TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CHO HAI ENZYME ENDOGLUCANASE (EGI, EGII) CỦA Trichoderma reesei TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris

TRẦN THỊ HÒA TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CHO HAI ENZYME ENDOGLUCANASE EGI, EGII CỦA Trichoderma reesei TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris Chuyênngành: Vi Sinh Vật Học Mãsố

TRẦN THỊ HÒA

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CHO HAI ENZYME ENDOGLUCANASE (EGI, EGII)

CỦA Trichoderma reesei TRÊN HỆ THỐNG

NẤM MEN Pichia pastoris

Chuyênngành: Vi Sinh Vật Học

Mãsố: 60-42-40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUỐC BÌNH

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2012

Việc tuy nhỏ không làm chẳng bao giờ nên.‖

Cảm ơn Ba Mẹ đã cho con cuộc sống, tình yêu và niềm tin để con luôn vững bước trên con đường mà mình đã chọn

Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô trường Đại học Khoa học Tự nhiên

TP HCM đã nhiệt tình dạy dỗ và thổi niềm nhiệt huyết đam mê cho sinh viên chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quốc Bình đã dành nhiều thời gian hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn ThS Hồng Phước Toàn đã luôn nhiệt tình động viên và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này

Đồng thời tôi cũng xin gởi lời cảm ơn tới anh Cường, chị Thủy, chị Thuần, chị Hoa, hai em Hiếu và Nga cũng như các bạn ở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM, cảm ơn các bạn Minh và Phong lớp 05CS đã luôn chia sẻ và giúp đỡ tôi

Cảm ơn Người bạn đồng hành đã luôn động viên và chia sẻ với tôi trong suốt thời gian qua

Đặc biệt, Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Trung tâm CNSH TP HCM đã đồng ý cho triển khai và cấp kinh phí thực hiện nghiên cứu này

Với tất cả tấm lòng, Tôi xin chân thành cảm ơn

Trần Thị Hòa

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm các enzyme cellulase của T reesei 10

Bảng 2.1 Các mồi sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 32

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối DNA và plasmid pJET 1.2 33

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 35

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI và NotI 35

Bảng 2.6 Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% 43

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc nấm men tái tổ hợp trên môi trường YPD chứa kháng sinh G418 63

Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng Pichia tái tổ hợp 66

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thành phần và cấu trúc lignocelluloses của thực vật 3

Hình 1.2 Mô hình hoạt động của cellulase 5

Hình 1.3 Mô hình tác động của hệ enzyme cellulase trên cellulose 6

Hình 1.4 T reesei 8

Hình 1.5 Cấu trúc vùng trung tâm xúc tác của EGI 11

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc CBD ở EGI của T reesei 12

Hình 1.7 Mô hình cấu trúc 3D của enzyme EGI và EGII 14

Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulase 16

Hình 1.9 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí AOX1 18

Hình 1.10 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4 19

Hình 2.1 Thang chuẩn DNA 23

Hình 2.2 Thang chuẩn protein 24

Hình 2.3 Bản đồ plasmid tạo dòng pJET1.2 25

Hình 2.4 Bản đồ plasmid biểu hiện pPIC9K 26

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả quá trình OE-PCR của hai gen mã hóa EGI, EGII 31

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các exon của gen egl1 và egl2 44

Hình 3.2 Kết quả điện di khuếch đại các DNA đầy đủ của egl1 và egl2 45

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch egl1 và egl2 45

Hình 3.4 Cấu trúc plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl1 48

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E coli DH5α mang plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 với cặp mồi pJET-F/pJET-R 49

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra các dòng E coli DH5α mang plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 với các cặp mồi trong 50

Hình 3.7 Điện di phản ứng cắt plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 bằng enzyme cắt EcoRI và NotI 50

Hình 3.8 Cấu trúc plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 58

vi

Hình 3.9 Kết quả điện di PCR khuẩn lạc xác định các dòng E coli DH5α mang pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 với cặp mồi AOX1F/AOX1R 59 Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt giới hạn các plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K- egl2 bằng enzyme EcoRI/NotI và BspEI 60 Hình 3.11 Kết quả biến nạp plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 vào

P pastoris 62 Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của các plasmid pPIC9K-egl1và pPIC9K-egl2 vào bộ gen P pastoris GS115 64 Hình 3.13 Vòng phân giải CMC của các dòng P pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo 65 Hình 3.14 Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào P pastoris biểu hiện EGI, EGII 68 Hình 3.15 Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào của P pastoris tái tổ hợp EGII theo thời gian 69 Hình 3.16 Kết quả xác định hàm lượng protein EGI, EGII trong dịch nuôi cấy P pastoris tái tổ hợp tại thời điểm 96 giờ 70

iv

DANH MỤC VIẾT TẮT

AOX: Alcohol Oxidase

BSA: Bovine Serum Albumin

BMGY : Buffered Glycerol-complex

BMMY : Buffered Methanol-complex

CBD: Cellulose Binding Domain

CMC: Carboxylmethyl Cellulose

DNS: 3,5-Dinitrosalicylic Acid

EGI: Enzyme Endoglucanase I

EGII: Enzyme Endoglucanase II

kDa: Kilodalton

LB: Luria Beteri

Mut: Methanol Utilisation

NCBI: National Center for Biotechnology Information

OE-PCR: Overlap Extension PCR

PDB RCDB: Protein Data Bank

PCR: Polymerase Chain Reaction

PDB/PDA: Potato Dextrose Broth / Potato Dextrose Agar

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TE buffer: Tris- EDTA buffer

VTCC: Vietnam Type Culture Collection

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, vấn đề an ninh năng lượng

và biến đổi khí hậu… là những nguyên nhân chính khiến các nước trên thế giới tìm mọi cách phát triển các nguồn nguyên liệu thay thế, trong đó có nhiên liệu sinh học Chiến lược phát triển bioethanol từ vật liệu hữu cơ đang được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều quốc gia Tổng sản lượng bioethanol toàn thế giới ngày càng tăng lên, năm 2010 đạt 86,9 tỷ lít, tăng 75% so với năm 2007 (thống kê của RFA, 2011) Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol hiện nay vẫn chủ yếu từ tinh bột

và đường, dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, đồng thời còn ảnh hưởng đến vấn

