TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT: Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi cấy in vitro

TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chủ đề: Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi cấy in vitro A ĐẶT VẤN ĐỀ Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú. Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus, bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996). B NỘI DUNG I. Khái niệm 1. Biến dị Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động của các yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân cơ bản của tiến hóa và là nguồn nguyên liệu cho chọn giống. 2. Biến dị dòng soma (biến dị dòng vô tính) Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981). Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà chua, mía, họ cải… bao gồm đầy đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính. Biến dị soma là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do những tác động của các yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền.Biến dị soma tạo ra nguồn đa dạng to lớn ở các cá thể sinh vật là nguyên nhân cơ bản của tiến hóa và nguồn nguyên liệu cho chọn giống. Biến dị kiểu gen + thường biến = biến dị dòng tế bào soma II. Ưu và nhược điểm của biến dị soma 1. Ưu điểm Cùng lúc khảo sát được 1 khối lượng lớn hàng triệu tế bào trong 1 không gian môi trường hẹp chẳng hạn trong đĩa petri, đồng nhất và cùng chịu 1 áp lực chọn lọc chủ định thích hợp , dễ dàng tiến hành theo qui trình công nghiệp Các biến dị sinh ra trong nuôi cấy mô không gặp phải những cản trở về mặt xã hội, đạo đức như các cây trồng chuyển gen. Có tiềm năng nhất định trong công tác cải tiến giống cây trồng, đặc biệt là các cây lâu năm vốn bị cản trở bởi nền di truyền hẹp và chu kì tái sinh dài Xác định các biến dị trong nuôi cấy mô: + Xác định bằng biotest + Phân tích AND qua các chỉ thị phân tử + Xác định qua kiểu hình

TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chủ đề: “Biến dị dịng vơ tính (biến dị soma) nuôi cấy in vitro” A- ĐẶT VẤN ĐỀ Ban đầu nuôi cấy mô sử dụng làm kỹ thuật để tạo sinh khối phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt đồng bố mẹ ban đầu giống ưu tú Tuy nhiên, với thời gian cơng trình nghiên cứu nhiều lồi trồng có giá trị kinh tế người ta thấy tế bào mô nuôi cấy môi trường nhân tạo thường xuất biến đổi di truyền bao gồm số lượng cấu trúc nhiếm sắc thể, xếp lại nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v Các biến dị truyền lại cho tái sinh Tập hợp biến dị di truyền hình thành trình ni cấy gọi biến dị dịng soma (somaclonal variation) (Larkin Scowcroft, 1983) Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng loài cây, kiểu gene loài mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, tính ổn định genome Như thân nuôi cấy mô tế bào nguồn biến dị di truyền quan trọng, mẻ phong phú điều kiện thích ứng có ích cho cải thiện giống trồng Một số thể biến dị dịng soma có ích phân lập, khả để kháng virus, bệnh đốm vàng viền nâu bệnh sương mai mía (Heinz cộng sự, 1977); khả kháng bệnh đốm nhỏ ngô (Bretell Ingram, 1979); kháng sương mai khoai tây (Shepard cộng sự, 1980); chịu hạn chịu lạnh lúa (Lê trần Bình cs, 1996) B- NỘI DUNG I Khái niệm Biến dị Biến dị là những biến đổi mới mà thể sinh vật thu được tác động của các yếu tố môi trường và quá trình tái tổ hợp di truyền Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân bản của tiến hóa và là nguồn nguyên liệu cho chọn giống Biến dị dòng soma (biến dị dòng vô tính) Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981) Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài trồng thuốc lá, khoai tây, cà chua, mía, họ cải… bao gồm đầy đủ các tính trạng nông học chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng các tính trạng hóa sinh khác Biến dị dòng soma gọi biến dị dịng vơ tính Biến dị soma biến đổi mà thể sinh vật thu tác động yếu tố mơi trường q trình tái tổ hợp di truyền.Biến dị soma tạo nguồn đa dạng to lớn cá thể sinh vật nguyên nhân tiến hóa nguồn nguyên liệu cho chọn giống Biến dị kiểu gen + thường biến = biến dị dòng tế bào soma II Ưu nhược điểm biến dị soma Ưu điểm - Cùng lúc khảo sát khối lượng lớn hàng triệu tế bào không gian môi trường hẹp chẳng hạn đĩa petri, đồng chịu áp lực chọn lọc chủ định thích hợp , dễ dàng tiến hành theo qui trình cơng nghiệp - Các biến dị sinh nuôi cấy mô không gặp phải cản trở mặt xã hội, đạo đức trồng chuyển gen - Có tiềm định công tác cải tiến giống trồng, đặc biệt lâu năm vốn bị cản trở di truyền hẹp chu kì tái sinh dài - Xác định biến dị nuôi cấy mơ: + Xác định biotest + Phân tích AND qua thị phân tử + Xác định qua kiểu hình - Tạo số kiểu hình tạo phương pháp truyền thống Nhược điểm - Một số biến dị dòng soma kết hợp với hay số tính trạng khơng mong muốn lệch bội , bất dục Hoặc số biến dị soma khác lại xảy tính trạng nơng học có ích, làm tính trạng tốt cần lưu giữ - Nhiều đặc điểm biến đổi không theo ý muốn - Nếu sử dụng dịng tế bào để ni cấy lặp lại nhiều lần tỉ lệ tái sinh thành giảm - Một số dịng biến dị dịng soma khơng ổn định không truyền cho đời sau III Phân loại biến dị dòng soma Biến dị kiểu gen (genetic hay heritable variation) Biến dị kiểu hình (epigenetic hay phenotypic) Biến dị kiểu gen Là các biến dị có khả di truyền xảy với tỷ lệ rất thấp và không có tính thuận nghịch Bản chất: Chưa được làm sáng tỏ Bao gồm loại: Đột biến hệ gen, đợt biến NST và đợt biến gen • Đợt biến hệ gen Là các biến đổi về số lượng NST Loại phổ biến là sự sai khác về số lượng NST đa bội, dị bội hay thể khảm Các loài có độ bội thể cao và nhiều số lượng NST cao dễ bị biến đổi các loài có mức độ bội thể thấp và ít NST Biến đổi này xảy thường xuyên nuôi cấy tế bào, đặc biệt nuôi cấy tế bào trần Những biến đổi này có thể xảy từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, sự phân tách NST không bình thường ở những chu kỳ tế bào đầu tiên Hình 1: Thể đa bội dưa hấu • Đợt biến NST Là các biến đởi về cấu trúc NST, các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng như: Mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo các NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổi quá trình giảm phân Những biến đổi này có thể ảnh hưởng tới kiểu hình ở Ro và các thế hệ tiếp theo • Đột biến gen (đột biến điểm) Là các biến đổi ở mức độ phân tử: sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản của một trình tự đặc thù, sự thay đổi thể hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen nhảy (transposable elements) Sự xuất hiện các đột biến này về bản mang tính ngẫu nhiên Những tính trạng đột biến thu được ở những tái sinh Ro và cũng được di truyền cho các đời sau • Biến dị kiểu hình Các biến dị kiểu hình thường liên quan đến sự thay đổi quá trình thể hiện của một gen nhất định Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gen Các biến dị kiểu hình thường xuyên xuất hiện ở các tái sinh sau nuôi cấy là kết quả của các phản hồi về mặt sinh lý Các thay đổi về kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi trạng thái ban đầu Tuy nhiên, chúng có thể trì suốt chu kỳ sống của các tái sinh Nguyên nhân: Chưa được tìm hiểu rõ chắc chắn có liên quan đến một vài thay đổi quá trình biểu hiện gen Hiện tượng khuếch đại gen cũng làm thay đổi hệ gen Ví dụ ở cỏ linh lăng đã thu được dòng tế bào có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ photphinotrixin Tăng 20 lần so với bình thường Thuốc này có tác động ức chế enzym glutaminsythetase Phân tích cho thấy, gen kiểm tra enzyme này được khuếch đại 4-11 bản, làm tăng