiện biến dị của các giống đồng tiền nghiên cứu ngoài đồng ruộng từ đó chọn lọc được những dòng biến dị triển vọng

1.4 Ý nghĩa của đề tài

Trang 12

Chương1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học của cây hoa đồng tiền

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại

Cây hoa đồng tiền có tên khoa học là Gerbera jamesonii, có nguồn gốc từ Nam Phi (http://winmastergardener.org/Gerbera)[64] Theo hệ thống học thực vật mới nhất,

cây hoa đồng tiền được phân loại như sau:

Chi đồng tiền Gerbera có khoảng 40 loài, đã được phân loại vào năm 1737 bởi

Gronovius và đặt tên theo nhà thực vật học người Đức, Traugott Gerber [64] và các

loài jamesonii được đặt theo tên của Robert Jameson (Shankar Paudel, 2014) [52]

Năm 1889, đồng tiền được Hooker miêu tả lần đầu tiên trong tạp chí tư vấn Curtis dưới tên gọi cúc Transrace hay cúc Barbetan (Shankar Paudel, 2014) [52] Hiện nay trên thế giới có hàng trăm giống khác nhau với các hình dạng và kích thước hoa, màu sắc hoa và nhị hoa rất đa dạng

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoađồng tiền

Cây hoa đồng tiền thuộc cây thân thảo, nhiều năm(Lê Huy Hàm và cs, 2012) [7], có những đặc điểm thực vật sau:

- Rễ: Rễ đồng tiền thuộc dạng rễ chùm, phát triển khoẻ, rễ hình ống, ăn ngang

và nổi phía trên mặt luống, rễ thường vươn dài tương ứng với diện tích lá toả ra

- Thân: Thân ngầm, có lông, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh Lá và hoa phát triển từ thân, chiều dài thân từ 25 - 40 cm, một số giống từ 60 - 65 cm

Trang 13

- Lá: Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15 - 450, hình dạng lá thay đổi theo giống và sự sinh trưởng từ dạng trứng thuôn đến thuôn dài, lá dài từ 15- 25 cm, rộng 5-

8 cm hình xẻ thùy rộng và sâu, mặt dưới lá có lớp lông nhung, đôi khi hẹp hơn ở gốc

và rộng hơn ở đỉnh

- Hoa: Hoa đồng tiền có dạng cụm, hoa đầu lớn, cụm hoa dạng đầu, bề ngoài là một bông hoa nhưng trên thực tế là một tập hợp nhiều bông hoa nhỏ riêng biệt Phía ngoài hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc xếp thành một hoặc vài vòng Do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên tâm hoa rất được chú ý trong chọn tạo giống mới Hoa đồng tiền nở theo thứ tự từ ngoài vào trong, hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình tia nở sau theo từng vòng một, kích thước từ 5 - 12 cm

- Quả: Quả đồng tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, một gam hạt có khoảng 280 - 300 hạt Do vậy sức sống và điều kiện nảy mầm là khó khăn Tuy nhiên cây có khả năng đẻ nhánh rất cao

Hoa đồng tiền có khoảng 40 loài thuộc loại hoa lưu niên ra hoa quanh năm, độ bền hoa cắt cao, được coi là 1 loài hoa đẹp trong thế giới hoa Dựa vào hình thái hoa, người ta chia thành 3 nhóm: Hoa kép, hoa đơn và hoa đơn nhị kép (Đặng Văn Đông vàĐinh Thế Lộc, 2003) [5]

Nhóm 1 - Đồng tiền đơn: Hoa chỉ có một hoặc 2 tầng cánh, xếp xen kẽ nhau tạo vòng tròn Hoa mỏng và yếu hơn hoa kép, màu sắc hoa ít hơn, điển hình là trắng,

đỏ, tím, hồng

Nhóm 2 - Hoa đồng tiền kép: Cánh hoa to gồm hơn 2 tầng, bông to, đường kính

có thể đạt tới 12 - 15 cm, cánh hoa tụ lại thành bông nằm ở đầu trục chính, cuống dài

40 - 60 cm Màu sắc đa dạng như trắng, đỏ, vàng, hồng, gạch cua

Nhóm 3 - Hoa đơn nhị kép: Bên ngoài cùng cánh đơn, bên trong cánh kép dày đặc, thường màu trắng trong lớp cánh kép màu cánh sen nhưng nhóm này không đẹp bằng hoa kép

Như vậy, trong ba nhóm hoa trên, đồng tiền kép là nhóm hoa có giá trị cao, được ưa chuộng hơn cả và cũng là đối tượng lý tưởng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trang 14

1.2 Yêu cầu sinh thái của cây hoa đồng tiền

1.2.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng hoa đồng tiền Đa số các giống đồng tiền hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ (Lê Huy Hàm và cs, 2012) [7], tốt nhất từ 18-25oC, nhiệt độ lý tưởng

để cây ra hoa là 22oC Cây có thể chịu được nhiệt độ từ 13-32oC, dưới 12oC hoặc trên

35oC, cây sẽ phát triển kém, hoa nhỏ, màu sắc hoa nhợt nhạt dẫn đến chất lượng hoa kém

1.2.2 Ánh sáng

Hoa đồng tiền yêu cầu ánh sáng cao cho sinh trưởng, phát triển và phát triển mầm hoa, chúng có thể ra hoa cả mùa hè và mùa đông, nhưng số lượng lớn nhất tập trung vào mùa xuân Mùa hè nắng nóng thường dùng lưới đen để điều khiển cường độ ánh sáng và bức xạ mặt trời Mùa đông phải đảm bảo cường độ ánh sáng 40 W/m2

là cần thiết giúp cho cây sinh trưởng tốt (Lê Huy Hàm và cs, 2012) [7].Đồng tiền chỉ phản ứng rất nhẹ với quang chu kỳ, ngày ngắn ra hoa nhanh, ngày dài ra hoa chậm (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003) [5]

1.2.4 Đất

Hoa đồng tiền không đòi hỏi khắt khe về đất, chúng thích hợp với đất tơi xốp, nhiều mùn, độ pH từ 6 - 6,5 Đất thịt pha cát, ở vùng đất kiềm cần bón phân mang tính chua để cải tạo Cũng có thể bón phân chứa lưu huỳnh để giảm độ pH Ở vùng đất

Trang 15

chua có thể bón thêm vôi để điều tiết độ chua, ở nơi đất thịt nặng nên bón thêm lá cây mục, vỏ trấu, bã rượu để tăng độ tơi xốp

Đất trồng hoa đồng tiền cần thoát nước tốt, mực nước ngầm thấp và ổn định Mực nước ngầm cao thường đọng nước, rễ cây dễ bị thối và bị bệnh nên phải có hệ thống thoát nước tốt, xung quanh phải đào rãnh thoát nước sâu từ 0,7 - 1,0 m và lên luống cao, hết sức tránh trồng đồng tiền nơi đất trũng (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003; Lê Huy Hàm và cs, 2012) [5] [7]

- Phân vô cơ: Đạm, lân, kali, canxi là những yếu tố không thể thiếu đối với cây đồng tiền

+ Đạm có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trưởng, phát triển của cây Đồng tiền cần nhiều đạm vào giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, lượng đạm nguyên chất sử dụng cho 1 ha đồng tiền từ 140 - 160 kg/năm

+ Lân giúp cho bộ rễ sinh trưởng, phát triển mạnh, cây con khỏe, tỷ lệ sống cao, thân cứng, hoa bền, màu sắc đẹp Trong quá trình sinh trưởng của cây, đồng tiền cần lần nhiều hơn vào giai đoạn sinh trưởng sinh thực, nhưng do lân phân giải chậm nên chủ yếu dùng để bón lót 3/4 còn 1/4 bón thúc cùng đạm, kali hoặc ngâm với phân hữu

cơ Lượng lân nguyên chất dùng cho 1 ha từ 300 - 350 kg/năm Tùy từng loại đất mà

sử dụng các loại lân khác nhau: với đất trung tính nhiều mùn thì dùng supe lân, đất chua nên dùng phân lân nung chảy, đất chua mặn dùng apatit