đề an ninh lương thực Trong khi đó, lignocellulose từ rơm rạ, bã mía, vỏ bắp, lá khô, mùn cưa,… là những phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp phổ biến, nếu nguồn nguyên liệu này được tận dụng trong sản xuất bioethanol sẽ mang lại nguồn lợi lớn

về mặt kinh tế và góp phần giảm ô nhiễm môi trường

Điều kiện tiên quyết để sử dụng lignocellulose trong sản xuất ethanol là thu nhận hiệu quả sản phẩm thủy phân glucose từ cellulose, thành phần chính của lignocellulose Tuy nhiên, nếu sử dụng enzyme để thủy phân cellulose thì chi phí cho giai đoạn này chủ yếu ở khâu sản xuất enzyme cellulase Do đó, nghiên cứu cải thiện hoạt tính và phương pháp thu nhận enzyme nhằm giảm chi phí sản xuất là điều

rất cần thiết

T reesei được đánh giá là một trong các sinh vật có khả năng tổng hợp

cellulase với hoạt tính cao [23] Nhưng hiện nay công nghệ sản xuất enzyme cellulase ở nước ta chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy bán rắn nên hiệu quả không cao và khó áp dụng ở quy mô công nghiệp Ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng lớn

Trên cơ sở đó đề tài: ―Tạo dòng và biểu hiện các gen mã hóa cho hai enzyme

endoglucanase (EGI, EGII) của Trichoderma reesei trên hệ thống nấm men Pichia

pastoris” được tiến hành với mục tiêu nghiên cứu khả năng biểu hiện hai gen egl1

- Thu nhận và tạo dòng các gen mã hóa cho enzyme endoglucanase I (egl1)

và endoglucanase II (egl2) từ nấm T reesei

- Chọn lọc các dòng nấm men P pastoris mang nhiều bản sao của các gen

mã hóa egl1, egl2

- Kiểm tra khả năng biểu hiện và hoạt tính hai enzyme EGI, EGII của các

dòng P pastoris mang gen tái tổ hợp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

và pectin cấu thành vách tế bào Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật nhưng không có trong tế bào động vật Ở thực vật, thành phần cellulose thay đổi đa dạng , tùy thuộc vào các nguồn xác bã thực vật khác nhau (rơm từ lúa gạo: 33%, rơm lúa mạch: 44%, rơm lúa miến: 31%, bã mía: 80-85% ) [3]

Hình 1.1 Thành phần và cấu trúc lignocellulose của thực vật [46]

Vị trí C-1 OH tại mỗi đầu phân tử glucose là một nhóm aldehyde mang tính khử và vị trí C-4 OH là đầu không có tính khử Các polymer tạo thành cấu trúc vi sợi kết tinh trong đó các chuỗi cellulose gắn kết với nhau nhờ liên kết hydro và có

4

tính tổ chức trật tự rất cao nên bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài Ngoài ra vi sợi cellulose còn có vùng vô định hình với cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Nhờ hai vùng này mà cellulose vừa có tính bền vừa có tính linh động, trong đó enzyme cellulase dễ dàng tác động ở vùng vô định hình, còn đối với vùng kết tinh cellulase hầu như chỉ có tác động bề mặt [4, 42]

1.2 Hệ enzyme phân hủy cellulose

Phân hủy cellulose là một quá trình phức tạp với sự tham gia của nhiều enzyme ngoại bào, trong đó enzyme cellulase giữ vai trò chủ đạo Hệ enzyme cellulase ngày càng được phát hiện ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau như: thực vật, động vật, côn trùng, nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn Cellulase được tiết ra ở thực vật để loại bỏ lá và hoa già yếu, trong quá trình chín trái cũng như trong quá trình biệt hóa của các mô mạch và tăng trưởng của vách tế bào thực vật Trong đó cellulase tiết ra ở động vật và côn trùng chủ yếu là do hệ vi sinh vật cộng sinh với chúng Hệ enzyme cellulase được tìm thấy

phổ biến nhất là ở các nấm như: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Fusarium,

Phanerochaete và vi khuẩn: Clostridium, Cellulomonas, Thermobifida

(Thermomonospora) và Streptomyces [4, 54]

Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên được chia thành ba nhóm sau [4]:

- Endoglucanase hay 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) phân cắt liên kết -1,4-glucoside ở bất kỳ vị trí nào bên trong chuỗi cellulose tạo

ra nhiều oligosaccharide để exoglucanase tác động lên; Endoglucanase hoạt động chính ở vùng vô định hình và tác động yếu ở vùng kết tinh

- Exoglucanase hay 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) phân cắt các liên kết từ các đầu mút của chuỗi polysaccharide tạo các cellobiose; Exoglucanase có thể tác động phân hủy cellulose ở vùng kết tinh

- -glucosidase hay -D-glucoside glucohydrolase hay cellobiase (EC 3.2.1.21) phân cắt các cellobiose và các oligosaccharide hòa tan (DP < 6 – mức polymer hóa) thành D-glucose (cellohexose)

Cấu trúc cellulase bao gồm ba domain giữ chức năng khác nhau (hình 1.2) Thứ nhất là trung tâm hoạt động (catalytically active core) có dạng hình cầu lớn,

5

cấu trúc tự nhiên của trung tâm hoạt động quy định đặc tính xúc tác, độ chuyên biệt

cơ chất và sản phẩm tạo thành của enzyme Thứ hai là domain gắn kết với cellulose (cellulose binding domain - CBD), có vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân vùng kết tinh của cellulose Nếu thiếu CBD thì khả năng thủy phân vùng kết tinh giảm đi đáng kể Các enzyme endoglucanase và exoglucanase đều bao gồm hai domain liên kết và CBD Cuối cùng, domain liên kết (linker domain) là vùng đệm dài nối CBD với trung tâm hoạt động, đồng thời tăng tính linh động của enzyme [4]