hoạt tính phiên mã lên lần Hiện tượng tăng mạnh mẽ khả sinh trưởng của các tái sinh trồng đất Biểu hiện này có thể liên quan đến việc trở lại của trạng thái trẻ hóa hoặc quá trình loại bỏ virus khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu Các ví dụ khác thuộc nhóm này gồm hiện tượng hoa sớm, bạch tạng, các thay đổi về hình dạng, màu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây… Hình 2: ngơ bị bạch tạng IV Hình 3: chuối lùn Nguyên nhân gây biến dị dòng soma Bất kỳ một yếu tố có khả có thể dẫn đến các thay đổi di truyền đều được xem là một nguyên nhân gây các biến dị này.Các yếu tố này chia làm ba nhóm: sinh lý, di truyền, hóa sinh Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma là: - Tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu - Tác động của các yếu tố quá trình nuôi cấy in vitro Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đơn tính, từ hạt hay được xem là đồng nhất về mặt di truyền và lấy mẫu có thể có kiểu hình giống Tuy nhiên, các mẫu cấy này thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác là ploem, xylem, nhu mô, mô vỏ… Những tế bào này có mức độ bội thể khác Nói cách khác, có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bào cùng một mẫu cấy Sự đa dạng này được gọi là đa bội vô tính (polysomatic) Ngoài ra, nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô có cấu trúc di truyền khác được phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở thân gỗ Sự sắp xếp các mô khác về mặt di truyền meristem của thực vật ảnh hưởng đến tính ổn định của các thể khảm Các ở dạng thể khảm có mức độ biến dị di truyền cao nuôi cấy in vitro 2 Tác động của các yếu tố quá trình nuôi cấy  Phương thức nhân giống in vitro: Các phương thức nhân giống khác sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác Nhìn chung, nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào thì hội để xuất hiện các biến dị soma thường là lớn rất nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào Các quá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast đó thường có nhiều biến dị soma  Loại mẫu cấy: Các loại mẫu cấy khác thường thể hiện mức độ biến dị khác Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độ biến dị thấp sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng lá, rễ hay protoplast Khả xảy các biến dị soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng tuổi mẹ Các dòng già thường ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao dòng trẻ Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều thì có tính biến dị càng cao  Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng sử dụng Cho các mô nuôi cấy dài ngày môi trường chứa các auxin mạnh 2,4 D hoặc 2,4,5 T thường gây các sai khác tái sinh Ví dụ như: các dầu dừa tái sinh từ callus nuôi cấy dài ngày môi trường có chứa 2,4 D có tỷ lệ rất lớn các biến dị trồng đồng ruộng Sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung 1.65 mg/l TDZ and 0.2 mg/l 2,4D Sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung 3.0 mg/l BAP 0.2 mg/l IBA  Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển Việc nuôi cấy dài ngày điều kiện in vitro cũng tăng số lần cấy chuyển cũng sẽ làm tăng khả xuất hiện các biến dị soma Nguyên nhân của hiện tượng này là sự thay đổi của các kiểu methyl hóa bình thường của ADN genome V Cơ chế tạo biến soma  Sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của ADN genome Quá trình methyl hóa là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là Adenine hay Cytosin – có một nhóm methyl gắn liền với nó Khi quá trình methyl hóa xảy vậy một vùng mã hóa ADN cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và gen bị bất hoạt Việc bất hoạt gen quá trình methyl hóa có thể không được nhận biết về mặt hiện tượng mặc dù