Nghiên cứu nhân giống cây thìa canh thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng BA, Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh ..... Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì “tất cả mọi tế bào của một cơ

NGUYỄN VĂN CƯỜNG

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY THÌA CANH (Gymnema

sylvestre) THÔNG QUA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO””

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học: : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2014

Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm khoa

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm em đã tiến hành thực hiện đề tài

‘‘ Nghiên cứu nhân giống Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre)

thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào”

Qua thời gian làm việc tại phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đến nay em đã hoàn thành đề tài Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS Nguyễn Thị Tình, đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Cường

AND : Acid deoxyribonucleic

LSD : Least Significant Difference Test

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 1%, HgCl2

0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy cây Thìa Canh (sau 10 ngày nuôi cấy) 30Bảng 4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình nhân nhanh chồi

cây thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 32

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi

cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 35Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 37Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Thìa

Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 38Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng

ra rễ của cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 40

Hình 2.1 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sehunlt 4Hình 2.2 Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật 8Hình 4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 1%, HgCl2

0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy Cây Thìa Canh 31Hình 4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình nhân nhanh chồi

Cây thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 33Hình 4.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi

Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 36Hình 4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 37Hình 4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Cây Thìa

Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 39Hình 4.6 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng

ra rễ của Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 41

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cây Thìa Canh 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của Cây Thìa Canh 3

2.1.3 Công dụng của Cây Thìa Canh 4

2.1.4.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

2.1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước 5

2.2 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.2 Tính toàn năng của tế bào thực vật 7

2.2.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 7

2.2.4 Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào 8

2.3 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 9

2.3.2 Khử trùng mẫu và cấy khởi động 10

2.3.3 Tạo chồi và nhân nhanh 10

2.3.4 Tạo cây mô hoàn chỉnh 10

2.3.5 Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm 11

2.4.2 Chất khoáng 12

2.4.3 Vitamin 14

2.4.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 15

2.4.5 Agar 20

2.4.6 pH của môi trường 20

2.4.7 Điều kiện vô trùng 20

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.1 Phạm vi nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 22

3.3 Hóa chất và thiết bị 22

3.3.1 Hóa chất 22

3.3.2 Thiết bị 22

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

3.4.1 Nội dung nghiên cứu 23

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 24

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy Cây Thìa Canh 30

4.2 Kết quả Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh 32

4.3 Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh 34

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 36

4.4 Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) đến khả năng ra rễ của Cây Thìa Canh 38

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 38

4.4.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ của Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy ) 40

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú cũng như nền y học cổ truyền lâu đời Các cây thuốc cũng như bài thuốc dân gian được sử dụng phổ biến trong nhân dân để phòng, trị bệnh Công dụng của các loại thảo dược

và các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ngày càng được quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, do khai thác quá mức, nạn phá rừng nên nguồn tài nguyên cây thuốc

bị suy giảm nghiêm trọng, nhiều loài loài đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Việc gây trồng cây dược liệu phục vụ cho bảo tồn, khai thác lâu dài nguồn dược liệu

là việc làm cấp thiết

Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre) là một loài cây thân thảo (Gymnema)

họ Apocynaceae, bản địa của rừng nhiệt đới miền nam và miền trung Ấn Độ Cây Thìa Canh được biết đến và sử dụng rộng rãi tại nhiều nước như Ấn độ, Mỹ, Singapore, Nhật Bản, Trung Quốc, Úc,Việt Nam, v.v… [15],[16],[17],[18] gymnemic acid trong cây Thìa Canh có tác dụng làm hạ đường huyết, với cơ chế tác dụng đã được xác định là tăng tiết insulin của tuyến tuỵ, tăng cường hoạt lực của insulin, ức chế hấp thu glucose ở ruột, làm tăng hoạt tính của men hấp thu và

sử dụng đường, giảm cholesterol và lipid máu

Trong tự nhiên, Cây thìa Canh tái sinh thông qua hạt, đoạn thân tươi Việc gây trồng cây Thìa Canh đã được tiến hành ở một số nơi thông qua đoạn thân, hạt, tuy nhiên các phương pháp nhân giống trên cho hiệu quả không cao Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống cây trồng cho hiệu quả cao Nhiều loại cây dược liệu đã được nhân giống thành công thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: ”Nghiên cứu nhân nhanh Cây Thìa Canh (Gymnema

sylvestre) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nhân nhanh Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre) thông qua phương

pháp nuôi cấy mô tế bào

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được ảnh hưởng của chất khử trùng tới khả Tạo mẫu sạch sinh chồi Cây Thìa Canh