Hình 1.2 Mô hình hoạt động của cellulase [4]

Hệ enzyme cellulase đòi hỏi cả ba nhóm enzyme trên trong quá trình phân hủy cellulose (hình 1.3) Hoạt tính chung khi các enzyme hoạt động hiệp lực cao hơn hẳn so với hoạt động riêng lẻ của từng enzyme Có ba dạng hiệp lực đƣợc đƣa

ra là: endo-exo, exo-exo và dạng nội phân tử Trong dạng hiệp lực endo-exo, các endoglucanase phân cắt ngẫu nhiên tạo thành các chuỗi ngắn hơn để exoglucanase

tiếp tục phân giải Trong dạng exo-exo ở T reesei, exoglucanase I tác động ở đầu

khử của chuỗi cellulose còn exoglucanase II tác động ở đầu không khử của

Trung tâm xúc tác

Cellulose

6

cellulose Đối với dạng hiệp lực nội phân tử, khi domain hoạt động đƣợc gắn kết với CBD thì có hoạt tính cao hơn hẳn khi chúng bị tách khỏi domain CBD [38]

Hình 1.3 Mô hình tác động của hệ enzyme cellulase trên cellulose [31]

Dạng cấu trúc tồn tại là đặc điểm khác biệt duy nhất giữa hệ enzyme cellulase của nhóm vi sinh vật hiếu khí và nhóm vi sinh vật kỵ khí Ở nhóm nấm sợi, xạ khuẩn

và một vài vi khuẩn hiếu khí thì các enzyme cellulase đƣợc tiết ra ngoại bào ở dạng

tự do trong khi hệ enzyme cellulase ở nhóm vi khuẩn kỵ khí tồn tại ở dạng phức hợp đƣợc gọi là cellulosome gắn trên màng tế bào Sự khác biệt giữa hai hệ cấu trúc cellulase là do vi sinh vật kỵ khí bị giới hạn năng lƣợng so với vi sinh vật hiếu khí nên chúng cần phải giữ lại sản phẩm thủy phân cellulose Các vi sinh vật kỵ khí gắn chặt với cellulose nhờ phức hệ cellulosome, sản phẩm phân giải sẽ đi vào vùng không gian giới hạn giữa cellulose với vi sinh vật và đƣợc sử dụng trong các quá trình biến dƣỡng khác Trong khi đó ở hệ cellulase tự do, các sản phẩm phân giải có thể đƣợc sử dụng bởi nhiều loài sinh vật khác nhau [54]

1.3 Ứng dụng của enzyme cellulase

Cellulase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dệt, giặt tẩy nhƣ làm sáng, làm mềm vải và giảm độ thô của vải Trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy,

7

cellulase giúp làm sáng giấy và loại bỏ mực in Cellulase cũng được sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc để làm giảm độ nhớt cửa thức ăn có chứa beta-glucan của lúa mì và lúa mạch Bên cạnh đó, cellulase cũng được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến bia, rượu, nước trái cây và sản xuất bánh kẹo cũng như được ứng dụng trong tách chiết dầu oliu, carotenoid Trong nông nghiệp các enzyme này còn được dùng để kiểm soát dịch hại nhờ khả năng phân hủy vách tế bào nấm bệnh từ

đó ức chế sự phát triển của chúng Ngoài ra cellulase còn được ứng dụng trong tạo

tế bào trần nấm hay thực vật Nhờ khả năng gắn với cellulose mà CBD được sử dụng như một thẻ ái lực trong tinh sạch protein tái tổ hợp Đặc biệt nhờ khả năng phân hủy cellulose thành đường đơn nên các enzyme cellulase có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sản xuất ethanol sinh học [24, 53]

Sản xuất ethanol từ cellulose mang lại nhiều lợi ích cho ngành nhiên liệu sạch như: hạn chế lượng CO2 và N2O làm giảm mức ô nhiễm khí thải, giảm hiệu ứng nhà kính và giảm lượng xăng dầu tiêu thụ đồng thời tận dụng được các phụ phế phẩm có chứa cellulose trong nông-lâm nghiệp [53]

Hiện nay đã có nhiều nước nghiên cứu sản xuất bioethanol như Brazil, Hoa

Kỳ, Khối liên minh Châu Âu, Canada, Thái Lan, Úc, Trung Quốc, Colombia, Ấn

Độ, Việt Nam,… Trên thế giới sản lượng bioethanol tăng lên hàng năm Theo số liệu thống kê của Hiệp hội Nhiên liệu tái sinh (RFA - Renewable Fuels Association)

từ năm 2007 đến 2010 sản lượng cồn sinh học thế giới liên tục tăng từ 49,6 tỷ lít lên 86,9 tỷ lít Trong đó, Hoa Kỳ có sản lượng cao nhất và ở vị trí thứ hai là Brazil; năm

2010 hai nước này đóng góp 50 và 26 tỷ lít bioethanol, chiếm 88% sản lượng bioethanol thế giới (Thống kê của RFA, 2011)

1.4 Tổng quan về Trichoderma reesei

1.4.1 Vị trí phân loại

Ngành: Nấm túi (Ascomycota) Phân ngành: Pezizomycotina

8

Hình 1.4 Trichoderma reesei

a: Nấm T reesei sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA [6]; b: sợi nấm T reesei

T reesei (dạng teleomorph Hypocrea jecorina) thuộc ngành nấm túi

(Ascomycota) Nấm T reesei được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme công

nghiệp như cellulase và hemicellulase nhằm phân hủy các polysaccharide của vách

tế bào thực vật T reesei được Reese và Mandel phát hiện trong thời kì chiến tranh thế giới thứ hai [32] Hiện nay bộ gen của T reesei đã được giải mã với kích thước

34Mbp và 9129 gen mã hóa [32]. Các thông tin từ bộ gen được giải mã của

T reesei tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu chuyên sâu về loài nấm này.