quá trình này đã được tìm thấy nuôi cấy mô ở một số loài ngô, khoai tây và nho  Sự sắp xếp lại của NST Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của biến dị di truyền thể hiện ở các dòng soma Ví dụ: Khi nghiên cứu về chế dẫn đến sự thay đổi NST, một số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị nhiễm sắc là nguyên nhân chính dẫn đến các biến dị dòng vô tính ở ngô và đậu  Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị Sự tách hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc các gen cấu trúc ở gần nó Hơn thế, sự tách không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo sự sắp xếp của các trình tự nucleotide Chúng là nguyên nhân của các biến đổi biểu hiện gen cấu trúc NST Các nhân tố chuyển vị Tnt2 thuốc lá được hoạt hóa nuôi cấy mô Nhân tố chuyển vị Ac-Ds ngô  Đột biến điểm Chúng có thể là đột biến lặn hay trội Các đột biến gen đã được tìm thấy ở cà chua (13 đột biến gen đơn khác ở 230 tái sinh), lúa mỳ, thuốc lá VI Chọn lọc dòng tế bào soma Nguyên tắc chọn lọc tế bào a Chọn trực tiếp Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc có thể chọn được từ quần thể tế bào.Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc khối callus Điều kiện chọn lọc là các độc tố với nồng độ khác gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào Thông thường, người ta trộn tế bào và môi trường thạch chứa dược tố và chọn những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo hoặc trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa đợc tớ Ví dụ: dịng kháng kháng sinh, chống chịu muối tiến hành theo cách b Chọn gián tiếp: Trong trường hợp này, đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào Ví dụ: enzym nitrate reductase (NR), mơi trường chứa ClO3- tế bào có NR sử dụng ClO3- NO3-, khử thành ClO2-, ClO2- tác dụng độc tố tế bào khơng có NR sống sót môi trường chọn lọc c Chọn tổng thể Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức xử lý động biến và nuôi môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có lại chính là yếu tố gây đột biến Ví dụ: đột biến lặn chịu được S-2-aminoethyl cysteine xuất hiện sau sử lý phôi nuôi cấy Cách chọn dòng tế bào a Không có tác nhân chọn lọc Các tế bào và callus không xử lý sinh trưởng nuôi cấy in vitro ở các thời kỳ khác môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế), được cảm ứng để phân hóa các hoàn chỉnh Các tái sinh sẽ được trồng đồng ruộng để chọn lọc các biến dị Bằng phương thức này, người ta đã thu được các biến dị dòng soma của các trồng khác Các ví dụ: + Với mía đường (Saccharum officinarum): người ta đã chọn được các kháng bệnh mốc sương (downey mildew), bệnh Fiji (do virus apid – transmitted) giống mía Pindar, hoặc cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q10 kháng bệnh đốm mắt (Do Helminthosporium sacchari) + Với khoai tây:Shepard và cộng sự (1980) đã tái sinh một số lớn từ protoplast tế bào thịt lá của giống “Russet Burbank” và thông báo các biến dị thu được quần thể protoclones Một số chúng kháng được bệnh thối sớm (early bright Alternaria solani) hoặc thối muộn (late bright phytophthora infestans) + Với cà chua: Evan và cộng sự đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị hình thái là các đột biến lặn của tính bất dục kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt cuống lá, khả lục hóa của lá, màu sắc của quả và hoa b Có các nhân tớ chọn lọc: Theo phương pháp này, các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào khả sống sót của chúng có mặt các độc tố/chất ức chế môi trường dinh dưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường Các biến dị có thể thu được bằng cách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp Sự phân lập được tiến hành nuôi cấy dịch huyền phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đơn/protoplast