TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT: Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi cấy in vitro

TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chủ đề: Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi cấy in vitro A ĐẶT VẤN ĐỀ Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú. Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus, bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996). B NỘI DUNG I. Khái niệm 1. Biến dị Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động của các yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân cơ bản của tiến hóa và là nguồn nguyên liệu cho chọn giống. 2. Biến dị dòng soma (biến dị dòng vô tính) Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981). Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà chua, mía, họ cải… bao gồm đầy đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính. Biến dị soma là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do những tác động của các yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền.Biến dị soma tạo ra nguồn đa dạng to lớn ở các cá thể sinh vật là nguyên nhân cơ bản của tiến hóa và nguồn nguyên liệu cho chọn giống. Biến dị kiểu gen + thường biến = biến dị dòng tế bào soma II. Ưu và nhược điểm của biến dị soma 1. Ưu điểm Cùng lúc khảo sát được 1 khối lượng lớn hàng triệu tế bào trong 1 không gian môi trường hẹp chẳng hạn trong đĩa petri, đồng nhất và cùng chịu 1 áp lực chọn lọc chủ định thích hợp , dễ dàng tiến hành theo qui trình công nghiệp Các biến dị sinh ra trong nuôi cấy mô không gặp phải những cản trở về mặt xã hội, đạo đức như các cây trồng chuyển gen. Có tiềm năng nhất định trong công tác cải tiến giống cây trồng, đặc biệt là các cây lâu năm vốn bị cản trở bởi nền di truyền hẹp và chu kì tái sinh dài Xác định các biến dị trong nuôi cấy mô: + Xác định bằng biotest + Phân tích AND qua các chỉ thị phân tử + Xác định qua kiểu hình

TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Chủ đề: “Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi

cấy in vitro”

A- ĐẶT VẤN ĐỀ

Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng soma(somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983) Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính

ổn định của genome

Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới

mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus, bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng khángbệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996)

2 Biến dị dòng soma (biến dị dòng vô tính)

Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981) Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà chua, mía,

họ cải… bao gồm đầy đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác

Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính

Biến dị soma là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do những tác động của các yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền.Biến dị soma tạo ra nguồn đa dạng to lớn ở các cá thể sinh vật là nguyên nhân cơ bản của tiến hóa và nguồn nguyên liệu cho chọn giống.

Biến dị kiểu gen + thường biến = biến dị dòng tế bào soma

II Ưu và nhược điểm của biến dị soma

1 Ưu điểm

- Cùng lúc khảo sát được 1 khối lượng lớn hàng triệu tế bào trong 1 không gian môi trường hẹp chẳng hạn trong đĩa petri, đồng nhất và cùng chịu 1 áp lực chọn lọc chủ định thích hợp , dễ dàng tiến hành theo qui trình công nghiệp

- Các biến dị sinh ra trong nuôi cấy mô không gặp phải những cản trở về mặt xã hội, đạo đức như các cây trồng chuyển gen

- Có tiềm năng nhất định trong công tác cải tiến giống cây trồng, đặc biệt là các cây lâunăm vốn bị cản trở bởi nền di truyền hẹp và chu kì tái sinh dài

- Xác định các biến dị trong nuôi cấy mô:

2 Nhược điểm

- Một số biến dị dòng soma kết hợp với 1 hay 1 số tính trạng không mong muốn như lệch bội , bất dục Hoặc 1 số biến dị soma khác lại có thể xảy ra ở các tính trạng nônghọc có ích, làm mất đi những tính trạng tốt cần lưu giữ

- Nhiều đặc điểm biến đổi không theo ý muốn

- Nếu sử dụng dòng tế bào để nuôi cấy lặp lại nhiều lần thì tỉ lệ tái sinh thành cây giảm

- Một số dòng biến dị dòng soma không ổn định và không được truyền cho đời sau

III Phân loại biến dị dòng soma

Biến dị kiểu gen (genetic hay heritable variation)

Biến dị kiểu hình (epigenetic hay phenotypic)

1 Biến dị kiểu gen

Là các biến dị có khả năng di truyền xảy ra với tỷ lệ rất thấp và không có tính thuận

nghịch

Bản chất: Chưa được làm sáng tỏ

Bao gồm 3 loại: Đột biến hệ gen, đột biến NST và đột biến gen

 Đột biến hệ gen

Là các biến đổi về số lượng NST Loại phổ biến là sự sai khác về số lượng NST như đa bội, dị bội hay thể khảm Các loài có độ bội thể cao và nhiều số lượng NST cao dễ bị biến đổi hơn các loài có mức độ bội thể thấp và ít NST Biến đổi này xảy ra thường xuyên trong nuôi cấy

tế bào, đặc biệt trong nuôi cấy tế bào trần

Những biến đổi này có thể xảy ra ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, do sự phân tách NST không bình thường ở những chu kỳ tế bào đầu tiên