+ Kali rất cần thiết vào thời kỳ kết nụ và nở hoa Nếu thiếu kali đầu chóp lá già, bắt đầu vàng chết khô, sau đó cả phần thịt lá giữa các gân lá cũng vậy, đồng thời xuất

Trang 16

hiện các đốm bị luộc, cuống hoa mềm ra không đứng lên được, màu sắc hoa nhợt nhạt, cánh mềm, hoa chóng tàn Kali giúp cây tăng cường tính chống chịu với điều kiện khắc nghiệt và sâu bệnh Lượng kali nguyên chất cho 1 ha từ 120 - 140 kg/năm, trong

đó bón lót 2/3 còn lại 1/3 dùng để bón thúc cùng đạm và lân

+ Canxi giúp đồng tiền tăng khả năng chịu nhiệt, hạn chế được tác dụng độc của axit hữu cơ Ngoài ra canxi còn có tác dụng giảm chua, tăng độ phì của đất tạo điều kiện cho đồng tiền phát triển tốt hơn Canxi được dùng ở dạng vôi bột, tùy theo từng loại đất mà sử dụng liều lượng khác nhau Thông thường, lượng vôi bột cần cho 1

ha là 250 - 300 kg

Ngoài các yếu tố đa lượng trên, một số nguyên tố vi lượng như: Mg, Fe, Cu, Na,… cũng rất cần cho đồng tiền, chúng được bổ sung bằng phân hữu cơ hoặc phân vi sinh có chứa vi lượng

1.3 Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới

Hoa đồng tiền là một trong 10 loại hoa quan trọng nhất trên thế giới sau hồng, cúc, lan, cẩm chướng, lay ơn (Nazma Akter và cs, 2012) [46] Các nước có sản lượng hoa lớn là Hà Lan, Colombia, Pháp, Trung Quốc Ở các nước này đồng tiền được trồng ở nhà lưới có mái che, có trang bị hệ thống điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, nước tưới, bón phân bằng chế độ tự động hoặc bán tự động Do đó, năng suất và chất lượng hoa đồng tiền của nước này rất cao, đạt 4,8 triệu bông/ha/năm (Đào Thị Thanh Bằng và cs, 2007) [2]

Theo thống kê năm 2009, diện tích trồng hoa đồng tiền ở Hà Lan là hơn 10.000

ha, đạt giá trị sản lượngtrên5 triệu USD Hầu hết các giống hoa đồng tiền tại Hà Lan là những giống hoa lai, hoa to, được những nhà chọn tạo giống của Hà Lan tạo ra, trong

đó công ty Florist của Hà Lan là một cơ sở quan trọng về nghiên cứu, buôn bán và sản xuất hoa đồng tiền của thế giới

Diện tích trồng hoađồng tiền trên thế giới hiện nay là 305.105 ha, trong đó tổng diện tích ở châu Âu là 44.444 ha, Bắc Mỹ 22.388 ha, Châu Á và Thái Bình Dương 215.386 ha, giữa Đông và Phi 2.282 ha và miền Trung và Nam châu Phi 17.605 ha, Ấn

Trang 17

Độ có diện tích trồng hoa lớn nhất (88.600 ha) tiếp theo là Trung Quốc (59.527 ha), Indonesia (34.000 ha), Nhật Bản (21.218 ha), Hoa Kỳ (16.400 ha), Brazil (10.285 ha), Đài Loan (9,661 ha), Hà Lan (8017 ha), Italy (7,654 ha), Anh (6.804 ha), Đức (6621 ha) và Colombia (4757 ha) và diện tích đang tăng đều đặn (Dr.S.Sudhagar M.Com và

cs, 2013) [53] Việc sản xuất các loại hoa này tăng lên đáng kể do nhu cầu rất lớn đối với các sản phẩm hoa cắt trên thế giới Việc tiêu thụ thế giới của hoa cắt cành và cây trồng ngày càng tăng và tăng ổn định hàng năm từ 10 đến 15% trong tất cả các nước nhập khẩu (Nguyễn Văn Hồng, 2009)[9]

Tại Nepal, theo báo cáo của FAN (Food and Agricuture in Nepal), diện tích trồng hoa đồng tiền năm 2012 - 2013 là 87 ha, cao gần gấp đôi so với năm 2011 - 2012 (45 ha), trong khi đó chỉ có 15 ha trong năm 2005 - 2006 (Bảng 2.1) Số liệu này cho thấy diện tích trồng hoa đồng tiền không ngừng tăng lên trong những năm gần đây, diện tích trồng năm 2012 - 2013 gần gấp đôi so với diện tích trồng hoa đồng tiền năm

1.3.2 Tình hình sản xuất hoa đồng tiền ở Việt Nam

Hoa đồng tiền là 1 trong 10 loại hoa quan trọng nhất trên thế giới, sau hồng, cúc, lan, cẩm chướng, lay ơn Trong các loại hoa đồng tiền đã và đang được trồng ở

Trang 18

Việt Nam thì hoa đồng tiền kép nhập nội là một trong những cây cho hiệu quả kinh tế cao nhất Từ một sàu hoa đồng tiền giống mới chăm sóc đúng kĩ thuật có thể cho thu nhập gần 50 triệu/sào/năm (Nguyễn Văn Hồng, 2009) [9]

Ở Việt Nam, giống hoa đồng tiền đơn được nhập về trồng đầu tiên khoảng từ những năm 1940 Đặc điểm của giống này là cây sinh trưởng khỏe, thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên Tuy nhiên có một số nhược điểm là cánh đơn, hoa nhỏ, màu sắc đơn điệu nên hiện nay chúng ít được trồng Từ những năm 1990, một vài công ty và những nhà trồng hoa Việt Nam bắt đầu nhập các giống đồng tiền lai (hoa kép) từ một

số nước như: Trung quốc, Đài Loan, Hà Lan Ưu điểm của các hoa này là hoa to, cánh dày, màu sắc phong phú, hình dáng hoa cân đối, và năng suất cao Vì vậy, các giống này được tiếp nhận nhanh chóng và phát triển rộng rãi Bên cạnh đó cũng có không ít giống hoa đồng tiền do không thích hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam, cây sinh trưởng, phát triển kém, sâu bệnh phá hại nặng, gây thiệt hại cho người trồng hoa (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2003) [Error! Unknown switch argument.]

Hoa đồng tiền được trồng khá phổ biến tại Đà Lạt trước những năm 1975 với mục đích cắt cành, có nhiều màu khác nhau (vàng, đỏ, cam ), đến năm 1980 có nhập thêm một số giống kép ở Hà Nội Từ 1997 đã nhập nội hơn 20 giống của Hà Lan, Hàn Quốc, Đài Loan Trong đó giống của Hà Lan cho chất lượng cao nhất với nhiều màu sắc khác nhau

Ở Lâm Đồng, sản xuất mở rộng nhanh chóng, gia tăng hàng chục lần về quy

mô, chỉ trong vài năm do nhu cầu gia tăng của thị trường tiêu dùng Diện tích hoa tăng

từ khoảng 60 ha những năm đầu 1990 lên 750 ha năm 2003 và trên 3.200 ha gieo trồng vào năm 2009, trong đó riêng thành phố Đà Lạt đã chiếm hơn 60% diện tích gieo trồng của cả tỉnh Trình độ sản xuất cũng không ngừng được đổi mới, cải thiện nhờ sự bùng

nổ ứng dụng giống mới, tiến bộ kỹthuật và công nghệ sản xuất tiên tiến (Phạm Xuân Tùng, 2009) [18]

Với sự gia tăng về số lượng của chủng giống hoa đồng tiền thì diện tích đất trồng hoa đồng tiền của nước ta cũng tăng rất nhanh Năm 2005, trong tổng số diện thích trồng hoa của cả nước thì cây đồng tiền chiếm 9% tăng 1,8 lần so với năm 1995

và tăng gấp 1,3 lần so với năm 2000 (Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Đức Thảo, 2007) [11]