Các hướng chọn lọc - Kháng amino acid và các đồng đẳng của amino acid - Kháng bệnh - Kháng thuốc diệt cỏ - Chống chịu với các stress của môi trường - Kháng kháng sinh - Kháng các đồng đẳng base của ADN Tác nhân sử dụng chọn Tính trạng Cây trồng Biểu hiện tính trạng lọc TB Cây nuôi tái Truyền lại cho thế cấy sinh hệ sau Methionine sulfximine (pseudomonas syringe) Kháng lại độc tố bệnh Thuốc lá + + + Tabtoxin tinh khiết (pseudomonas syringe pv tabaci) Kháng lại độc tố bệnh Thuốc lá + + + Dịch độc lọc nuôi (Alternatia alternate) Kháng lại độc tố bệnh Thuốc lá + + + Độc tố HmT của chủng Helminthosporium sacchari Kháng lại độc tố bệnh Ngô + + + (di truyền theo dòng mẹ Độc tố Hs tinh khiết của Helminthosporium Kháng lại độc tố bệnh Mía + + + (thông qua nhân vô tính) Dịch lọc nuôi cấy nấm Helmithosporium oryzae Kháng lại độc tố bệnh Lúa + + + – Methyl trytophan Cải thiện chất lượng protein Lúa + + + S (2 – amino ethyl) – cysteine (AEC) Cải thiện chất lượng protein Lúa + + + NaCl Tăng khả chống mặn Ngô + + + VII Ứng dụng của biến dị soma chọn giống trồng - Trong cải tiến giống trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng một số lượng lớn các nhà kính hay đồng nếu muốn chọn lọc một đặc tính cụ thể nào đó Nếu làm vậy, số nguyên liệu sử dụng sẽ bị giới hạn bởi diện tích có sẵn và thời gian Ngoài ra, các yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn lọc - Các hệ thống nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường được xác định rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm hàng ngàn các tế bào đơn và có khả tái sinh thành hoàn chỉnh Như vậy, có thể chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng một vài đĩa petri hay bình nuôi cấy - Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi trường đặc thù là có thể tạo ở bất cứ đâu - Tạo dòng tế bào nuôi cấy có khả sản xuất các chất hoạt tính sinh học với suất cao - Tạo các giống trồng mang những đặc tính biến dị quý + Phân lập biến dị có ích với khả kháng bệnh, chống chịu stress tốt + Phân lập biến dị có ích kiểu hình lý tưởng song cịn thiếu số tính trạng mong muốn  VD: Giống lúa DR2 (có nguồn gốc từ Viện cơng nghệ sinh học) tạo từ dòng tế bào soma biến dị giống lúa CR203 tách tái sinh thành cây, có khả chịu hạn, chịu lạnh tốt, suất cao,đồng  Có thể nghiên cứu lồi nhiệt đới vùng ơn đới ngược lại điều kiện mơi trường đặc thù tạo đâu  Tạo biến dị di truyền khơng qua lai hữu tính dịng ưu tú nấm mỡ chịu nhiệt  Đột phá công nghệ trồng lan cấy mô (10/10/2007) Một phát ứng dụng công nghệ sinh học (CNSH) nhân giống lan phương pháp cấy mô Công ty TNHH Long Đỉnh cho hoa nở sớm từ ống nghiệm  Các dịng tế bào mang đặc tính mong muốn sau chọn lọc tái sinh thành thể thực vật hoàn chỉnh để phát triển nguồn giống mới, thích hợp điều kiện sản xuất nơng nghiệp cụ thể Giống lúa CR203 có nhiều gen quý tính chống chịu rầy nâu, tính thích ứng ổn định,năng suất gạo Hiện nhà khoa học nghiên cứu tạo hoa đồng tiền phương pháp biến dị soma VIII Tạo giống cà chua chịu hạn Cơng trình nghiên cứu Ảnh hưởng xử lý ETHYLMETHANESULPHONATE (EMS) invitro cẩm chướng Thực bởi:Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà, Vũ Hồng Hiệp Tóm tắt Nghiên cứu nhằm bước đầu làm rõ tác động gây đột biến xử lý ethylmethane sulphonate (EMS) in vitro cho cẩm chướng Trong thí nghiệm, đoạn thân mang mắt ngủ in vitro ngâm dung dịch EMS với nồng độ khác (từ - 1,0%) với thời gian - sau đặt máy lắc với tốc độ100 vòng/phút Mẫu nuôi cấy môi trường tạo chồi MS + 1ppm Kinetine sau chuyển sang ni cấy môi trường tạo rễ MS + 0,5 ppm α- NAA Kết cho thấy, nồng độ EMS cao, thời gian xử lý mẫu dài tỷ lệ mẫu sống phát sinh chồi giảm Xử lý EMS làm tăng tỷ lệ biến dị cho cẩm chướng nuôi cấy in vitro từ 5,1 đến 22,7 