- Xác định được ảnh hưởng của (BA, kinetin, nước dừa) tới khả năng nhân nhanh chồi của Cây Thìa Canh

- Xác định được ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (NAA và

BA, Kinetin), nước dừa tới khả năng nhân nhanh cây Thìa Canh

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quay trình nhân giống cây Thìa

Canh bằng kỹ thuật in vitro

danh mục cây trồng

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hoá lại kiến thức đã học vào

nghiên cứu khoa học

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống cây Thìa Canh bằng kỹ thuật

in vitro, từ đó đảm bảo chủ động trong sản xuất cây giống với số lượng lớn,

sạch bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu cây giống cho sản xuất, nâng cao hiệu quả sản xuất và phục vụ nhu cầu cung cấp dược liệu sạch trong

sản xuất

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây Thìa Canh

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây Thìa Canh hay còn gọi là Dây muôi, với danh pháp khoa học là

Gymnema sylvetre (Retz), chi Lõa ti (Gymnema), họ Thiên lý (Asclepiada ceae), bộ

Long đờm (Gentianales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), ngành Thực vật có hoa;

Mộc lan, giới Thực vật Hạt kín (Manoliopsida) Ở Việt Nam, chi Lõa ti (Gymnema)

có khoảng 8 loài [15],[16],[17], Cây thường mọc trong các bờ bụi, hàng rào tại một

số nơi ở mìn Bắc Việt Nam từ Hải Hưng, Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum,…Ngoài ra, còn phân bố ở Trung Quốc, Ấn độ, Inđônêxia Cây Thìa Canh dược thu hái các bộ phận của toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô

Phân loại:

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của Cây Thìa Canh

Dây leo, cao từ 3-5 m Thân non màu xanh, phủ lông mịn; thân già màu nâu,

có lỗ vỏ, đường kính lỗ vỏ từ 0,5-1 mm Toàn cây có nhựa mủ màu trắng hay hơi vàng Lá mọc đối Cuống dài 3-5 mm; đường kính 2-3mm; phiến hình bầu dục, trứng hay trứng ngược, dài 6-7cm, rộng 2,5-5cm, gốc thuôn, mép nguyên, ngọn nhọn; có 4-6 cặp gân phụ, rõ ở mặt dưới Hoa nhỏ màu trắng hơi vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, dài 8mm, rộng 12-15mm Đài chia 5, các thuỳ dài 1mm,

có lông mịn và rìa lông Tràng 5, dính nhau thành ống, dài 1,8-2 mm, mặt

ngoài nhẵn; tràng phụ gắn với tràng, có 5 răng, dính với họng tràng Cột nhị nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5mm, rộng 0,8-1mm Bộ nhị có bao phấn ngắn; khối phấn gồm hai thùy, dài khoảng 0,2mm, liên kết với nhau nhờ trung đới màu vàng nâu Bộ nhụy có vòi với đầu rộng hình nón, vượt quá bao phấn Quả đại dài 5-6cm, rộng ở dưới, đường kính chỗ lớn nhất khoảng 1,5cm Hạt dẹp, dài 3mm, có mào lông màu trắng, dài khoảng 3-3,5cm, thường có khoảng 40 hạt trong một quả.[15],[16],[17]

Hình 2.1 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sehunlt

1 cành mang hoa: 2 hoa: 3 đài mở với các tuyến: 4 cột nhị nhụy: 5 nhụy: 6 cơ quan truyền phấn và khối phấn (pollinarium): 7 quả: 8 hạt

(hình theo Tsiang & Li 1977)

2.1.3 Công dụng của Cây Thìa Canh

Hoạt chất chính trong Cây Thìa Canh là gymnemic acid, với cơ chế tác dụng đã được xác định là tăng tiết insulin của tuyến tụy, tăng cường hoạt lực

của insulin, ức chế hấp thu glucose ở ruột, làm tăng hoạt tính của men hấp thu

và sử dụng đường, giảm cholesterol và lipit máu.[8]