Trang 19

Hiện nay ở Việt Nam, có khoảng hơn 30 giống hoa đồng tiến khác nhau đang được trồng ngoài sản xuất [66], các giống này có nguồn gốc từ Hà Lan, Trung Quốc, màu sắc phong phú, đa dạng Hoa được trồng chủ yếu ở Đà Lạt và các nơi có khí hậu mát mẻ

Tại vùng Trung du và miền núi phía Bắc diện tích hoa của toàn vùng có 135,7

ha Trong đó, cây đồng tiền có 9,7 ha chiếm khoảng 0,07% trong cơ cấu tổng diện tích Sản lượng hoa của vùng đạt 44,08 triệu bông, trong đó sản lượng hoa đồng tiền đạt 3,1 triệu bông(Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Đức Thảo, 2007) [11]

Do trồng hoa đồng tiền mang lại thu nhập rất cao nên nhiều năm qua, nhiều địa phương, hộ gia đình đã tự tìm hiểu để phát triển, trồng loại hoa này Điển hình các vùng trồng hoa đồng tiền tập trung có quy mô lớn từ vài chục ha là Đà Lạt (Lâm Đồng), Vĩnh Tuy (Hà Nội), Bắc Ninh, Bắc Giang

1.4.Tổng quan về phương pháp chiếu xạ gây đột biến tạo vật liệu khởi đầu trong chọn giống cây trồng

Mỗi một kiểu gen nhất định của một giống chỉ cho một năng suất nhất định Trong điều kiện nuôi trồng tối ưu thì thì mỗi giống chỉ cho một năng suất tối đa nhất định (mức trần về năng suất của giống) Để thu được năng cao hơn thì phải thay đổi vật chất di truyền của giống do đó ta sử dụng các tác nhân vật lí, hóa học tác động vào

bộ máy di truyền để gây đột biến (Nguyễn Minh Công, 2005) [4]

1.4.1 Quy trình tạo giống mới bằng phương pháp gây đột biến

- Xử lí mẫu vật bằng tác nhân gây đột biến: Để đột biến có hiệu quả cao, cần lựa chọn tác nhân gây đột biến thích hợp, tìm hiểu thời gian và liều lượng phù hợp Nếu xử lí không đúng tác nhân, liều lượng hoặc thời gian có thể làm chết sinh vật, hoặc giảm khả năng sinh sản, giảm khả năng sống

- Chọn lọc thể đột biến có kiểu hình mong muốn: Dựa trên các đặc điểm kiểu hình được biểu hiện để lựa chọn các dạng đột biến phù hợp nhu cầu của con người

- Tạo dòng thuần chủng: Sau khi nhận được các thể đột biến mong muốn, cho chúng sinh sản để nhân lên thành dòng thuần chủng theo đột biến được tạo ra

Hiệu quả gây đột biến bằng sử dụng các tia phóng xạ phụ thuộc vào:

Trang 20

+ Loại tác nhân

+ Liều lượng xử lý

+ Tính chất sinh lý của cây trồng, tuổi và bộ phận của cây trồng

+ Điều kiện ngoại cảnh khi xử lý

Trong công tác giống cây trồng, các tia được chiếu xạ lên hạt khô, hạt phấn, hạt đang nảy mầm, chồi, cành, thân để gây đột biến (Tamikazu Kume và cs, 2000) [56]

1.4.2 Xử lý đột biến trong nuôi cấy invitro phục vụ chọn tạo giống

Thuật ngữ “Biến dị dòng soma” lần đầu tiên được Larkin và Scowcroft (1981)

mô tả (A.Hoque và cs, 1995) [39] Biến dị này liên quan đến những thay đổi về mặt di truyền xảy ra ở cây được tái tạo thông qua nuôi cấy mô tế bào thực vật Tuy nhiên, tần

số và phổ biến dị tự phát là rất thấp, chưa kể đến một số biến dị có lợi lại liên kết với những đặc tính gây hại cho cây Trong những năm gần đây, việc phát triển phương

pháp mới - xử lý đột biến trong nuôi cấy in vitro đã mở ra triển vọng lớn trong cải tạo

giống cây trồng Nhờ đó, tần số và phổ biến dị dòng soma đã được tăng lên đáng kể

Một trong những ưu điểm nữa của gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro là khả năng

tạo đột biến ở giai đoạn sớm của quá trình hình thành và phát triển cá thể (phôi non hoặc mô sẹo) Nhờ vậy, tần số đột biến cao và khả năng thu nhận những thể đột biến

đồng nhất về kiểu gen trở nên dễ dàng hơn Nuôi cấy in vitro không những là công cụ

hữu hiệu để lưu giữ, duy trì và nhân những thể đột biến lạ, quý hiếm mà còn là phương pháp phân lập và làm thuần những dòng đột biến có hiệu quả Trong nhiều trường hợp,

nuôi cấy in vitro là cách có hiệu quả nhất để duy trì và bảo quản những biến dị di

truyền, đặc biệt là những thể đột biến khảm, nhờ đó khắc phục được sự đào thải của những tế bào quý hiếm do tính cạnh tranh trong mô

1.4.3 Một số kết quả nghiên cứu về sử dụng chiếu xạ gây đột biến tạo vật liệu khởi đầu trong chọn giống hoa

1.4.3.1 Các kết quả nghiên cứu trên thế giới

Đối với chọn tạo cây hoa, đột biến là biện pháp có hiệu quả cao để tăng cường nguồn biến dị di truyền và hỗ trợ đắc lực trong chọn giống Cho đến nay, có hàng nghìn

Trang 21

giống hoa, cây cảnh đột biến được chính thức công nhận trên thế giới Một số đặc điểm thường được quan tâm khi chọn giống hoa, cây cảnh đột biến là: Thay đổi màu sắc hoa, đặc điểm hình thái hoa, màu sắc lá, giảm thời gian sinh trưởng,… Trong số các tác nhân đột biến, tia Gamma thường được sử dụng và được nghiên cứu từ rất sớm

Jerzy và cs (2000) đã thí nghiệm chiếu xạ tia Gamma trên giống Cẩm chướng Mini Pinky nuôi cấy mô trong môi trường MS bổ sung 0,02mg BA/l + 1,75 mg IAA/l

ở các cường độ chiếu xạ từ 0,5 - 3 krad cho thấy khả năng tái sinh chồi và ra rễ từ 1-3 krad giảm theo cường độ chiếu xạ, nhất là ở 3 krad[35]

Theo Datta (2001) chồi của 9 giống hoa hồng được xử lý tia Gamma (3-4 krad),

sau đó các chồi này được ghép lên gốc ghép (giống Rosa indoca var Odorata) Giống

Orange Sesnation là giống mẫn cảm nhất với tia Gamma, giống Kiss of Fire là giống ít mẫn cảm nhất Kết quả là đã quan sát thấy sự giảm chiều cao cây (trong đó giống Kiss

of Fire giảm ít nhất, giống Zambra giảm nhiều nhất) và đột biến soma về màu hoa ở tất

cả các giống (trừ giống Happiness)[27]

Paramesh T H và cs (2005) chiếu xạ chồi cẩm chướng nuôi cấy mô ở các liều lượng 2, 4, 6 và 8 krad Cắt lá của chồi theo chiều ngang và nuôi cấy trong môi trường

MS bổ sung (1) 1,0 mg thidiazuron (TDZ) + 0,1 mg/l NAA (M5) và (2) 0,3 mg TDZ + 1,0 mg BAP + 0,1 mg/l NAA (M6) Hàng tuần theo dõi tỷ lệ sống, hình thành mô sẹo, tái sinh chồi, diện tích mẩu lá Kết quả cho thấy ở liều chiếu 4 krad là liều tốt nhất để xuất hiện các biến dị Tỷ lệ sống giảm dần khi liều chiếu tăng lên Môi trường M6 cho khả năng tái sinh tốt hơn[50]