Hình 1: Thể đa bội ở dưa hấu

 Đột biến NST

Là các biến đổi về cấu trúc NST, các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng như: Mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo ra các NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổitrong quá trình giảm phân

Những biến đổi này có thể ảnh hưởng tới kiểu hình ở Ro và các thế hệ tiếp theo

 Đột biến gen (đột biến điểm)

Là các biến đổi ở mức độ phân tử: sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản sao của một trình tự đặc thù, sự thay đổi trong thể hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen nhảy (transposable elements) Sự xuất hiện các đột biến này về cơ bản mang tính ngẫu nhiên

Những tính trạng đột biến thu được ở những cây tái sinh Ro và cũng được di truyền cho cácđời sau

 Biến dị kiểu hình

Các biến dị kiểu hình thường liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của một gen nhất định Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gen Các biến dị kiểu hình thường xuyên xuất hiện ở các cây tái sinh sau nuôi cấy như là kết quả của các phản hồi về mặt sinh lý

Các thay đổi về kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi trạng thái ban đầu Tuy nhiên, chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của các cây tái sinh Nguyên nhân: Chưa được tìm hiểu rõ nhưng chắc chắn có liên quan đến một vài thay đổi trong quá trình biểu hiện gen

Hiện tượng khuếch đại gen cũng làm thay đổi hệ gen Ví dụ như ở cỏ linh lăng đã thu đượcdòng tế bào có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ photphinotrixin Tăng 20 lần so với bình thường Thuốc này có tác động ức chế enzym glutaminsythetase Phân tích cho thấy, gen kiểm tra

enzyme này được khuếch đại 4-11 bản, làm tăng hoạt tính phiên mã lên 8 lần

Hiện tượng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trưởng của các cây tái sinh khi trồng trên đất Biểu hiện này có thể liên quan đến việc trở lại của trạng thái trẻ hóa hoặc quá trình loại bỏ virus khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu Các ví dụ khác thuộc nhóm này gồm hiện tượng ra hoa sớm, bạch tạng, các thay đổi về hình dạng, màu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây…

Hình 2: cây ngô bị bạch tạng Hình 3: cây chuối lùn

IV Nguyên nhân gây biến dị dòng soma

Bất kỳ một yếu tố có khả năng có thể dẫn đến các thay đổi di truyền đều được xem như là một nguyên nhân gây ra các biến dị này.Các yếu tố này chia làm ba nhóm: sinh lý, di truyền, hóasinh

Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma là:

- Tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu

- Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy in vitro.

1 Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy

Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đơn tính, từ hạt hay cây con được xem như là đồngnhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình giống nhau Tuy nhiên, các mẫu cấy nàythực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau như là ploem, xylem, nhu mô, mô vỏ… Những

tế bào này có mức độ bội thể khác nhau Nói cách khác, có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bàotrong cùng một mẫu cấy Sự đa dạng này được gọi là đa bội vô tính (polysomatic)

Ngoài ra, nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô

có cấu trúc di truyền khác nhau được phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở cây thân gỗ

Sự sắp xếp các mô khác nhau về mặt di truyền trong meristem của thực vật ảnh hưởng đến tính ổn định của các thể khảm Các cây ở dạng thể khảm có mức độ biến dị di truyền cao khinuôi cấy in vitro

2 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy

 Phương thức nhân giống in vitro :

Các phương thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau.Nhìn chung, nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào thì cơ hội để xuất hiện các biến dị soma thường là lớn hơn rất nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào Các quá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều biến dị soma

 Loại mẫu cấy:

Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độ biến dịthấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay protoplast

Khả năng xảy ra các biến dị soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ Các dòng già hơn thường ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn dòng trẻ hơn

Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều thì có tính biến dị càng cao

 Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng sử dụng

Cho các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4 D hoặc 2,4,5

T thường gây ra các sai khác trong cây tái sinh

Ví dụ như: các cây dầu dừa tái sinh từ callus nuôi cấy dài ngày trên môi trường có chứa 2,4 D có tỷ lệ rất lớn các biến dị khi trồng trên đồng ruộng

Sau 6 tuần nuôi cấy trong môi trường bổ sung

1.65 mg/l TDZ and 0.2 mg/l 2,4D.

Sau 6 tuần nuôi cấy trong môi trường bổ sung3.0 mg/l BAP và 0.2 mg/l IBA

 Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển

Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitro cũng như tăng số lần cấy chuyển cũng sẽ

làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma

Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự thay đổi của các kiểu methyl hóa bình thường của ADN genome

V Cơ chế tạo biến soma

 Sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của ADN genome.