lần so với đối chứng Nồng độ thời gian xử lý thích hợp 0,4% EMS thời gian Sau xử lý, thu năm dạng chồi biến dị(A, B, C, D, E) Mức độ tăng trưởng chiều cao, số khả rễ dạng chồi giảm dần theo thứ tự: A > B > D > E > C Trên sở số liệu thực nghiệm xây dựng mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ khả sống mẫu cấy, tỷ lệ biến dị chồi với nồng độ EMS thời gian xử lý mẫu Các kết tạo sở cho việc ứng dụng công nghệ xử lý đột biến in vitro tạo giống hoa cẩm chướng ởViệt Nam Ethyl methanesulfonate (EMS) hợp chất hữu gây đột biến, gây qi thai, gây ung thư với cơng thức CH3SO3C2H5 Nó tạo đột biến ngẫu nhiên vật liệu di truyền cách thay nucleotide, đặc biệt guanine Làm xảy đột biến điểm Ethyl methanesulfonate Vật liệu nghiên cứu phương pháp nghiên cứu a) Vật liệu nghiên cứu Đoạn thân mang mắt ngủ chồi invitro hoa cẩm chướng thơm (Dianthus caryophillus L.) giống Quận chúa b) Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật • Mơi trường MS(6,2 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l innositol) • pH:6 • nhiệt độ: 22 – 25 độ C • Cường độ chiếu sáng:2000 lux • Thời gian: 16h/ ngày • Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên • Mỗi cơng thức thí nghiệm tiến hành lần nhắc lại, lần nhắc lại bố trí 30 bình, bình mẫu  Phương pháp xử lý đột biến in vitro Các đoạn thân mang mắt ngủ cẩm chướng invitro (khoảng 1,0 cm) ngâm dung dịch EMS có nồng độ khác (0-1,0%) lắc với tốc độ 100 vòng/phút, xử lý mức thời gian: 1h, 2h 3h tùy thí nghiệm Các mẫu sau xử lý rửa nước cất vô trùng lần nuôi cấy môi trường nhân nhanh chồi (MS + 1,5 ppm Kinetin) Sau tuần nuôi cấy, chồi in vitro chuyển sang môi trường rễ (MS +0,5 ppm NAA) Mỗi công thức xử lý 100 mẫu in vitro cho lần nhắc lại, tiến hành lần nhắc lại công thức  Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm Excel Irristat 4.0S Sử dụng thuật toán nội suy Lagrange để xây dựng mơ hình tốn học (Nguyễn Đình Trí cs.,2002) 3.Kết nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng EMS tới phát sinh sinh trưởng cẩm chướng in vitro EMS chất gây độc biến hóa tác động trực tiếp vào hệ gen tế bào qua phương thức thẩm thấu qua bề mặt mô Với mức thời gian khác nhau, thí nghiệm cho thấy EMS có ảnh hưởng rõ đến khả sống khả phát sinh chồi mẫu xử lý(Bảng 1) Khi tăng nồng độ thời gian xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống, tỉ lệ phát sinh chồi giảm dần Ở mức thời gian xử lý khác tỉ lệ phát sinh chồi đạt cao nồng độ 0,4% Bảng 1: Ảnh hưởng EMS đến khả sống phát sinh chồi in vitro (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ EMS (%) Xử lý 1h Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ phát sinh chồi Xử lý 2h Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ phát sinh chồi Xử lý 3h Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ phát sinh chồi (%) (%) (%) 0,0 100,00 100,00 98,83 98,58 97,78 97,67 0,2 91,11 91,66 88,89 88,26 83,33 82,68 0,4 86,67 93,93 82,22 91,11 78,89 84,15 0,6 81,97 88,90 70,00 86,50 62,44 82,19 0,8 48,89 80,40 45,55 77,38 39,97 74,66 1,0 32,22 73,83 26,67 71,86 18,99 69,74 CV% 4,00 1,20 1,90 1,50 1,30 0,80 LSD0.05 4,26 1,93 1,30 2,30 1,51 1,15 Mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ nồng độ EMS tỷ lệ mẫu chết với thời gian sử lý STT Thời gian sử lý Mơ hình tốn học R 1h Y = -62,16X +1157,07X2 - 4145,10X3 + 5626,30X4 - 2508,33X5 0,94 2h Y = 1,17 + 52,91X - 57,06X2+ 563,85X3- 1107,81X4+ 581,77X5 0.97 3h Y = 2,22 + 195,48X - 997,26X2+ 2299,84X3- 2109,11X4+689,48X5 0.98 Từ kết thu được, thuật tốn nội suy Lagrange, mơ hình tốn học xây dựng biểu diễn mối quan hệ hệ số tương quan nồng độ, thời gian xử lý EMS với tỉ lệ mẫu chết Hệ số tương quan R>= 0,9 cho thấy, tỉ lệ mẫu chết nồng độ EMS xử lý có mối tương quan thuận chặt chẽ Dựa vào mơ hình tốn học này, dự