Gần đây, công nghệ chùm ion (Hib) đã thu hút sự quan tâm ngày càng tăng trong chọn giống hoa bằng đột biến Kỹ thuật chọn giống đột biến đã được ứng dụng trên một số cây hoa chính như cúc, lan, hồng, cẩm chướng Chọn giống với sự hỗ trợ của đột biến cùng với công nghệ sinh học (MAB) đã có đóng góp đáng kể nâng cao chất lượng giống hoa và mang lại những lợi ích kinh tế-xã hội cho các nước đang phát triển Điển hình là thành công về đột biến trong chọn giống hoa cây cảnh ở các nước Thái Lan, Malaysia và Indonesia (Jain, 2006) [34]

Hiệu quả của việc chiếu xạ chùm ion (công nghệ chùm lượng tử) đã thu được các dạng đột biến hoa ở cây cẩm chướng Các mẩu lá của giống Vital được chiếu bằng

Trang 22

nguồn ion carbon và nuôi cấy đến khi chồi tái sinh xuất hiện Phổ đột biến thu được từ chiếu xạ ion carbon lớn hơn chiếu xạ tia Gamma Năm 2002, một số giống cẩm chướng mới thu được từ chiếu xạ ion đã được phát triển và thương mại hoá ở châu Âu

và Nhật Bản Một phương pháp khác cũng được ứng dụng là chiếu xạ sâu tia Gamma

Từ giống cẩm chướng Star, người ta đã thu được đột biến màu vàng qua việc dùng cả chiếu xạ chùm ion và chiếu xạ sâu tia Gamma (Okamura và cs, 2006) [49]

Theo báo cáo của H.Nakagawa (2008) Nhật Bản đã tạo ra tổng số 50 giống hoa cúc, 10 giống hoa hồng mới bằng các tác nhân vật lý Trong đó, chiếu xạ bằng tia Gamma là 32 giống hoa cúc và 7 giống hoa hồng Tỷ lệ giống cây trồng mới tạo ra bằng gây đột biến chiếu xạ tia Gamma chiếm 60,3% trên tổng số giống cây trồng đột biến[44]

Kelly Marie Oates và cs (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các liều chiếu xạ

tia Gamma đến sự sống sót và sinh trưởng của cây hoa Rudbeckia spp (thuộc họ hoa hướng dương)in vitro và ex vitro Các mô sẹo được chiếu xạ ở các liều chiếu 0, 5, 10,

20 và 40 Gy Kết quả cho thấy giai đoạn đầu mô sẹo không bị ảnh hưởng bởi các liều chiếu xạ, sau 2 tháng chiếu xạ thì khả năng sống sót của mô sẹo giảm đáng kể khi tăng liều chiếu Các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao cây, đường kính thân, số lượng hoa, đường kính hoa, tỷ lệ sống và khả năng nở hoa đều giảm khi liều chiếu tăng lên Ở liều chiếu 20 Gy quan sát thấy có xuất hiện một số tính trạng khác như thay đổi đường kính nhị, hình thái nhị và màu sắc của nhị hoa, cách sắp xếp các cánh hoa không đều[36]

Kết quả nghiên cứu nổi bật về phương pháp chiếu xạ trong tạo giống hoa củaWipaporn Sawangmee, Thunya Taychasinpitak (2011) là sự kết hợp giữa chiếu xạ tia Gamma nguồn Co60 với tia Gamma nguồn Cs137 đã tạo ra sự đột biến màu sắc hoa

từ tím sang vàng trên cây Torenia lai (Linderniaceae) Tia Gamma nguồn Co60 được sử dụng ở các liều chiếu 0, 50, 70, 90, 110 Gy và tia Gamma nguồn Cs137 được sử dụng ở các liều 0, 50, 100, 150 và 200 Gy[60]

Sự tác động của các liều chiếu xạ trên đối tượng cây hoa lily của Xi M và cộng sự (2012) ở các liều chiếu 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 Gy đã cho thấy các liều chiếu tăng lên thì khả

năng sống và khả năng ra hoa của lily (Lilium longiflorum) giảm Trong đó liều chiếu 1,0

Gy làm giảm tỷ lệ sống xuống còn 53,33% và tần số đột biến là 39,27%[61]

Trang 23

Một nghiên cứu gần đây gây đột biến bằng phương pháp chiếu xạ tia Gamma kết hợp với hóa chất EMS cũng tác động gây biến đổi màu sắc hoa, hình thái hoa, quả,

hạt nhưng không phải trên cây hoa mà ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata L Walp)

được thực hiện bởi nhóm tác giả Girija M của Đại học Annamalai, Tamil Nadu, Ấn Độ (Girija M, 2013) Nghiên cứu được thực hiện chiếu xạ tia Gamma ở các liều lượng 20,

25, 30 krad và xử lý hóa chất ethyl methane sulphonate (EMS) ở các nồng độ 20, 25,

30 mM lên hạt giống đậu đũa, so sánh với đối chứng không xử lý Sau đó tiến hành cho tự thụ phấn qua 5 thế hệ để quan sát hình thái khác nhau ở thể hệ M6 Tiến hành

cô lập các đột biến thu nhận được Kết quả cho thấy tần số đột biến cao nhất cho hoa màu và hạt là ở liều lượng 25 krad và nồng độ 25mM EMS [33]

Qua nghiên cứu phân tích mối liên hệ di truyền của giống hoa cúc tạo ra bằng gây đột biến chiếu xạ tia Gamma từ giống hoa cúc gốc ban đầu, nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc đứng đầu là Eun-Jeong Kang và các cộng sự (2013) đã sử dụng chỉ thị phân

tử AFLP để phân tích các đột biến tạo ra từ chiếu xạ ở các liều 0, 30, 50, 70 và 100

Gy Kết quả đánh giá cho thấy ở liều 30 Gy có nhiều kiểu gen đa dạng và khác với giống gốc nhất[32]

Các nghiên cứu ở cây hoa đồng tiền:

Tác giả KaushalK., Nath A.K (1996) đã tìm ra liều chiếu xạ gây đột biến mô sẹo tái sinh từ mô lá trên môi trường BAP 0,5 mg/l và NAA 0,75 mg/l là 0,5; 1; 3; 5 krad Còn ở chồi đồng tiền là 0,5 krad và kết quả đã tìm ra được 7 dạng đột biến khác

nhau trong giai đoạn in vitro về màu sắc, thân, lá, hoa

Tác giả LaneriU., FaconiR., Altavista P (2000) đã nghiên cứu xử lí gây đột biến chồi đồng tiền (giống hoa đồng tiền màu hồng) ở liều xử lí 2 krad (0,98 krad/h) Sau đó nhân các cây sống sót sau 2 lần cấy chuyển Sau khi hình thành rễ, cây con được trồng trong nhà kính và được phân tích Đã thu được 15% sự đa dạng sau trồng trong nhà kính về số lượng hoa, chiều dài và chiều rộng cánh hoa

Tác giả Xiao - Shan Shen và cộng sự (2004) người Trung Quốc đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến chồi đồng tiềntrong các môi trường nuôi cấy M1, M2, M3 (là các môi trường tái sinh mô sẹo, môi trường tái sinh chồi và môi trường tạo rễ)

trong in vitro Vật liệu sử dụng để chiếu xạ là mô sẹođồng tiền, kết quả đã tìm ra được

Trang 24

liều chiếu xạ gây chết mô sẹođồng tiền là từ 8 - 9 krad và liều chiếu xạ có hiệu quả gây đột biến là 5-6 krad

Năm 2011, Sanatsujat Singh và cộng sự ở Viện Công nghệ Himalayan Bioresource đã tiến hành nghiên cứu sự biểu hiện hình thái của nhị hoa đồng tiền trắng bằng phương pháp gây đột biến chiếu xạ tia Gamma ở các liều lượng từ 1 - 5 krad Kết quả cho thấy có sự gia tăng về số lượng và cách sắp xếp các bó mạch trong mô phân sinh nụ hoa đồng tiền gây lên sự biến dạng và bất đối xứng ở đầu hoa[51]

Năm 2012, Nor A Hasbullah và các cộng sựđã nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ

tia Gamma đối với sự sinh trưởng của cây hoa đồng tiềnGerbera jamesoniiin vitro ở giai