1.4.2 Hệ enzyme cellulase của T reesei

T reesei là loài nấm sợi quan trọng trong sản xuất enzyme cellulase Nhiều

nghiên cứu cho thấy đây là sinh vật có khả năng phân hủy cellulose mạnh do chúng tạo được lượng lớn enzyme cellulase có hoạt tính xúc tác cao [23]

Theo Saloheimo (1997), hệ enzyme cellulase của T reesei bao gồm 2

enzyme thuộc nhóm exoglucanase (CBHI và CBHII), 8 enzyme thuộc nhóm endoglucanase (EGI, EGII, EGIII, EGIV, EGV, CEL5B và CEL61B) và 2 enzyme nhóm -glucosidase (BGLI và BGLII) Trong đó exoglucanase chiếm 70-80%,

9

endoglucanase chiếm khoảng 20% và -glucosidase chiếm khoảng 1% thành phần trong hệ enzyme cellulase (bảng 1.1) [48, 51] Ba nhóm enzyme này tác động bổ trợ

lẫn nhau để chuyển hóa cellulose thành đường một cách hiệu quả nhất Ngoài ra T

reesei còn có các protein không phải enzyme như swollenin (SWO) có tác dụng hỗ

trợ phân hủy cellulose thông qua tác động phá vỡ cấu trúc tinh thể, từ đó giúp các enzyme cellulase dễ dàng hoạt động hơn trong quá trình phân hủy cellulose [51]

Như các sinh vật khác, các enzyme cellulase của T reesei cũng được điều

hòa ở nhiều cấp độ khác nhau nhưng hầu hết vẫn ở mức phiên mã Theo Ilmen (1997) và Foreman (2003), các gen mã hóa các enzyme cellulase khác nhau được đồng điều hòa biểu hiện, nghĩa là ở tất cả các môi trường chúng đều biểu hiện với tỉ

lệ tương đối như nhau Sự điều hòa biểu hiện cellulase theo nguồn carbon biến dưỡng - CCR (carbon catabolite regulation) có thể xảy ra ở nhiều mức độ như: tiếp nhận chất cảm ứng, hình thành chất cảm ứng và ức chế trực tiếp cellulase hoặc sự biểu hiện các yếu tố phiên mã Cellulase được điều hòa dương thông qua các yếu tố hoạt hóa phiên mã XYR1 (xylanase regulator 1), ACE2 (activator of cellulases 2), phức hợp HAP (heme activator protein) và được điều hòa âm thông qua các yếu tố CRE1 (catabolite repressor) và ACE1 (activator of cellulases 1) Ngoài ra cellulase còn được kiểm soát ở mức nhiễm sắc chất bởi protein methyltransferase LAE1 [51] Enzyme cellulase được sự cảm ứng bởi cellulose hay LAE1 các nguồn carbon khác như: sophorose, lactose, sorbitol, glycerol… trong đó sophorose có tính cảm ứng biểu hiện cao nhất, còn glucose ức chế sự biểu hiện của hệ enzyme cellulase [23, 50]

10

Bảng 1.1 Đặc điểm các enzyme cellulase của T reesei [5, 23, 49]

Nhóm enzyme Tên enzyme a Gen mã

hóa

Họ GH Kích

thước (amino acid)

Khối lượng phân tử * (kDa)

Điểm đẳng điện (PI)

Vị trí CBD

Tỷ lệ trong cellulase (%)

EGIII/Cel 12A egl3/cel12a GH12 218 25 7.5 - <1 Reinikainen, 1994

EGIV/Cel 61A egl4/cel61a GH61 344 55 e C e Karlsson , 2001 EGV/Cel 45A egl5/cel45a GH45 225 23 e C e Reinikainen, 1994

11

1.4.3 Đặc điểm cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của enzyme endoglucanase I (EGI) và endoglucanase II (EGII)

1.4.3.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng

EGI và EGII là hai enzyme quan trọng trong hệ thống phân hủy cellulose

Mỗi loại enzyme chiếm khoảng 10% lượng cellulase tiết ra ở T reesei Đã có một

số nghiên cứu về đặc điểm cũng như hoạt tính các endoglucanase của T reesei Suominen (1993) chứng minh rằng khi thiếu EGI thì hoạt tính endoglucanase trong

dịch nuôi cấy giảm khoảng 25% và sự vắng mặt EGII làm hoạt tính endoglucanase giảm 55% [36, 52] Từ đó, cho thấy hai enzyme EGI và EGII quyết định hầu hết

hoạt tính endoglucanase của T reesei

Cấu trúc của enzyme EGI và EGII đều bao gồm 3 domain chức năng: trung tâm xúc tác, domain gắn kết với cellulose (CBD) và domain liên kết

Trung tâm xúc tác (Catalytic Core)

Endoglucanase có tác động phân cắt ngẫu nhiên ở vùng vô định hình của cellulose Cấu trúc phân tử của các endoglucanase tương tự với exoglucanase I và exoglucanase II Tuy nhiên, sự khác biệt chính là ở domain xúc tác Endoglucanase

I có vùng xúc tác mở không giống với dạng đóng ở exoglucanase I Nhờ có cấu trúc

mở mà sản phẩm thủy phân của endoglucanase đa dạng hơn bao gồm glucose, cellobiose và cellotriose [38]

Hình 1.5 Cấu trúc vùng trung tâm xúc tác của EGI [22]

12

Domain gắn kết cellulose (Cellulose Binding Domain)

CBD được chia thành 3 họ Họ CBDI được tìm thấy ở nấm như T reesei và

họ CBDII và CBDIII tìm thấy ở vi khuẩn CBD có độ bảo tồn khá cao giữa tất cả các enzyme thuộc hệ cellulase đặc biệt là trong cùng một loài Domain CBD có chức năng gắn kết với cơ chất cellulose và duy trì nồng độ cơ chất cao để vùng trung tâm xúc tác hoạt động hiệu quả hơn Khi mất CBD thì hoạt tính enzyme giảm mạnh và khả năng tiếp cận cơ chất giảm đi đáng kể [38]