Trong y học cổ truyền, cây thường dùng trị dái đường với liều 4g lá khô

đủ để làm ngưng glucoza Lá cũng dùng làm thuốc dễ tiêu hóa, còn dùng tán

thành bột để chống độc Cây Thìa Canh đã được sử dụng ở Ấn độ từ 2000 năm nay để trị bệnh “nước tiểu ngọt” Ngoài ra cây còn được dùng đắp lên vết rắn độc cắn Ở Trung Quốc, người ta dùng cả cây bỏ rễ và quả làm thuốc trị phong thấp tê bại, viêm mạch máu, rắn độc cắn, trĩ và các vết thương do dao.[15],[16],[17]

2.1.4.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

- Cây Thìa canh, có tên khoa học là gymnema sylvestre, 1 loại cây dây leo, thân gỗ, được sử dụng tại Ấn độ, Trung quốc hơn 2000 năm nay để trị bệnh nước tiểu ngọt như mật, nó còn có tên Gurmar, có nghĩa là kẻ huỷ diệt

đường Dây thìa canh được biết đến và sử dụng rộng rãi tại nhiều nước như

Ấn độ với tên Diabeticin, Mỹ với tên Sugarest, Singapore với tên Glucos care,

Nhật Bản, Trung Quốc, Úc…[15],[16]

- Loại cây này giúp hỗ trợ tuyến tụy sản suất ra insulin trong tiểu đường tuýp 2 nên là một phương pháp điều trị tự nhiên khá tốt cho căn bệnh này Dây thìa canh cũng cải thiện khả năng giảm đường huyết của insulin trong cả tiểu đường tuýp 1 và tuýp 2 Nó làm giảm cảm giác thèm ngọt Loại thảo dược này có thể là một thay thế tuyệt vời cho các loại thuốc uống giảm đường huyết cho tiểu đường tuýp 2.[1],[5],[8],[10],[12]

2.1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước

- Tại Việt Nam, từ năm 2006 các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội do tiến sĩ Trần Văn Ơn, phụ trách bộ môn Thực vật chủ trì đã lần đầu tiên điều tra phát hiện Dây thìa canh tại 1 số tỉnh miền Trung và miền Bắc Việt Nam Nhận thấy đây là 1 cây thuốc quý, nhóm nghiên cứu đã tiến

hành thu thập mẫu, phân loại, nghiên cứu thành phần hoá học, tổ chức nuôi trồng để tạo nguồn dược liệu sạch, ổn định để sản xuất sản phẩm phục vụ người bệnh.[8]

- Kết quả nghiên cứu đề tài được công bố trên tạp chí Dược học - Bộ y

tế số 391 tháng 11/2008 cho thấy dây thìa canh tại Việt Nam cũng cho tác dụng hạ đường huyết như dây thìa canh ở nhiều nước khác Tác dụng hạ

đường huyết của dây thìa canh có những điểm tương đống như insulin nhanh: đỉnh tác dụng hạ đường huyết ở 2h và duy trì đến 4h; mức độ hạ đường huyết

tương đương ở thời điểm 2h và 4h Ngoài ra trên một số nghiên cứu khác cho thấy tác dụng giảm cholesterol máu giảm béo phì cũng rất hiệu quả.[8]

- Như vậy dây thìa canh có thể ứng dụng điều trị cho cả bệnh nhân tiểu

đường týp 1 hoặc týp 2 phối hợp với các thuốc điều trị khác để kiểm soát và

làm giảm đường huyết, ổn định kéo dài hàm lượng đường huyết, phòng ngừa biến chứng, giảm cholesterol và lipid trong máu, nâng cao đời sống tình dục của bệnh nhân tiểu đường Nam giới Hiệu quả sẽ rất khả quan đạt được sau

đợt dùng 2-3 tháng, kết hợp với chế độ ăn uống và tập thể dục đều đặn

- Có thể nói việc tìm ra cây Cây thìa canh tại Viêt Nam - một dược liệu quý hiếm, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị tiểu đường và mỡ máu, mở ra triển vọng lớn ứng dụng các cây thuốc quý Việt Nam cho sức khoẻ con người - một hướng giải pháp an toàn lâu dài cho bệnh nhân tiểu đường luôn sống vui khỏe.[1],[8],[10]

2.2 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in

vitro các bộ phân tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng

cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen

quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học [14]

- Nguyên tắc cơ bản của nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ

đó để xây dựng lại toàn bộ cơ thể [6]

