3.1. Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma sinh chitinase ngoại bào mạnh mạnh
Dựa trên nguồn nấm Trichoderma đã được Phạm Thanh Hòa (2009) thu thập và phân lập [5]. Chúng tôi tiến hành tuyển chọn chủng có hoạt độ enzyme chitinase mạnh, vòng phân giải chitin được xác định sau 96 giờ nuôi cấy ở 280C. Kết quả cho thấy hầu hết 43 chủng nấm đều có khả năng sinh tổng hợp chitinase với mức độ khác nhau. Trong đó, chúng tôi tuyển chọn được 5 chủng Trichoderma spp. có hoạt độ chitinase cao nhất dựa vào đường kính và độ sáng của vòng phân giải chitin (bảng 3.1).
Bảng 3.1. Đƣờng kính vòng phân giải chitin của Trichoderma trên môi trƣờng cảm ứng
Chủng Trichoderma spp. Đường kính vòng phân giải chitin(cm)
CH2 3,20b
SH16 2,50c
PQ34 4,07a
TN41 1,70d
TN42 2,07cd
Ghi chú : Các chữ cái khác nhau trong cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p <0,05 .
38
Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy khả năng phân giải cơ chất giữa các chủng
Trichoderma spp. là khác nhau. Hầu hết các chủng đều có đường kính vòng phân giải chitin trên 2 cm. Trong đó, đáng chú ý là chủng CH2 có đường kính trên 3 cm và chủng PQ34 đường kính trên 4 cm. Các chủng CH2, SH16, PQ34, TN41 và TN42 là những chủng có hoạt tính mạnh được chọn lọc và tiếp tục khảo sát hoạt độ (Hình 3.1).
Hình 3.1. Vòng phân giải chitin của các chủng nấmTrichoderma spp.
3.2. Xác định hoạt độ chitinase
Chủng SH16 có hoạt độ chung cao nhất, chủng CH2 có hoạt độ chung thấp nhất. Hoạt độ chung các chủng PQ34, TN41 và TN42 sai khác không có ý nghĩa thống kê.
CH2 SH16 PQ34
39
Bảng 3.2. Hoạt độ chitinase của các chủng Trichoderma spp.
Chủng Trichoderma Hoạt độ chung (u/ml) Hoạt độ riêng (u/mg) CH2 0,042c 0,209b SH16 0,559a 0,748ab PQ34 0,450ab 1,307a TN41 0,179bc 0,659ab TN42 0,439ab 0,964ab
Kết quả bảng 3.1 và 3.2 thấy có sự sai khác, chủng SH16 có đường kính vòng phân giải thấp nhưng hoạt độ riêng cao, ngược lại với chủng CH2 hoạt độ riêng thấp trong khi đường kính vòng phân giải cao. Có thể giữa các chủng khác nhau hoạt tính chitinase biểu hiện ở các mức độ khác nhau. Tuy nhiên khả năng tiết chitinase và hoạt tính chitinase giữa các chủng tuyển chọn không có sự sai khác lớn. So sánh hoạt tính chitinase của các chủng
Trichoderma với kết quả nghiên cứu hoạt độ chitinase ở thực vật, những chủng nấm Trichoderma chúng tôi khảo sát có hoạt độ cao hơn (Nguyễn Thị Ngân Hà, 2008) [4].
40
3.3. Xác định khối lƣợng phân tử của enzyme chitinase
Việc xác định được khối lượng phân tử của chitinase là cơ sở cho việc thiết kế mồi đặc hiệu cho gen này. Kết quả điện di xuất hiện nhiều băng tương đối rõ. Điều này chứng tỏ hàm lượng protein tổng số ở hầu hết các chủng tương đối nhiều.
Hình 3.2. Điện di SDS và điện di cơ chất
Để xác định khối lượng phân tử của chitinase, chúng tôi tiếp tục tiến hành điện di cơ chất và nhuộm bằng thuốc thử Lugol để phát hiện băng có hoạt tính chitinase. Sau khi nhuộm, thuốc thử Lugol bắt màu với chitin tạo màu trên gel điện di. Tại những băng có hoạt tính chitinase, chitin ở đó bị phân giải. Do vậy, tại những băng đó không xuất hiện màu mà xuất hiện một vệt sáng, trong suốt.
Kết quả điện di cơ chất được trình bày ở hình 3.2 cho thấy tất cả các chủng đều xuất hiện băng không có màu tương ứng với vị trí khoảng 42 kDa. Như vậy, các chủng CH2, SH16, PQ34, TN41 và TN42 đã sản xuất ra chitinase khối lượng 42 kDa (Chit42 ). Khi nuôi các chủng Trichoderma spp. trong môi trường gồm chitin và một số loại muối khoáng, để sử dụng được nguồn dinh