Họ CBDI ở nấm T reesei có kích thước khoảng 35 amino acid có độ bảo tồn khá cao giữa hai loại cellobiohydrolase và endoglucanase của T reesei Các amino

acid có nhiệm vụ gắn kết với cellulose là 3 acid amin nhóm thơm bao gồm 2 tyrosine và 1 tryptophan liên kết với 2 acid amin phân cực là proline, glutamine hoặc asparagine Các nhóm acid amin này nằm trên 2 phiến beta để các acid amin nhóm thơm có thể gắn với các phân tử đường phía đối diện, trong khi các acid amin phân cực ở phía trên liên kết glycosyl và nhóm hydroxyl của chuỗi cellulose [38]

Sự hiện diện của các acid amin thơm trong liên kết bề mặt đặc trưng cho tương tác carbohydrate – cơ chất [28]

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc CBD ở EGI của T reesei [34]

Vùng liên kết (Linker Region)

Vùng liên kết này có nhiệm vụ nối trung tâm hoạt động và CBD và định hướng không gian cho hai domain này Với kích thước 6–59 amino acid và được glycosyl hóa để bảo vệ cấu trúc và tăng tính linh động, vùng liên kết cử động như những ―lò xo‖ cho phép enzyme di chuyển trên bề mặt cellulose trong suốt quá trình

13

thủy phân Mặc dù giữa các enzyme, độ tương đồng của các vùng này khá thấp nhưng vùng liên kết đều giàu proline và các amino acid chứa nhóm hydroxyl [38] Bằng những đột biến làm ngắn đi hoặc loại bỏ vùng liên kết đã làm giảm mạnh hoạt tính của Cel7A [44, 56]

EGI của T reesei có chiều dài 437 amino acid (aa) với trình tự tín hiệu dài 22

aa EGI tương đồng 45% so với trình tự gen của CBH-I và vùng bảo tồn cao nhất 70% được tìm thấy ở đầu C Sự tương đồng này có thể do hai enzyme này cùng tiến

hóa từ một tổ tiên chung cDNA của gen mã hóa EGI (egl1) có chứa 62,5% G+C

Cùng với enzyme CBH I (Cel7A), CBH II (Cel6A) và EGIII (Cel12A) thì enzyme EGI (Cel7B) cũng đã được xác định cấu trúc bậc 3 [22] EGI có trọng lượng phân tử thực là 50-55kDa và điểm đẳng điện pI 4,5; pH hoạt động tối ưu trong khoảng 4,0 – 5,0

Đặc điểm của enzyme Endoglucanase I của T reesei (mã số P07981) trên cơ

sở dữ liệu protein UniProt như sau:

- Tổng số amino acid là 459 với trật tự cấu trúc như sau, trình tự tín hiệu: 1-22, trung tâm xúc tác: 23- 397, domain liên kết: 398-423 và CBD: 423-459

- Trung tâm xúc tác: E149, E218, E223

- Vị trí glycosyl hóa N78, N164, N204, N208, N394

- Cầu nối disulfide: C431-C448 và C442-C458

a Endoglucanase II

Endoglucanase II (EGII/CEL5A) của T reesei thuộc họ enzyme glycoside

hydrolase 5 (GH5) Trình tự gen mã hóa EGII đã được công bố trên ngân hàng gen

Đặc điểm của enzyme Endoglucanase II của T reesei (mã số P07982) trên cơ

sở dữ liệu protein UniProt nhƣ sau:

- Tổng số amino acid là 418 với trật tự cấu trúc nhƣ sau, trình tự tín hiệu: 1-21, CBD: 22-57, domain liên kết: 58-91 và trung tâm xúc tác: 92-418

- Trung tâm xúc tác: E239, E350

- Vị trí glycosyl hóa: N124

- Cầu nối disulfide: C29-C46 và C40-C56

Hình 1.7 Mô hình cấu trúc 3D của enzyme EGI và EGII

( Cơ sở dữ liệu Protein PDB)

1.4.3.2 Cơ chế hoạt động

Có hai cơ chế lập thể khác nhau trong sự thủy phân của cellulase: thủy phân đảo cấu hình (inverting mechanism) và thủy phân duy trì cấu hình β (retaining mechanism) của liên kết bị phân cắt (hình 1.8) Các enzyme sử dụng cơ chế duy trì

15

cấu hình thường có khả năng chuyển nhóm glycosyl (transglycosylation) trong khi enzyme theo cơ chế đảo ngược thì không [54] Acid/base xúc tác thủy phân liên kết glycosyl thường là nhóm aspartate hoặc glutamate [35] Hai carboxyl chuỗi cạnh bên đều đóng vai trò quan trọng trong cả hai cơ chế Trong cơ chế đảo ngược, một carboxyl chuỗi cạnh bên nhận proton hoạt động như acid xúc tác, một carbonyl cho proton tới oxy của nhóm glycoside Các carboxyl chuỗi cạnh bên khác hoạt động như base, xúc tác loại một proton từ phân tử nước để tiếp cận carbon C1, từ đó đảo ngược liên kết β thành liên kết α Trong cơ chế duy trì cấu hình β, base ―carbonyl’’ xúc tác tiếp cận carbon C1 tạo thành liên kết cộng hóa trị với một glycoside đảo cấu hình, trong khi các acid xúc tác cho proton tới oxy của nhóm glycoside Ở bước thứ hai, một phân tử nước tiến đến carbon C1 một lần nữa và đảo chiều liên kết nhằm duy trì cấu hình ban đầu [54]

Bằng những phương pháp biến đổi hóa học, đột biến điểm định hướng, so sánh trình tự các họ protein và các nghiên cứu cấu trúc về carbonyl chuỗi bên của các glycosyl hydrolase đã phát hiện trước đó, McCarter và Withers (1994) nhận thấy rằng đối với các enzym hoạt động theo cơ chế đảo chiều, khoảng cách giữa các acid và base xúc tác tiềm năng khoảng 9,5 Å trong khi ở các enzyme hoạt động theo cơ chế duy trì cấu hình, khoảng cách này là 5 Å [54]