báo tỉ lệ mẫu chết với nồng độ EMS xử lý, từ xác định khoảng nồng độ xử lý đem lại hiệu di truyền cao mà gây chết cho mẫu xử lý 2.2 Ảnh hưởng EMS đến phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro EMS khơng ảnh hưởng đến khả sống tái sinh chồi mẫu cấy mà cịn có khả gây biến dị hình thái chồi in vitro Các chồi mọc từ mẫu xử lý EMS có hình dạng khác không giống chồi từ mẫu không xử lý EMS (đối chứng) Đây chồi bị biến dị hình thái Tỉ lệ xuất chồi biến dị hình thái cơng thức khác nhau(Bảng 2) Số liệu thực nghiệm cho thấy có phụ thuộc tuyến tính tỉ lệ chồi biến dị hình thái vào nồng độ, thời gian xử lý EMS: nồng độ cao thời gian xử lý dài tỉ lệ chồi biên dị lớn Bảng 2: Tỷ lệ (%) chồi biến dị hình thái xử lý EMS (sau tuần ni cấy) Nồng độ EMS Thời gian sử lý EMS (giờ) 1h 2h 3h 0,0 2,24 4,19 5,87 0,2 13,2 18,52 29,93 0,4 15,6 28,25 33,33 0,6 34,75 38,53 46.01 0,8 45,72 49,53 56,33 1,0 52,5 57,88 64,49 CV% 3,04 6,7 4,3 LSD0,05 1,75 3,91 3,04 Mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ nồng độ EMS tỷ lệ biến dị chồi với thời gian sử lý STT Thời gian sử lý Mơ hình tốn học R 1h Y = 2,24 + 266,34X - 1823,63X2+ 4983,33X3 - 5431,25X4+2061,46X5 0,985 2h Y = 4,19 + 99,15X - 192,33X2 + 311,72X3-201,04X4+ 36,20X4 0,977 3h Y = 5,87 + 327,25X - 1665,40X2+ 3870,73X3- 3865,10X+ 1391,15X5 0,980 Các dạng chồi mọc từ mẫu xử lý EMS phân lập thành dạng sau Dạng A: Chồi phát sinh bình thường Dạng B: Chồi có biến đổi hình thái hình quạt, đốt thân mạng lá, dính vào tạo hình lao, đốt thân mang lá, bao chặt thân có dạng vịi Dạng C: Chồi thấp, đốt thân ngắn xếp xít lại với nhau, dày, cứng màu xanh đậm Dạng D: Chồi đa thân, thân tạo nhiều thân ghép lại với Dạng E: Chồi có khả sinh sản mạnh, chồi có khả đẻ chồi mạnh, tạo thành cụm chồi Bảng 3: Ảnh hưởng EMS đến tỷ lệ (%) dang chồi in vitro với thời gian xử lý 1h (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ EMS (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E 0,0 97,76 2,24 0,00 0,00 0,00 0,2 86,75 8,10 2,16 3,00 0,00 0,4 74,40 17,32 2,54 4,19 1,55 0,6 64,91 22,32 4,78 4,28 3,70 0,8 54,62 33,25 6,12 3,82 2,19 1,0 47,50 34,72 15,45 2,33 0,00 CV% 1,40 5,70 8,80 8,40 5,20 LSD 1.75 2,00 0,81 0,11 0,11 Bảng 4: Ảnh hưởng EMS đến tỷ lệ (%) dang chồi in vitro với thời gian xử lý 2h (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E EMS (%) 0,0 95,81 4,19 0,00 0,00 0,00 0,2 81,82 10,08 3,13 3,29 0,00 0,4 70,24 17,55 3,75 4,64 1,69 0,6 61,36 27,11 5,42 3,69 2,41 0,8 51,15 32,51 10,63 3,47 2,25 1,0 42,12 36,42 21,46 0,00 0,00 CV% 2,80 8,10 7,40 6,80 6,10 LSD 3,35 3,07 0,97 0,30 0,19 Bảng 5: Ảnh hưởng EMS đến tỷ lệ (%) dang chồi in vitro với thời gian xử lý 3h (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ EMS (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E 0,0 94,13 5,87 0,00 0,00 0,00 0,2 69,71 19,71 4,69 3,50 2,39 0,4 66,33 21,73 5,39 4,36 2,20 0,6 53,59 31,46 9,31 3,57 2,08 0,8 44,71 38,06 14,33 2,90 0,00 1,0 34,76 35,44 29,80 0,00 0,00 CV% 2,30 4,60 5,00 9,30 4,70 LSD 2,49 2,06 0,95 0,39 0,09 Khi xử lý EMS nồng độ cao thời gian dài khơng tăng mà cịn làm chúng giảm Vì vậy, nồng độ thích hợp cho xử lý mẫu EMS 0,4% thời gian ngâm mẫu 2h Ở nồng độ thời gian xử lý có tỉ lệ mẫu sống, tỉ lệ phát sinh chồi cao, số lượng chồi dạng chồi biến dị thu nhiều 3.3 Khả rễ dạng chồi in vitro Bảng 6: sinh trưởng khả rễ dạng chồi in vitro Dạng chồi Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Thời gian rễ (ngày) Chiều cao TB (cm/cây) Số cặp (lá/cây) Số rễ TB (rễ/cây) Chiều dài rễ (cm) Dạng A 100 4,96 4,11 9,23 3,13 Dạng B 88,89 4,72 3,92 6,44 1,87 Dạng C 37,78 15 1,52 2,21 0,78 0,58 Dạng D 83,33 11 3,76 3,56 6,21 1,41 Dạng E 76,67 12 3,45 3,37 5,76 1,36 CV% 1,80 2,40 2,10 5,00 LSD0,05 0,12 0,15 0,21 0,15 Các dạng chồi thu sau