2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902 lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa

ra quan niệm: “Mỗi tế bào bất kỳ (đã biệt hoá) lấy từ một cơ thể thực vật đều

có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh” Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì “tất cả mọi tế bào của một cơ thể đều chứ

bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp những kiểu protein - enzyme giống hệt nhau và nếu tế bào được nuôi trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường Khả năng đó của tế bào

được gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật” [14]

Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [14]

2.2.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

- Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp

tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá)

- Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể

- Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Quá trình này gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng sơ đồ:

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật

- Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá Kỹ thuật nuôi cấy

mô, tế bào thực vật thực xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật [14]

2.2.4 Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào

- Trong nội bộ từng cơ thể được diễn ra theo các cơ chế nguyên phân,

đây là cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào

con có bộ nhiễm sắc thể giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu Như vậy, qua nguyên phân bộ nhiễm sắc thể của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang

tế bào con Nguyên nhân của hiện tượng này là do ở kỳ trung gian của quá trình nguyên phân, mỗi phân tử DNA đã thực hiện quá trình sao mã để hình thành hai phân tử DNA giống nhau và giống DNA ban đầu và sau đó phân chia đều đặn hai phân tử DNA về hai tế bào con ở kỳ sau

- Giữa hai thế hệ cơ thể được hình thành thông qua cơ chế giảm phân

đã làm cho thế hệ sau có hiện tượng phân ly tính trạng do bộ nhiễm sắc thể

của thế hệ sau không giống nhau và không giống bố mẹ Đây là nguồn nguyên liệu cho chọn lọc tự nhiên và tiến hóa nhưng nó lại là trở ngại lớn khi

muốn duy trì các tính trạng mong muốn ở bố mẹ Nhân giống vô tính in vitro

đã giải quyết được vấn đề này.[14]

- Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống in vitro khi lấy các bộ

phận sinh dưỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông tin di truyền giống nhau và tạo nên cơ thể mới có thông tin di truyền giống nhau và giống cơ thể mẹ Như vậy các tính trạng mong muốn sẽ được giữ lại một cách nguyên vẹn cho mọi cơ thể con

2.3 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.2 K hử trùng mẫu và cấy khởi động

- Giai đoạn này nhằm tạo mẫu sạch và non trẻ cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mẫu bị nhiễm ít, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại

và sinh trưởng tốt Bộ phận của cây được chọn làm mô nuôi cấy phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho từng loại cây và đúng giai đoạn phát triển Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng Ngoài ra chóp đỉnh và chồi non nảy nầm từ hạt cũng được sử dụng nhiều Mẫu trước khi cấy vào môi trường cơ bản phải được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước sạch, sau đó ngâm vào trong dung dịch khử trùng với hàm lượng và thời gian thích hợp Tùy vào từng vật liệu mà chọn các hóa chất khử trùng khác nhau Trong đó quá trình khử trùng mẫu phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy Sau đó đặt mẫu vào môi trường đồng nuôi cấy như MS, B5,… Khi nuôi cấy cần chú ý tới

điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm và hàm lượng CO2 thích hợp.[14]

2.3.3 Tạo chồi và nhân nhanh

Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của

toàn bộ quá trình nhân giống Trong giai đoạn này vai trò của chất điều hòa sinh trưởng có đóng góp rất lớn trong việc kích thích tạo chồi mà vẫn đảm bảo được sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy.[14]

2.3.4 Tạo cây mô hoàn chỉnh

Kích thích chồi ra rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây hoàn chỉnh Chồi hữu hiệu được chọn lựa đưa vào môi trường ra rễ Môi trường tạo

rễ thường giảm đi một nửa hàm lượng các chất môi trường cơ bản nhằm hạn chế quá trình sinh trưởng, tập chung cho ra rễ, loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi và thay vào đó là một số auxin kích thích tạo rễ Tùy theo loại cây mà sử dụng các hàm lượng auxin cho phù hợp Thông thường các chất NAA, IBA, IAA được sử dụng với hàm lượng 1-5mg/l để kích thích chồi

ra rễ đối với một số cây thân gỗ Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo ra quá nhỏ và ngắn có thể sử dụng GA3 và và một số hợp chất như nước dừa…

bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con chuyển sang khu huấn luyện

2.3.5 Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm

Cây con đạt tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) sẽ được đưa ra ngoài huấn luyện một thời gian để thích ứng với điều kiện môi trường bên ngoài, sau đó chuyển từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới,

sau đó chuyển cây ra ngoài vườn ươm Cây in vitro do được nuôi cấy trong

điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô

trùng tốt nên khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ mấy nước và mau héo