đoạn mô sẹo, sự hình thành chồi và cây con Các tác giả đã tiến hành vào mẫu hạt cây hoa đồng tiền trên môi trường MS + 30 g/l đường sucrose + 8,0 g/l agar, pH môi trường là 5,8 Hạt giống nảy mầm trong ống nghiệm sau 6 - 7 ngày nuôi cấy và tạo cây hoàn chỉnh sau 6 -

8 tuần Sau đó các cây in vitro được chiếu xạ ở các liều chiếu 10, 20, 30, 40, 50 và 60 Gy,

tốc độ chiếu xạ là 0,204 Gy/giây.Cây sau khi chiếu xạ được cấy duy trì trong môi trường

MS có bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA Kết quả thu được sau 8 tuần là số chồi tái sinh ở các cây chiếu xạ giảm so với cây đối chứng Ở liều 20 Gy số chồi tái sinh giảm xuống từ 7,5± 0,4 (đối chứng) xuống còn 6,6 ± 0,9; chiều cao cây và trọng lượng tươi của

mô sẹo cũng giảm xuống chỉ còn 76,4 ± 2,2% so với đối chứng là 89,7 ± 0,5% Ở các liều

từ 30, 40, 50 và 60 Gy đều quan sát thấy xuất hiện những bất thường trong các chồi cây được hình thành [47]

1.4.3.2 Các kết quả nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, lĩnh vực ứng dụng đột biến thực nghiệm trong chọn tạo giống cây trồng đã được tác giả Lương Đình Của khởi xướng từ những năm 1960 Nhưng đến những năm 1980, hướng nghiên cứu này mới được phát triển tương đối có hệ thống và định hướng Sau đó, là một loạt nghiên cứu của các tác giả như: Trần Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Trần Đình Long, Nguyễn Minh Công, Mai Quang Vinh, Trần Tú Ngà, Trần Minh Nam, Lê Duy Thành, trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như: lúa, ngô, đậu, lạc, táo, cà chua, dưa hấu, (Đào Thanh Bằng và cs, 2006) [2]

Trong những năm qua, nhờ áp dụng các kỹ thuật gây đột biến nhân tạo như: chiếu xạ hạt giống trước khi gieo, chiếu xạ hạt, củ, quả khi bảo quản,… các nhà chọn

Trang 25

giống trong nước đã thu được những thành tựu đáng kể, tạo ra hàng chục giống lúa, ngô, cà chua, đậu tương…, góp phần làm tăng năng suất, phẩm chất và sản lượng lương thực hàng năm

Cây hoa là đối tượng mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây, những kết quả ứng dụng đột biến trong chọn tạo giống còn rất mới mẻ

Năm 2002, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống cúc bằng việc gây đột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia Gamma (Co60) trên chồi in vitro Tác giả cho rằng tia Gamma (Co60) đã gây ảnh

hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây hoa cúc in vitro, ảnh hưởng đến

hình thái và gây hiện tượng bạch tạng, dị dạng thân, lá [11]

Năm 2005, Đào Thanh Bằng và các cộng sự thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp

đã công bố kết quả chọn giống hoa cúc bằng chiếu xạ in vitro và đã thu được nhiều

màu sắc hoa khác nhau, dạng hoa khác nhau, dạng hoa khác nhau Vật liệu đem chiếu

xạ là khối mô sẹo của giống hoa cúc màu trắng CN43, các tác giả đã sử dụng dải liều lượng chiếu xạ từ 1,0 đến 15 kard Kết quả thu được cho thấy liều lượng gây chết 50%

về khả năng tái sinh chồi là từ 5,0 krad và thu được 3 thể đột biến màu hoa (màu vàng, màu hồng và màu chóp cánh hoa màu xanh) [3]

Năm 2007, Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Đức Thảo đã dùng phương pháp chiếu xạ đột biến trên các giống hoa Cúc CN93, CN98, CN43 và thu được 4 dòng có triển vọng Đồng thời, Viện Di truyền Nông nghiệp cũng đang tiến hành xử lý chiếu xạ bằng tia X với liều lượng 2 - 10 krad cho các cành hồng giâm và hoa đồng tiền được

xử lý bằng hóa chất EMS nồng độ 0,25 - 0,5%, một số dòng có triển vọng đang được tiến hành theo dõi và nhân thử nghiệm[11]

Năm 2008, Nguyễn Mai Thơm dùng phương pháp chiếu xạ gây đột biến trên 2 giống hoa hồng địa phương và 3 giống nhập nội, đã thu được những biến dị di truyền

ổn định về hình thái hoa và đề xuất 2 mẫu giống có triển vọng cho sản xuất[17]

Năm 2009, Lê Đức Thảo chiếu xạ tia Gamma trên cành giâm và chối cẩm

chướng in vitro từ 0,5 - 7,0 krad đã thu được nhiều biến dị có lợi và chọn lọc được

dòng SP25-1 và một số dòng cẩm chướng có triển vọng[15]

Trang 26

Hoàng Thị Nga và các cộng sự (2009) - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

cũng đã sử dụng phương pháp gây đột biến in vitro bằng chiếu xạ tia Gamma nguồn

Co60 trên các giống hoa đồng tiền Đỏ nhị nâu, Gạch nhị nâu và Trắng nhị nâu ở các liều chiếu xạ 0, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 krad Kết quả cho thấy: liều chiếu xạ từ 6- 10 krad là ngưỡng gây chết, liều chiếu xạ từ 3- 5 krad xuất hiện 5 dạng biến dị hình thái chồi tái sinh từ mô sẹo Sự duy trì các dạng biến dị qua các lần cấy chuyển có sự khác nhau, khả năng duy trì từ 59,14% - 100% qua 4 lần cấy chuyển vàtừ các dạng đột biến thu được đem trồng ngoài đồng ruộng cũng đã thu được 2 dạng đồng tiền mới có màu sắc

và cấu trúc khác với đối chứng[10]

Tác giả Nguyễn Xuân Viết (2010) nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cho chọn giống hoa cúc bằng kết hợp chiếu xạ tia Gamma (Co60) và nhân chồi in vitrođã thu

được một số biến dị có lợi cho công tác giống[20]

Công trình mới được công bố gần đây của Nguyễn Thị Lý Anh, Đào Thị Thanh

Bằng và cộng sự (2015) về ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống

hoa cẩm chướng và hoa cúc Các tác giả đã sử dụng tác nhân hóa học là hóa chất EMS

ở các nồng độ 0 - 1% xử lý trên đoạn thân mang mắt ngủ của giống hoa cẩm chướng Trắng viền tím và tác nhân vật lý là tia Gamma nguồn Co60 ở các liều 1, 2, 3, 5, 7 krad chiếu trên mô sẹo của giống hoa cúc Vàng pha lê và Tím Đài Loan Kết quả đã thu được hai giống hoa cẩm chướng mới là Hồng Ngọc, Hồng Hạc và hai giống cúc mới là VCM-2 và VCM-3[1]

Lê Đức Thảo và cs (2015) cũng tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống hoa cúc

bằng phương pháp chiếu xạ in vitro trên 4 giống cúc được công nhận sản xuất thử do

Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo, đó là: CN93, CN01, CN98 và CN20 Kết quả thu được 110 dòng mang biến dị có ý nghĩa ở thế hệ M1V5, trong đó 102 dòng vẫn duy trì được các tính trạng như chọn lọc và chọn được 13 dòng biến dị triển vọng Các biến dị xuất hiện chủ yếu ở các liều chiếu 20 Gy và 30 Gy, một số ít ở 5 Gy với các đặc điểm như: Đường kính thân và đường kính hoa lớn hơn, rút ngắn thời gian sinh trưởng, góc lá nhỏ, số hoa/bông nhiều và màu sắc hoa thay đổi [16]

Hiện nay, Viện Di truyền Nông nghiệp đang tiến hành các thí nghiệm chọn tạo các giống hoa loa kèn, cẩm chướng, cúc, lan, bằng phương pháp đột biến phóng xạ

Trang 27

Trang 28

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu trên bốn giống đồng tiền nhập nội từ Trung Quốc đang được

trồng phổ biến ngoài sản xuất hiện nay, bao gồm:

Màu hoa đẹp, năng suất cành cao, cành cân đối

Đường kính bông nhỏ, cánh hoa nhỏ, xếp thưa

2 Gerbera

Banesa DT2

Hoa màu tím hồng, nhị xanh

Màu hoa đẹp, đường kính hoa lớn

Màu hoa đẹp, cánh hoa xếp xít, năng suất cao

Kích thước hoa và cánh

hoa bé

Giống đồng tiền DT1 Giống đồng tiền DT2 Giống đồng tiền DT3 Giống đồng tiền DT4

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là các nụ hoa 10 ngày tuổi của các giống đồng tiền sạch

bệnh, sinh trưởng phát triển tốt được trồng tại Văn Giang - Hưng Yên

Trang 29

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm:

+ Phòng Nuôi cấy mô tế bào, bộ môn Đột biến & Ưu thế lai, Viện Di truyền Nông nghiệp

+ Trại giống hoa Văn Giang, xã Liên Nghĩa, Văn Giang, Hưng Yên

- Thời gian nghiên cứu: Năm 2014 - 2015

2.4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu gây đột biến bằng chiếu xạ tia Gamma trên mô sẹo giống hoa

đồng tiềnin vitro

-Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các liều chiếu xạ đến khả năng tái sinh

chồi, hệ số nhân, chất lượng chồi, khả năng tạo rễ của cây hoa đồng tiềnin vitro qua 5

thế hệ (M1V5)

- Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng, phát triển

của cây con ngoài vườn ươm

- Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng, phát

triểncủa các giống đồng tiền ngoài đồng ruộng

- Nghiên cứu đánh giá các đặc tính nông sinh học, khả năng xuất hiện biến dị của

các giống hoa đồng tiền đột biến ngoài đồng ruộng và chọn lọc những dòng biến dị có triển vọng

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào

Nhiệt độ 230C ± 20C; ánh sáng 2500 lux; thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối, pH môi trường nuôi cấy = 5,8 Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC;

Trang 30

công thức:

CT1: MS + 2% đường + 7 g/l agar (Đ/C) CT2: Đ/C + 0,25 mg/l 2,4-D

CT3: Đ/C + 0, 5 mg/l 2,4-D CT2: Đ/C + 0,75 mg/l 2,4-D CT2: Đ/C + 1,0 mg/l 2,4-D + Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp 5 bình nuôi cấy, mỗi bình cấy 4 mẫu

+ Mẫu trước khi nuôi cấy được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 7 phút (với DT1) và trong 10 phút (với các giống DT2, DT3, DT4)

+ Theo dõi tỷ lệ tạo mô sẹo của các công thức thí nghiệm

- Gây đột biến bằng chiếu xạ tia Gamma nguồn Co60 qua các liều chiếu

+ Các mô sẹo hình thành có kích thước 0,7 - 1,0 cm, đồng đều nhau, có độ cứng vừa phải, sùi to, có màu xanh đậm được đem đi chiếu xạ bằng tia Gamma (nguồn

Co60) ở 8 liều chiếu khác nhau: 5 Gy; 10 Gy; 20 Gy; 30 Gy; 40 Gy; 50 Gy; 60 Gy; 70

Gy, liều đối chứng là 0 Gy Mỗi liều chiếu 15 bình nuôi cấy/giống, mỗi bình chứa 4 mẫu mô sẹo

+ Thời gian chiếu xạ: Trong một giờ tại Trung tâm chiếu xạ Hà Nội (Cầu Diễn -

Trang 31

DT1, DT2: MS + 0,7 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 0,1 mg/l α-NAA + 10% nước dừa + 2% đường + 7,0 g/l agar

DT3: MS + 0,6 mg/l TDZ + 0,2 mg/l kinetin + 0,1 mg/l α-NAA + 10% nước dừa + 2% đường + 7,0 g/l agar

DT4: MS + + 0,4 mg/l TDZ + 0,2 mg/l kinetin + 0,1 mg/l α-NAA + 10% nước dừa + 2% đường + 7,0 g/l agar

+ Môi trường nhân nhanh:

DT1, DT2: MS + 1mg/l kinetin + 10% nước dừa + 2% đường + 7,0 g/l agar

DT3, DT4: MS + 0,75mg/l BAP + 10% nước dừa + 2% đường + 7,0 g/l agar

+ Môi trường ra rễ:

DT1: MS + 0,3mg/l α-NAA + 2% đường + 7,0 g/l agar

DT2: MS + 0,2mg/l α-NAA + 2% đường + 7,0 g/l agar

DT3, DT4: MS + 0,1mg/l α-NAA + 2% đường + 7,0 g/l agar

- Theo dõi đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sự tái sinh chồi, hệ số nhân và

chất lượng chồi sau chiếu xạ cây in vitro qua 5 thế hệ Theo dõi 1 tuần/ lần, mỗi lần

theo dõi 15 bình/ giống, mỗi bình cấy 10 mẫu

- Theo dõi ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro Lựa

chọn những chồi khỏe mạnh, có 3-4 lá, kích thước đồng đều, cấy chuyển vào môi trường ra rễ Mỗi giống cấy 30 bình, mỗi bình 18 mẫu Theo dõi tỷ lệ ra rễ, chiều dài

rễ, kích thước rễ và đặc điểm hình thái của rễ sau 2 tuần nuôi cấy

2.5.4 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng, phát triển của cây con ngoài vườn ươm

- Vật liệu sử dụng là cây nuôi cấy mô hoàn chỉnh tái sinh từ mô sẹo chiếu xạở thế hệ M1V5 có 3-5 lá; đồng đều về kích thước, cây khỏe mạnh được đưa ra ngoài vườn

- Giá thể ra cây: Đất mùn + trấu hun với tỷ lệ 1:1

- Thí nghiệm được bố trí trong nhà lưới có mái che, cây con được trồng trong các khay xốp giâm 125 lỗ/khay, kích thước khay 50x30x5cm Trồng tuần tự không lặp lại theo từng giống và từng công thức thí nghiệm Theo dõi định kỳ 1 lần/tuần

- Giá thể được khử trùng bằng Zineb trước khi trồng Sau khi ra cây, tiến hành tưới

Trang 32

nước sạch 2 lần - 3 lần/ngày, phun phân bón lá Đầu Trâu 502 1 lần/tuần, từ tuần thứ 3 trở đi cho đến khi cây đủ tiêu chuẩn xuất vườn, phun thuốc phòng trừ nấm bệnh Daconil 500SC 1 lần/tuần

- Đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ sống, đặc điểm hình thái, sự sinh trưởng phát triển và khả năng xuất hiện biến dị hình thái của các giống đồng tiền chiếu

xạ ở giai đoạn vườn ươm

2.5.5 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng của các giống đồng tiền ngoài đồng ruộng

- Sử dụng cây con khỏe mạnh từ giai đoạn vườn ươm chuyển ra ngoài đồng ruộng

- Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB) với 3 lần lặp lại, diện tích ô thí nghiệm là 20 m2/1 giống, khoảng cách trồng 30 x 30 cm, mật độ trồng 6 cây/m2

- Lượng phân bón dùng trong thí nghiệm:

+ Phân bón lót: 28 kg phânchuồng + 2,8 kg phân lân supe photphat

+ Phân bón thúc: 20g đạm ure + 24g lân supe phosphat + 12g kalisunfat + 17g đậu tương xay ngâm hoai mục, bón 1 lần/tháng

- Tiến hành theo dõi định kỳ 7 ngày/lần Các điều kiện chăm sóc giữa các giống thí nghiệm và giống đối chứng là như nhau

- Các chỉ tiêu theo dõi được đánh giá theo phương pháp của Trung tâm thương mại quốc tế về sản xuất hoa cắt (ITC), năm 2001 tại Thụy Sĩ

- Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của các giống hoa đồng tiền chiếu xạ

- Các đặc điểm hình thái được theo dõi bằng phương pháp quan sát, đo đếm trực tiếp

2.5.6.Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các giống hoa đồng tiền đột biến ngoài đồng ruộng