Quá trình methyl hóa là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là Adenine hay Cytosin – có một nhóm methyl gắn liền với nó Khi quá trình methyl hóa xảy ra như vậy trong một vùng mã hóa ADN cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và gen bị bất hoạt Việc bất hoạt gen do quá trình methyl hóa có thể không được nhận biết về mặt hiện tượng mặc dù quá trình này đã được tìm thấy trong nuôi cấy mô ở một số loài như ngô, khoai tây và nho

 Sự sắp xếp lại của NST

Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của biến dị di truyền thể hiện ở các dòng soma Ví dụ: Khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong NST, một số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị nhiễm sắc là nguyên nhân chính dẫn đến các biến dị dòng

vô tính ở ngô và đậu

 Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị

Sự tách ra hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc các gen cấu trúc ở gần nó Hơn thế, sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự sắpxếp của các trình tự nucleotide Chúng là nguyên nhân của các biến đổi trong biểu hiện gen cấu trúc NST Các nhân tố chuyển vị như Tnt2 trong thuốc lá được hoạt hóa trong nuôi cấy mô

Nhân tố chuyển vị Ac-Ds ở ngô

 Đột biến điểm

Chúng có thể là đột biến lặn hay trội Các đột biến gen đã được tìm thấy ở cây cà chua (13 đột biến gen đơn khác nhau ở 230 cây tái sinh), lúa mỳ, thuốc lá

VI Chọn lọc dòng tế bào soma

1 Nguyên tắc chọn lọc tế bào

a Chọn trực tiếp

Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc có thể chọn được từ quần thể tế bào.Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc khối callus.

Điều kiện chọn lọc là các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào Thông thường, người ta trộn tế bào và môi trường thạch chứa dược tố và chọnnhững tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo hoặc cây trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa độc tố

Ví dụ: các dòng kháng kháng sinh, chống chịu muối có thể tiến hành theo cách này

b Chọn gián tiếp:

Trong trường hợp này, đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào

Ví dụ: enzym nitrate reductase (NR), trên môi trường chứa ClO3- những tế bào có NR sử dụng ClO3- như NO3-, và khử thành ClO2-, ClO2- tác dụng như một độc tố cho nên chỉ những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trường chọn lọc

2 Cách chọn dòng tế bào

a Không có tác nhân chọn lọc

Các tế bào và callus không xử lý sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro ở các thời kỳ khác

nhau trên môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế), được cảm ứng

để phân hóa các cây hoàn chỉnh Các cây tái sinh sẽ được trồng trên đồng ruộng để chọn lọc các biến dị Bằng phương thức này, người ta đã thu được các biến dị dòng soma của các cây trồng khác nhau

Các ví dụ:

+ Với cây mía đường (Saccharum officinarum): người ta đã chọn được các cây kháng bệnhmốc sương (downey mildew), bệnh Fiji (do virus apid – transmitted) trên giống mía Pindar, hoặccải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q10 kháng bệnh đốm mắt (Do

Helminthosporium sacchari)

+ Với cây khoai tây:Shepard và cộng sự (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ protoplast tế bào thịt lá của giống “Russet Burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể

protoclones Một trong số chúng kháng được bệnh thối sớm (early bright do Alternaria solani) hoặc thối muộn (late bright do phytophthora infestans).

+ Với cây cà chua: Evan và cộng sự đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dịhình thái là các đột biến lặn của tính bất dục kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt cuống lá, khả năng lục hóa của lá, màu sắc của quả và hoa

b Có c ác nhân tố chọn lọc :

Theo phương pháp này, các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào khả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trường dinh dưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường Các biến dị có thể thu được bằng cách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp Sự phân lập được tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đơn/protoplast

Các hướng chọn lọc

- Kháng amino acid và các đồng đẳng của amino acid

Câytáisinh

Truyền lạicho thế

hệ sauMethionine sulfximine

VII Ứng dụng của biến dị soma trong chọn giống cây trồng

- Trong cải tiến giống cây trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng một số lượng

lớn các cây trong nhà kính hay trên đồng nếu như muốn chọn lọc một đặc tính cụ thể nào đó Nếu làm như vậy, số nguyên liệu sử dụng sẽ bị giới hạn bởi diện tích có sẵn và thời gian Ngoài ra, các yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn lọc

- Các hệ thống nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường được xác định

rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn các tế bào đơn và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Như vậy, có thể chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong một vài đĩa petri hay bình nuôi cấy

- Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi trường

đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu

- Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất

cao

- Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý.

+ Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh, chống chịu stress tốt hơn

+ Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một số tính trạng mong muốn

 VD: Giống lúa DR2 (có nguồn gốc từ Viện công nghệ sinh học) được tạo ra từ dòng tế

bào soma biến dị của giống lúa CR203 được tách và tái sinh thành cây, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh tốt, năng suất cao,đồng đều