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây nuôi cấy mô phải mát, cường độ

chiếu sáng thấp, ẩm độ cao Cây con được cấy trong luống ươm có cơ chế dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm Trong những ngày đầu phải được phủ nilon

để giảm thiểu quá trình thoát hơi nước của lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày

cấy) Rễ tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý thêm với các chế phẩm kích thích ra rễ bằng cách ngâm hoặc phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ

2.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Nguồn Cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng

quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào

Nguồn cacbon được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong nuôi cấy là

đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho

saccarose nhưng chúng thường nghèo hydratcacbon so với nhu cầu của thực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [14]

2.4.2 Chất khoáng

Khoáng đa lượng:

- Nguyên tố khoáng đa lượng gồm: N, P, K, S, Mg và Ca được sử dụng

với hàm lượng cao (thường là trên 30mg/l), nhằm cung cấp các chất khoáng cần thiết để cấu tạo tế bào, mô thực vật Các nguyên tố nguyên tố khoáng này

được cung cấp ở dạng muối dễ tan như: NH4NO3, KH2PO4, KNO3, MgSO4, CaCl2, riêng lưu huỳnh được cung cấp dưới dạng muối tan có chứa các ion dương như: MgSO4, FeSO4, ZnSO4, MnSO4, CuSO4 Tùy từng môi trường mà thành phần và các tỷ lệ các muối khoáng được cung cấp khác nhau Môi trường chứa nhiều N thích hợp cho việc hình thành chồi, môi trường giàu K

- Canxi (Ca) trong môi trường cung cấp dưới dạng muối Canxi nitrat: Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O [14]

- Magie (Mg) cung cấp cho môi trường thường ở dạng MgSO4.7H2O

- Các ion Na+ và Cl- cần ở hàm lượng thấp và được đưa vào môi trường cùng với các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường

Khoáng vi lượng:

Các khoáng vi lượng được sử dụng với hàm lượng thấp (thường là dưới 30mg/l) nhằm cung cấp đầy đủ các chất khoáng cho môi trường Khoáng vi lượng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy mặc dù là sử dụng với nồng độ thấp nhưng nó đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự hoạt động của các enzyme Các nguyên tố vi lượng được dùng trong nuôi cấy mô

tế bào là Fe, Bo, Mn, I, Zn, Cu, Ni, Co Chúng cung cấp dưới các dạng muối: KI,

FeSO4, ZnSO4, CuSO4, MnSO4, Na2MoO4, CoCl2, H2BO4, NiCl2 [14]

- Sắt (Fe): thiếu Fe thì tế bào mất khả năng phân chia, thiếu Fe có thể

làm giảm hàm lượng RNA và giảm khả năng sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng khả năng tổng hợp DNA và acid amin tự do dẫn đến giảm phân bào Fe trong môi trường thường được đưa vào dưới dạng muối FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3, Tuy vậy, chúng sẽ bị kết tủa và mẫu nuôi cấy khó hấp thụ các loại muối này Do đó, phải cho thêm vào môi trường nuôi cấy Na2EDTA (Sodium ethylene diamine tetracetate), để tạo muối phức NaFeEDTA (dạng selat) có chứa Na, Fe và được nuối cấy mô hấp thụ dễ dàng [14]

- Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm hàm lượng acid amin tự do và

DNA tăng lên, nhưng hàm lượng RNA và quá trình sinh tổng hợp protein giảm dần dẫn đến kém phân bào [14]

- Bo (B): thiếu B trong môi trường gây biểu hiện như thừa Auxin vì B

làm cho các enzyme Auxin Oxydase là enzyme ức chế Auxin trong tế bào

giảm đi Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa nhanh, nhưng là mô sẹo xốp, tái sinh kém [14]

- Molyppen (Mo): tác động trực tiếp quá trình trao đổi chất trong tế bào [14]

2.4.3 Vitamin

Các loại mô, tế bào thực vật có khả năng tự tổng hợp hầu hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng, do đó phải bổ sung thêm các vitamin vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B5, B6, B9, , các vitamin myo-inositol đóng vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp thành tế bào, các vitamin này thường được dùng với lượng lớn: 50-

100mg/l Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và chúng cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào Nói chung các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi hàm lượng thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp

Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic acid, trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho cho

sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong nuôi cấy mô

- Inositol thường được nói đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp

- Vitamin B1 (Thiamine.HCl, Aneurin): Là một chất bổ sung rất cần

cho môi trường nuôi cấy Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1

bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân tử vit B1 Vì vậy không nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc chẳng hạn

- Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin): Là tiền chất của

pyridoxal-phosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau:

Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate

- Myo-Inositol (Bios I): Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, cụ

thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic và pectine Inosit là chất bền vững khi khử trùng Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 mg/l Khi phân tích thành phần của nước dừa người ta thu được inosit trong một phân đoạn trung tính

- Nicotinic acid và pyridoxine: thường được bổ sung vào môi trường

nuôi cấy nhưng có thể thay thế bằng các vitamin khác cho sự sinh trưởng của

tế bào ở nhiều loài Các vitamin khác như folic acid, ascorbic acid, vitamin E

(tocophenol), và ρ-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong nuôi cấy mô

và tế bào, đặc biệt khi tế bào sinh trưởng ở mật độ quần thể rất thấp Nói chung, các vitamin này được bổ sung trong khoảng 0,1-10,0 mg/l

2.4.4 Các chất điều hòa sinh trưởng

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin là rất cần thiết

để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức

sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay

đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội

sinh của chúng Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

2.4.4.1 Nhóm auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H-

indole-3-acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA),

1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA) IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) không có tác dụng Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram), và 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba) Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng [9], [14]

Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giãn nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất trương Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ

Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo,

đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của

mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó

được phối hợp sử dụng với các cytokinin

Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric axid), IAA (3-indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic axid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyaxetic axid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic axid) Trong

số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng

Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được khái quát dưới đây:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng

Cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác

là ethylene Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô

- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

- Kích thích tạo chồi bất định (ở hàm lượng thấp)

- Tạo phôi soma (2,4-D)

2.4.4.2 Nhóm cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6 -dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-

(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là

các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng [8]

Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea Hiệu quả đặc biệt của các hợp chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được

nghiên cứu thêm

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái

(morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 mg/l kích thích sự tạo thành

callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 mg/l chúng sẽ kích thích tạo

chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả

về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định

- Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau

khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi Trong cơ thể sống không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa

- Trong tự nhiên cũng tồn tại một hormone phân bào khác, Letham là

người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea: Ngô)

- Tương tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin

Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là:

- 6-Benzylaminopurine (BAP): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với

kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất [14]

Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa

chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở hàm lượng cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

2.4.5 Agar

- Là một loại Polysaccarit thu được từ một số loại tảo (có trong rau câu)

được dùng làm chất độn giúp cho môi trường đông đặc lại Agar tan ở nhiệt độ

1000C và đông đặc lại ở 450C Trong môi trường quá acid (pH<4,5) Agar không

có khả năng đông đặc Hàm lượng Agar thường dùng là 0,4-0,8% tùy thuộc từng loại môi trường [14]

2.4.6 pH của môi trường

- Là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng lớn đến khả năng trao đổi chất trong

tế bào Các hợp chất đặc biệt mẫn cảm với pH là: NAA, GA3, các vitamin Thông thường pH của môi trường nuôi cấy nằm trong khoảng 5,5 - 5,8 Nếu

pH >7 hoặc <4,5 đều ức chế cho quá trình sinh trưởng, phát triển của mô, tế bào Để điều chỉnh pH của môi trường người ta thường dùng NaOH 1M, HCl

1M

2.4.7 Điều kiện vô trùng

- Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của

nuôi cấy mô in vitro Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay

là dùng các chất hoá học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết

định Tuy vậy, nếu tìm được hàm lượng và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ

lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: HgCl2 0,1%, nước Clolox, cồn 700, Ca(ClO)2…để khử trùng

Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cấy

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Là đoạn thân non, bánh tẻ của cây thìa canh được thu thập từ một số

hộ ở Tỉnh Thái Nguyên và Hà Nội

3.1.1 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp tạo vật liệu vô trùng, khả năng tái sinh nhân nhanh và ra rễ Dây Thìa Canh bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

- Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của cây Dây Thìa Canh giai

đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khoa CNSH & CNTP -

Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014

3.3 Hóa chất và thiết bị

3.3.1 Hóa chất

- Hóa chất khử trùng (C2H5OH, NaClO, HgCl2)

- Môi trường MS cơ bản, WPM, B5