- Các cây đồng tiền đột biến trồng ngoài đồng ruộng tiếp tục theo dõi các đặc tính

nông sinh học như thời gian sinh trưởng, năng suất, chất lượng hoa

- Theo dõi, đánh giá khả năng xuất hiện biến dị của các giống đồng tiền đột biến

Trang 33

- Theo dõi đánh giá những tính trạng mới xuất hiện có ý nghĩa và chọn lọc những dòng

biến dị có triển vọng trong chọn giống đồng tiền mới

- Các chỉ tiêu theo dõi được đánh giá theo phương pháp của Trung tâm thương mại quốc tế về sản xuất hoa cắt (ITC), năm 2001 tại Thụy Sĩ

2.6 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp theo dõi

+ Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = (Số mẫu tạo mô sẹo/ Tổng mẫu cấy) x 100%

+ Tỷ lệ mô sẹo sống (%) = (Số mẫu sống/ Tổng mẫu thí nghiệm) x 100%

+ Hệ số nhân (chồi/mẫu) = Tổng chồi tạo thành/ Tổng mẫu bật chồi

+ Số lá/chồi (lá) = Tổng số lá/ Tổng số chồi

+ Tỷ lệ ra rễ (%) = (Số mẫu ra rễ/ Tổng mẫu thí nghiệm) x 100%

+ Tỷ lệ sống (%) = ( cây sống/  cây trồng) x 100%

+ Chiều cao cây (cm) =  chiều cao cây/  cây theo dõi

+ Số lá/cây (lá) =  lá/  cây theo dõi

+ Thời gian từ khi trồng đến khi ra nụ (ngày): Tính từ ngày trồng đến ngày xuất hiện

nụ hoa đầu tiên

+ Thời gian từ trồng đến ra hoa (ngày): Tính từ ngày trồng đến ngày xuất hiện hoa đầu tiên + Theo dõi một số chỉ tiêu về chất lượng hoa (cm): đường kính hoa, màu sắc hoa, đường kính phần nhị hoa, chiều dài cuống hoa, đường kính cuống hoa

+ Theo dõi độ bền hoa cắt (ngày): tính từ lúc cắt hoa đến khi hoa tàn

+ Hình thái góc lá đo bằng thước đo độ

+ Tần số biến dị (%) = (Số cây xuất hiện biến dị/Tổng số cây theo dõi) x 100%

+ Theo dõi các đặc điểm hình thái bằng phương pháp quan sát, đo đếm trực tiếp

2.7 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007, phần mềm IRRISTAT 5.0

Trang 34

Chương 3 KẾT QUẢNGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu gây đột biến bằng chiếu xạ tia Gamma trên mô sẹo giống hoa

đồng tiền in vitro

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng 2,4-D đến kha ̉ năng tạo

mô sẹo làm vật liệu cho chiếu xạ

Các nụ hoa đồng tiền 10 ngày tuổi, sạch bệnh được đưa về khử trùng và đưa vào mẫu Mỗi nụ hoa được cắt nhỏ thành 3 đến 4 mẫu cấy chuyển vào môi trường tạo mô sẹovới các nồng độ 2,4-D khác nhau Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chất 2,4-D tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống hoa đồng tiền

(Sau 4 tuần nuôi cấy)

Môi trường nuôi cấy Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)

Bổ sung 2,4-D từ 0,25 - 0,5 mg/l tăng tỷ lệ tạo mô sẹo từ 83,46% - 92,65% (DT1), từ 88,78% - 90,74% (DT2); từ 90,35% - 91,78% (DT3) và từ 87,64% - 90,85% (DT4) Khi tăng nồng độ 2,4-D lên 0,75 mg/l cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo đạt cao nhất ở

cả 4 giống đồng tiền (đạt từ 96,65% - 98,72%) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ lên 1,0 mg/l 2,4-D thì tỷ lệ tạo mô sẹo cũng như chất lượng của mẫu giảm, chỉ đạt từ 75,65% - 81,26% Nguyên nhân là do nồng độ 2,4-D cao gây độc cho mẫu và kìm hãm quá trình tạo mô sẹo

Như vậy, môi trường có bổ sung 0,75 mg/l 2,4-D là tốt nhất cho quá trình tạo

mô sẹo để tạo vật liệu phục vụ cho chiếu xạ Chúng tôi sử dụng môi trường có bổ sung

Trang 35

0,75 mg/l 2,4-D để tạo mô sẹo cho chiếu xạ

3.1.2 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ sống và hình thái mô sẹo của các giống đồng tiền nghiên cứu

Các mô sẹo được hình thành có sự đồng đều về kích thước, sùi to, có màu xanh được đem đi chiếu xạ ở các liều chiếu khác nhau Kết quả theo dõi đánh giá được thể hiện qua bảng 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ tia γ nguồn Co 60 đến tỷ lệ sống và

hình thái của mô sẹođồng tiềnin vitro (Sau 4 tuần chiếu xạ)

Liều

chiếu

(Gy)

Thời gian (ngày)

Tỷ lệ mô sẹo sống (%) Hình thái mô sẹo DT1 DT2 DT3 DT4 DT1 DT2 DT3 DT4

100

100 96,8

100

100 94,3

100

100 90,8

Xanh đậm

98,5 95,1 89,2

93,1 85,8 80,5

96,3 91,3 82,3

Xanh đậm

93,5 87,7 80,6

91,2 80,8 73,2

92,3 81,1 74,6

Xanh nhạt

80,3 69,1 50,0

89,3 62,3 57,8

80,6 64,5 44,2

Trắng nhạt

Trắng xanh

Trắng nhạt

73,3 57,5 40,0

69,2 54,1 36,7

71,6 53,0 39,1

Xanh nâu

Trắng xanh

42,5 21,2 13,3

36,7 18,8 11,7

35,9 16,0 10,3

Vàng xanh

Xanh nhạt

Trắng xanh

37,8 14,2 7,2

32,0 10,6 4,5

30,8 9,3 6,5

Nâu nhạt

Vàng nhạt

Vàng nâu Vàng nâu

lệ sống của mô sẹo và hình thái mô sẹo qua các khoảng thời gian theo dõi Các liều

Trang 36

chiếu xạ càng cao thì tỷ lệ sống của mô sẹo càng giảm So với đối chứng, khi liều chiếu tăng lên tỷ lệ sống của mô sẹo giảm từ 7,6% - 96,8% sau 1 tháng theo dõi Giai đoạn đầu (sau 10 ngày chiếu xạ) mô sẹo ở liều đối chứng (0 Gy) sống 100%, tỷ

lệ sống của mô sẹo ở các liều chiếu từ 5, 10, 20,30 Gy tương đối cao, tỷ lệ sống đạt từ 65,2 - 97,3% ở DT1; 73,3 - 98,5% ở DT2; 69,2 - 93,1% ở DT3 và 71,6 - 96,3% ở DT4 Tăng liều chiếu lên 40 - 50 Gy tỷ lệ sống giảm mạnh (DT1 30 - 41,2%, DT2 37,8 - 42,5%; DT3 32,0 - 36,7% và DT4 30,8 - 35,9%), ở liều chiếu 60- 70 Gy tỷ lệ sống rất thấp (chỉ đạt 8,1 - 21,7% ở cả 4 giống đồng tiền nghiên cứu)

Giai đoạn 20 - 30 ngày sau chiếu xạ (Hình 3.1), sức sống của mô sẹo giảm hẳn Sau 30 ngày tỷ lệ sống của mô sẹo ở các liều đối chứng (0 Gy) đạt 90,8 - 96,8% Ở liều chiếu 5, 10, 20 Gy tỷ lệ sống đều đạt trên 50% (riêng mô sẹo của giống DT4 ở liều

20 Gy sau 30 ngày chỉ còn 44,2%) Ở các liều chiếu 30, 40, 50 Gy tỷ lệ sống của mô sẹothấp, sau 30 ngày tỷ lệ sống ở giống DT1 giảm từ32,7% (liều 30 Gy) xuống còn 5,3% (50 Gy) Tương tự như vậy, ở giống DT2 là 40,0% (30 Gy) và 7,2% (50 Gy); giống DT3 là 36,7% và 4,5%; giống DT4 là 39,1% và 6,5% Các mô sẹo ở liều chiếu