Họ GH5 là họ cellulase lớn nhất bao gồm khoảng 57 enzyme đa số là các enzyme của vi khuẩn và một số thuộc nấm Trong đó, 52 enzyme là các endoglucanase hoạt động theo cơ chế duy trì cấu hình và 5 enzyme khác là β 1–3 exoglucanase Cấu trúc ba chiều của trung tâm xúc tác có dạng gấp cuộn ống α/β -

kiểu gấp cuộn phổ biến của các protein [54] Endoglucanase II của T reesei thuộc

họ GH5 nên có cơ chế hoạt động duy trì cấu hình của họ enzyme này

Họ GH7 chỉ chứa endoglucanase và exoglucanase của nấm Những enzyme này hoạt động theo cơ chế duy trì cấu hình Cấu trúc trung tâm hoạt động CBHI của

T reesei có dạng sandwich β tạo vị trí hoạt động và các vòng nối với mạch β [33]

Cấu trúc vùng hoạt động lớn hơn cấu trúc thuộc họ 5 và 6 và có một vị trí xúc tác

16

dạng ống chứa đủ cả 7 gốc glucose Endoglucanase I của T reesei cũng có cấu trúc

và cách hoạt động tương tự [22]

Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulase [54]

Cơ chế đảo cấu hình

Cơ chế duy trì cấu hình

17

1.5 Hệ thống biểu hiện protein ở P pastoris

1.5.1 Đặc điểm chung của P pastoris

P pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae, sinh vật eukaryote nên P pastoris

có nhiều thuận lợi để biểu hiện protein của eukaryote Đặc biệt, P pastoris có khả

năng biến đổi protein sau dịch mã, có cơ chế gấp cuộn và tiết protein ra môi trường giúp quá trình tinh sạch dễ dàng trong khi các thao tác kỹ thuật cũng đơn giản như

E coli hay Saccharomyces cerevisiae Bên cạnh đó, P pastoris có mức độ biểu

hiện protein mục tiêu cao và chi phí rẻ hơn so với các hệ thống biểu hiện trên tế bào động vật hoặc baculovirus Protein ngoại lai có thể được sản xuất với hàm lượng

cao hơn so với các chủng S cerevisiae truyền thống P pastoris có thể tăng trưởng

đạt đến mật độ cao nhờ một số yếu tố như alcohol oxidase I (AOX1) - một promoter

điều hòa mạnh của P pastoris [7]

P pastoris GS115 và KM71 đều là các chủng đột biến gen histidinol

dehydrogenase (his4) mất khả năng tổng hợp histidine nên các thể biến nạp có thể

được chọn lọc bằng môi trường khuyết dưỡng histidine [7]

1.5.2 Protein Alcohol Oxidase

P pastoris có hai gen mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2 trong

đó AOX1 chịu trách nhiệm trong hoạt tính alcohol oxidase của tế bào Sự biểu hiện gen AOX1 được điều hòa chặt chẽ bởi chất cảm ứng là methanol kể cả ở nồng độ cao AOX không biểu hiện trong môi trường chứa glucose, glycerol và ethanol nhưng có thể biểu hiện tới 30% protein ngoại lai dưới sự cảm ứng của methanol [7]

P pastoris có khả năng sử dụng methanol như nguồn carbon Bước đầu của

quá trình biến dưỡng methanol là quá trình oxy hóa methanol thành formaldehyde bởi oxy Ngoài formaldehyde, phản ứng còn tạo thành hydrogen peroxide Quá trình biến dưỡng methanol xảy ra trong bào quan chuyên biệt là peroxisome để tránh tác dụng gây độc của hydrogen peroxide Đồng thời hydrogen peroxide còn được phân hủy thành oxy và nước nhờ enzyme catalase [15]

18

Đột biến mất gen AOX1 (chủng MutS) làm giảm hầu hết hoạt tính Alcohol

oxidase của tế bào, do đó làm giảm khả năng biến dưỡng methanol và chỉ tăng

trưởng được trên môi trường nghèo methanol Mut+

(Methanol utilization plus) có khả năng biến dưỡng methanol cao như chủng hoang dại [7]

1.5.3 Tái tổ hợp chuyên biệt vị trí

Vector biểu hiện trong P pastoris được thiết kế tương đồng với locus AOX1 hay locus his4 Giống như ở S cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định quá trình biến nạp vào P pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương đồng trong

bộ gen nấm men DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản sao trong

bộ gen tế bào chủ

a Trao đổi chéo tại vị trí AOX1 hoặc aox1::ARG4

Hình 1.9 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí AOX1

(Manual part no 25-0170: Multi-Copy Pichia Expression Kit, Invitrogen)

Sự sát nhập gen tại vị trí AOX1 (GS115) hoặc aox1::ARG4 (KM71) tạo ra

do sự trao đổi chéo giữa vùng AOX1 trên vector như promoter AOX1, vùng kết thúc phiên mã của AOX1 hoặc vùng downstream của AOX1 (3´ AOX1) (hình 1.9) Kết quả cho một hoặc nhiều bản sao của vector sát nhập vào bộ gen của nấm men

và thu được kiểu hình His+

Mut+ (GS115) hay His+MutS (KM71) Khi làm thẳng

19

vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vùng 5´ hoặc 3´ AOX1 sẽ giúp tăng hiệu quả biến nạp

b Trao đổi chéo tại vị trí his4

Hình 1.10 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4

(Manual part no 25-0170: Multi-Copy Pichia Expression Kit, Invitrogen)

Ở hai chủng GS115 (Mut+) hoặc KM71 (MutS), gen sát nhập tại locus his4

do sự trao đổi chéo giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện (Hình 1.10) Kết quả có thể cho một hoặc nhiều bản sao của vector tại vị trí his4 và

có kiểu hình His+ Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vị trí his4, kiểu

hình Mut+ hay MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His+ biến nạp