xử lý EMS chuyển sang nuôi cấy môi trường rễ (MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính 0,25 mg/l NAA) Sau tuần ni cấy, sinh trưởng loại chồi biến dị nhiều so với chồi bình thường, mức độ tăng trưởng chiều cao, số khả rễ(tỉ lệ chồi rễ, thời gian xuất rễ, số rễ/cây) dạng chồi giảm dần theo thứ tự chồi dạng A> chồi dạng B> chồi dạng D> chồi dạng E> chồi dạng C Như vậy, sinh trưởng, phát triển dạng chồi biến dị nuôi cấy in vitro cung cấp liệu giúp định hướng sàng lọc tiếp dạng biến dị có lợi điều kiện tự nhiên 3.4 Sự thích ứng dạng chồi in vitro điều kiện vườn ươm Bảng 7: sinh trưởng, phát triển dạng in vitro Dạng chồi Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB (cm) Số cặp lá/cây Dạng A 96,16 5,42 5,18 Dạng B 93,33 4,55 4,32 Dạng C 3,33 2,63 2,34 Dạng D 82,22 4,32 3,98 Dạng E 76,67 4,03 3,67 CV% 2,20 2,80 LSD0,05 0,17 0,20 Ở giai đoạn vườn ươm , dạng chồi biến dị có khả sống sinh trưởng thân thấp nhiều so với dạng chồi bình thường Tỉ lệ sống chồi dang A cao (93,33%) tiếp đến chồi dạng B,D,E,C Chồi dạng C có khả sống thấp (3,33%) Một nguyên nhân số lượng rễ tạo giai đoạn tạo hoàn chỉnh chồi dạng C thấp Sau giai đoạn vườn ươm, dạng nêu trồng vườn sản xuất để tiếp tục theo dõi, đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển khác nhằm xác định biến dị có lợi làm nguồn nguyên liệu cho chọn tạo giống hoa cẩm chướng 4 Kết luận Xử lý EMS làm tăng biến dị cho cẩm chướng nuôi cấy invitro từ 5,1 đến 22,7 lần so với đối chứng Theo tính tốn nồng độ thời gian xử lý thích hợp 0,4% EMS thời gian 2h EMS làm giảm khả sống, khả phát sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ cẩm chướng invitro Nồng độ EMS cao thời gian xử lý mẫu dài tỷ lệ mẫu sống phát sinh chồi giảm C- KẾT LUẬN Người ta tiến hành xử lý chọn lọc tế bào thực vật ba mức độ cấu trúc chính: callus, tế bào đơn (single cell) tế bào trần Trong phạm vi công nghệ (nuôi cấy) tế bào thực vật, người ta thường tập trung nghiên cứu cho mục đích chọn dịng tế bào sản xuất dư thừa (over production) loại sản phẩm chủ yếu amino acid hợp chất tự nhiên Trong công tác giống trồng, chọn dịng tế bào biến dị soma khái quát số ứng dụng sau: - Chọn dòng tế bào chống chịu điều kiện bất lợi ngoại cảnh, ví dụ: chống chịu nóng, lạnh, phèn, mặn, khơ-hạn - Chọn dịng tế bào kháng độc tố: độc tố nấm bệnh tiết ra, loại kháng sinh Các dòng tế bào mang đặc tính mong muốn sau chọn lọc tái sinh thành thể thực vật hoàn chỉnh để phát triển nguồn giống mới, thích hợp cho điều kiện sản xuất nơng nghiệp cụ thể Nhìn chung, tượng biến dị di truyền xuất tế bào khơng phân hóa (undifferentiation), protoplast phân lập, callus mô nuôi cấy in vitro Nuôi cấy tế bào thực vật có khả tạo biến dị di truyền tương đối nhanh không cần phải ứng dụng kỹ thuật Như biến dị soma tượng thường gặp q trình ni cấy mơ tế bào thực vật Biến dị soma có nhiều ưu điểm,đóng vai trị quan trọng cơng tác chọn tạo giống trồng Việc hiểu rõ tượng vô quan trọng để tạo giống tốt mong muốn - Nguồn trích dẫn tài liệu + http://timtailieu.vn/tai-lieu/bai-giang-bien-di-soma-trong-qua-trinh-nuoi-cay-in-vitro25607/ + giảng cô Nguyễn Thị Lý Anh + di truyền tế bào lai soma- Nguyễn Như Hiền ... sinh chồi giảm C- KẾT LUẬN Người ta tiến hành xử lý chọn lọc tế bào thực vật ba mức độ cấu trúc chính: callus, tế bào đơn (single cell) tế bào trần Trong phạm vi công nghệ (nuôi cấy) tế bào thực. .. nước cất vô trùng lần nuôi cấy môi trường nhân nhanh chồi (MS + 1,5 ppm Kinetin) Sau tuần nuôi cấy, chồi in vitro chuyển sang môi trường rễ (MS +0,5 ppm NAA) Mỗi công thức xử lý 100 mẫu in vitro. .. cho chọn giống Biến dị kiểu gen + thường biến = biến dị dòng tế bào soma II Ưu nhược điểm biến dị soma Ưu điểm - Cùng lúc khảo sát khối lượng lớn hàng triệu tế bào không gian môi trường hẹp chẳng