60, 70 Gy hóa nâu và chết hẳn

Về hình thái mô sẹo, ở giống đối chứng mô sẹo phát triển tốt, màu sắc xanh đậm Chiếu xạ ở các liều tăng lên, mô sẹo có dấu hiệu kém đi, màu nhạt dần và hóa nâu ở các liều 50 - 70 Gy

Như vậy, liều chiếu càng cao thì tỷ lệ sống của mô sẹo càng giảm, hình thái mô sẹo càng kém Liều gây chết đối với mô sẹo là từ 60 - 70 Gy Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các kết quả đã công bố trước đây của Hoàng Thị Nga và các cộng sự (2009) [10]

Hình 3.1 Các mô sẹođồng tiền DT2 sau chiếu xạ 20 ngày

Trang 37

3.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của các liều chiếu xạ đến khả năng tái sinh của cây

hoa đồng tiền in vitro qua 5 thế hệ (M1V5)

3.2.1 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến khả năng tái sinh chồi của các giống hoa đồng tiền in vitro

Các mô sẹo sống sau 30 ngày chiếu xạ được cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi để tiếp tục theo dõi và đánh giá ảnh hưởng của chiếu xạ, các mô sẹo ở liều chiếu

60, 70 Gy loại ra khỏi thí nghiệm.Kết quả theo dõi sau 2 tháng được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo các

giống đồng tiền sau 2 tháng nuôi cấy Liều chiếu

Kết quả bảng 3.3 cho thấy, khi tăng liều lượng chiếu xạ thì tỉ lệ tái sinh chồi và

số chồi/mô sẹogiảm, sự giảm này khác nhau giữa các liều chiếu và giữa các giống đồng tiền Ở liều đối chứng (0 Gy), tỉ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất (80,3 - 86,5%) Khi tăng dần liều chiếu xạ từ 5 Gy đến 10Gy tỉ lệ tái sinh chồi so với liều đối chứng tương đối cao (70,0 - 81,6%) Tăng liều chiếu 20 - 40 Gy tỉ lệ tái sinh chồi đã giảm mạnh, ở liều chiếu 40 Gy tỉ lệ tái sinh chồi ở các giống đồng tiền chỉ còn 30,3 - 32,0% Ở liều

Trang 38

chiếu 50 Gy các mô sẹohầu như không có sự hình thành chồi Như vậy, sự tái sinh chồi từ mô sẹo tỉ lệ thuận với tỉ lệ sống của mô sẹo

Tương tự như vậy số chồi trung bình/mô sẹo cũng giảm khi liều chiếu tăng lên Ở liều đối chứng, số chồi trung bình đều đạt trên 4 chồi/mô sẹo (4,5 - 5,8 chồi); khi chiếu

ở liều 5 - 10 Gy số chồi giảm nhẹ, mỗi mô sẹo đều đạt trung bình trên 3 chồi; ở liều 20

- 40 Gy số chồi trung bình giảm mạnh, thậm chí có mô sẹo không tái sinh được chồi nào ở liều 30 - 40 Gy (0,3 - 0,8 chồi/mô sẹo)

3.2.2 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến hệ số nhân chồi qua 5 thế hệ của các giống hoa đồng tiền in vitro

Các kết quả theo dõi về hệ số nhân chồi và hình thái chồi của các giống hoa đồng tiền qua 5 thế hệ được thể hiện qua bảng 3.4

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia γ nguồn Co 60 đến hệ số nhân chồi và

hình thái chồi đồng tiềnin vitro

Liều

chiếu

(Gy)

Hệ số nhân chồi sau 5 lần

cấy chuyển Đặc điểm hình thái chồi DT1 DT2 DT3 DT4 DT1 DT2 DT3 DT4

Đ/c 3,48 3,65 3,42 3,26

Chồi xanh đậm, mập khỏe

5 3,01 3,06 3,28 2,65 Chồi xanh,

khỏe

Chồi xanh, khỏe

Chồi xanh, khỏe, mọc dày

Chồi xanh, khỏe

10 2,85 2,95 3,27 2,63 Chồi xanh,

khỏe

Chồi xanh, khỏe

Chồi xanh nhạt, khỏe, mọc dày

Chồi xanh nhạt, khỏe

20 2,73 2,91 2,75 2,43

Chồi ngắn,

lá ngọn quăn, xanh nhạt

Chồi ngắn,

lá dày, có

lá bạch tạng

Chồi dài, xanh nhạt

Chồi nhỏ, xanh nhạt

30 2,46 2,47 2,08 2,27

Chồi nhỏ, thân mọng nước

Chồi nhỏ, dài, màu xanh vàng

Chồi nhỏ, dài, yếu, mọng nước

Chồi nhỏ, yếu có màu xanh vàng

40 2,36 2,45 1,83 2,26 Chồi nhỏ,

ngắn, yếu

Chồi nhỏ, ngắn, yếu

Chồi màu xanh nhạt

Chồi màu xanh nhạt, yếu

CV% 2,8 3,3 3,4 2,6

LSD 0,05 0,04 0,02 0,12 0,05

Trang 39

Kết quả bảng 3.4 cho thấy hệ số nhân chồi sau 5 lần cấy chuyển ở các cây chiếu

xạ có xu hướng giảm hơn so với đối chứng khi liều chiếu tăng lên

Ở liều đối chứng (0 Gy), hệ số nhân chồi ở 4 giống đồng tiền đạt 3,26- 3,65; khi tăng liều chiếu lên 5 Gy, chỉ tiêu này chỉ còn từ 2,65- 3,28; hệ số nhân tiếp tục giảm khi liều chiếu tăng lên Hệ số nhân đạt thấp nhất ở liều 40 Gy (chỉ đạt 1,83- 2,45)

Khi theo dõi đặc điểm hình thái chồi cho thấy chiếu xạ ở liều cao (30 - 40 Gy) làm chồi nhỏ hơn, yếu hơn, thân mọng nước và màu xanh vàng Ở liều 20 Gy thấy xuất hiện chồi khác so với đối chứng: Giống DT1 xuất hiện chồi ngắn, lá ngọn quăn; giống DT2 có một số lá bạch tạng; giống DT3 và DT4 có chồi dài hơn và chồi nhỏ Chiếu ở liều thấp (5 - 10 Gy) không làm ảnh hưởng nhiều đến đặc điểm hình thái chồi

Như vậy, chiếu xạ ở liều 5 - 10 Gy không ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo, số chồi/mô sẹo, hình thái chồi tốt Chiếu ở liều 20 Gy làm giảm khả năng tái sinh chồi, giảm hệ số nhân và làm xuất hiện một số hình thái chồi khác so với giống đối chứng ban đầu Khi chiếu ở liều 30 - 40 Gy làm giảm khả năng tái sinh chồi

từ mô sẹo, hệ số nhân chồi giảm và chồi kém phát triển (Hình 3.2)

DT2 (Đ/c) DT2 (20 Gy) DT2 (30 Gy) DT2 (40 Gy)

Hình 3.2 Hình thái chồi của giống đồng tiền DT2 sau 2 tuần cấy chuyển

3.2.3 Ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ tia γ nguồn Co 60 đến khả năng ra rễ của chồi đồng tiềnin vitro

Sau khi cấy chuyển 5 lần, các chồi đồng tiềnin vitro được chuyển sang môi

trường tạo rễ Theo dõi sau 2 tuần cấy chuyển, kết quả thu được ở bảng 3.5

Trang 40

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ tia γ nguồn Co 60 tới khả năng ra rễ

của chồi đồng tiềnin vitro(Sau 2 tuần nuôi cấy)

Chiều dài

rễ (cm)

Số rễ/cây (rễ) Hình thái rễ

10 93,8 0,63 5,8 Rễ dài, mập, có nhiều rễ tơ

Định dạng
Số trang	82
Dung lượng	2,78 MB