1.5.4 Biến đổi sau dịch mã

So với S cerevisiae, P pastoris có thuận lợi hơn trong glycosyl hóa các

protein tiết vì các protein không bị glycosyl hóa quá mức Hai loài nấm men này đều chủ yếu glycosyl hóa ở vị trí N (N-linked glycosyl) và hiếm khi glycosyl hóa ở

vị trí O (O-linked glycosyl) Tuy nhiên ở Pichia quá trình hậu dịch mã gắn thêm khoảng 8-14 gốc đường manose một chuỗi, trong khi ở S cerevisiae khoảng 50-150

- P pastoris có thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần so với S cerevisiae,

khoảng 130 g/l trọng lượng khô [9] và có khả năng phát triển ở pH từ 3 tới 7 do

đó có thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa tác động của protease [45]

- Có promoter mạnh AOX1, lượng protein tạo ra chiếm đến 30% tổng số protein

tế bào [12] Gen mục tiêu sát nhập vào bộ gen của tế bào P pastoris theo con

đường tái tổ hợp tương đồng tạo ra thể biến nạp ổn định

- Chất cảm ứng biểu hiện protein là methanol, rẻ tiền hơn so với chất cảm ứng

của hệ thống biểu hiện E coli là IPTG Thành phần môi trường nuôi cấy đơn

giản, chi phí lên men thấp

- Protein của nấm men này tiết ra môi trường ở mức độ thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protein tái tổ hợp về sau dễ dàng hơn Có khả năng sử dụng methanol như nguồn carbon chính nên trong môi trường có nhiều methanol có

thể hạn chế được sự tạp nhiễm

Nhược điểm

Khi cảm ứng biểu hiện trên hệ thống nấm men P pastoris bằng methanol thì

cần đảm bảo các điều kiện an toàn vì methanol là một độc tố và có thể gây cháy nổ

1.6 Tình hình nghiên cứu thu nhận enzyme cellulase tái tổ hợp trong

và ngoài nước

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Khởi đầu cho nghiên cứu về cellulases của Trichoderma là Reese và Mandel

trong thời kỳ chiến tranh thế giới thứ hai Nhóm nghiên cứu của hai ông tập trung

vào cảm ứng biểu hiện cellulase ở nấm T viride, đồng thời tìm hiểu cơ chế hoạt

21

động của cellulase nhằm chuyển hóa cellulose thành đường Sau đó chủng hoang

dại T viride của Reese được đổi tên thành T reesei (T reesei QM6a) Nhằm nâng cao sản lượng cellulase thu được, đã có nhiều chủng cải biến từ T reesei QM6a

hoang dại như: QM9123, QM9414, MCG77, MCG80, Rut-NG14, Rut-C30, P37, L-27, VTT-D-79124, CL-847 [37]

RL-Với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền, vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các enzyme tái tổ hợp nhằm sản xuất ở quy mô lớn Enzyme cellulase từ nấm mốc đã được tạo dòng biểu hiện trên nhiều hệ thống tế bào khác

nhau như: vi khuẩn E coli, nấm men S cerevisae, nấm men P pastoris

Kwon (1999) đã tạo dòng biểu hiện egl1của T viride HK-75 vào E coli với

kết quả protein thu được là 18,3mg/l hoạt tính EGI tái tổ hợp giảm còn 67,8% so với EGI tự nhiên [25] Nakazawa (2008) cũng nghiên cứu khả năng biểu hiện các trung

tâm hoạt động EGI, EGII, EGIII của T reesei trong E coli [39] Tuy nhiên, do

không có khả năng biến đổi cấu trúc protein sau dịch mã nên hoạt tính enzyme của nấm mốc giảm khi biểu hiện trong hệ thống này

Nhiều nhóm tác giả đã thành công trong nghiên cứu tạo dòng biểu hiện

endoglucanase của Trichoderma trong nấm men như: egl4 [48], egVIII [19] Ganiger

và cộng sự (2008) đã tạo dòng biểu hiện β-1, 6 endoglucanase của T harzianum ở S

cerevisiae Quin và cộng sự (2007) đã biểu hiện egl2 của T reesei trên Saccharomyces cerevisiae; EGII thu được có trọng lượng phân tử 54kDa cao hơn

EGII tạo bởi T reesei 48kDa và còn 88% hoạt tính endoglucanase [43]

Đối với hệ thống P pastoris, trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã

gặt hái nhiều thành công trong việc biểu hiện các enzyme hệ cellulase và hemicellulase

Liu (2006) đã biểu hiện thành công protein lai giữa endoglucanase IV của T reesei với một trung tâm xúc tác trên hệ thống P pastoris; hoạt tính của protein lai này cao gấp 4

lần hoạt tính của enzyme endoglucanase IV tự nhiên, sản lượng thu được là 0.12 g/l

protein [29] Enzyme cellobiohydrolase I (CBH I) của Fusicoccum sp tái tổ hợp được biểu hiện bởi P pastoris có khả năng giữ được 50% hoạt tính sau khi xử lý ở 70-90oC trong 30 phút [21]

22

Hoạt tính β-glucosidase của Aspergillus cao hơn hẳn so với Trichoderma nên

nhằm nâng cao khả năng đường hóa cellulose, Nakazawa (2011) đã chuyển nạp

β-glucosidase 1 của Aspergillus aculeatus vào T reesei và đã thàng công khi biểu hiện

và mô sẹo cây thuốc lá [14] Hooker (2001) đã biểu hiện endoglucanase (E1) của

Acidothermus cellulolyticus và cellobiohydrolase (CBH1) của T reesei ở cây thuốc

lá và khoai tây; những enzyme này được tích trữ trong lá với hàm lượng khoảng 0,05% và 2,6% tổng protein hòa tan [18]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Trong nước đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sản xuất enzyme cellulase

từ T reesei như: Hoàng Quốc Khánh và cộng sự (2007) khi lên men bán rắn T

reesei VTT-D-80133 đã thu nhận cellulase với hoạt tính và hiệu suất sinh tổng hợp

cellulose CMCase (Carboxymethyl cellulase) 280,64IU/g và FPU (Filter Paper Unit) 5IU/g [1] Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2010) nghiên cứu về khả năng xử

lý vỏ cà phê từ cellulase của T viride [2] Phạm Thị Hòa, Quyền Đình Thi và cộng

sự (2011) đã tạo dòng biểu hiện endoglucanase (EglA) của Aspergillus niger VTCC-F021 trên hệ thống P pastoris, hoạt tính đạt 16.24 UI/mg cao hơn so với

EglA hoang dại là 14.1 UI/mg [41]

Dựa trên các nghiên cứu trong và ngoài nước về khả năng sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp cũng như khả năng duy trì hoạt tính enzyme của nấm

Trichoderma cho thấy P pastoris là một hệ thống biểu hiện tiềm năng để chúng tôi

lựa chọn nhằm thu nhận enzyme endoglucanase I và endoglucanase II từ T reesei ở quy mô lớn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

- Chủng Escherichia coli DH5α (Fermentas, Hoa Kỳ)

- Chủng Pichia pastoris GS115 his4 (Invitrogen, Hoa Kỳ)

b Enzyme

- Enzyme cắt giới hạn: EcoRI, NotI, BspEI/Kpn2I (Fermentas)

- Enzyme nối: T4 DNA ligase (Fermentas)

c Kit

- Kit nhân dòng đầu bằng (CloneJET PCR cloning kit - Fermentas)

- Kit tách chiết DNA (DNeasy plant mini kit - Qiagen)

- Kit tinh sạch DNA từ gel agarose (QIAquick Gel Extraction Kit – Qiagen)

- Kit tách chiết plasmid (DNA-spin™ Plasmid DNA Extraction Kit - Intron)

d Các thang chuẩn

Hình 2.1 Thang chuẩn DNA

a: thang S0311 (Fermentas), b: thang S0321 (Fermentas), c: thang 10787 (Invitrogen)

24

Hình 2.2 Thang chuẩn protein

Opti-Protein Marker G252 (ABM)

e Vector

 Plasmid pJET1.2 (Fermentas)

Vector tạo dòng dạng thẳng, có khả năng tiếp nhận đoạn DNA đầu bằng

được tổng hợp từ Pfu DNA polymerase, có trình tự gen mã hóa cho β-lactamase

dùng để chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp trên môi trường có Ampicillin Bên cạnh

đó, plasmid có gen eco47IR gây độc cho tế bào mang vùng trình tự nhận biết của

các enzyme cắt giới hạn trong khung đọc Gen này bị bất hoạt khi có đoạn DNA chèn vào vùng enzyme cắt giới hạn, vì vậy chỉ có khuẩn lạc mang plasmid có mang đoạn chèn mới có thể tăng sinh trên môi trường nuôi cấy

25

Hình 2.3 Bản đồ plasmid tạo dòng pJET1.2

(CloneJET™ PCR Cloning Kit #K1231, Fermentas)

 Plasmid pPIC9K (Invitrogen, Hoa Kỳ)

Vector biểu hiện dùng cho P pastoris GS115, có các đặc điểm sau:

- Có trình tự tiết nhân tố α hỗ trợ việc tiết protein mục tiêu ra ngoài môi trường nuôi cấy

- Có mang gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase giúp tế bào P pastoris

GS115 có khả năng tự tổng hợp histidine, đồng thời giúp chuyển trình tự gen

mục tiêu vào bộ gen của P pastoris

- Có trình tự promoter AOX1 tương đồng với trình tự của AOX1 trong bộ gen

của Pichia giúp chuyển trình tự gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào

- Có trình tự gen kháng Ampicillin dùng để sàng lọc tế bào E.coli tái tổ hợp

- Có gen Tn903 giúp Pichia kháng lại Genticin dùng để chọn lọc tế bào Pichia tái

tổ hợp đồng thời xác định tương đối số bản sao của gen được chèn vào bộ gen

26

của tế bào dựa vào nồng độ Genticin tế bào có khả năng kháng được (4mg/ml tương ứng 7-12 copy)

- Do không có điểm khởi đầu sao chép của nấm men nên khi biến nạp vào trong

tế bào mà plasmid không chèn vào bộ gen sẽ không tồn tại độc lập được trong

tế bào Đặc điểm này giúp bước sàng lọc tế bào mang gen mục tiêu đơn giản hơn Khuẩn lạc nào mọc được trên môi trường có kháng sinh tức là đã có mang trình tự gen mục tiêu trong bộ gen tế bào

- Trình tự cắt duy nhất của SacI, SalI và BspEI (Kpn2I) dùng để làm thẳng vector trước khi chuyển vào tế bào Pichia và tạo dạng tái tổ hợp Mut+ (sử dụng methanol mạnh nên tăng sinh tốt trên môi trường có methanol)

Hình 2.4 Bản đồ plasmid biểu hiện pPIC9K

(Manual part no 25-0170: Multi-Copy Pichia Expression Kit, Invitrogen)

27

Mồi sử dụng trong khuếch đại các gen mã hóa enzyme endoglucanase I bao gồm: CEL1F, RX1E1, FX23E1, RX2E1 dựa trên trình tự gốc từ Genbank (mã số accession: M15665.1) CEL1F là mồi xuôi bao gồm các vị trí nucleotide 77-94 RX1E1 là mồi ngƣợc bao gồm các vị trí nucleotide 760-780 và 851-860, FX23E1 là mồi xuôi bao gồm các vị trí nucleotide 771-780 và 851-867, RX2E1 là mồi ngƣợc bao gồm các vị trí nucleotide 1420-1440 và 1441-1497

Mồi sử dụng trong khuếch đại gen mã hóa enzyme endoglucanase II bao gồm: CEL2F, RX1E2, FX2E2, CEL2R dựa trên trình tự gốc từ ngân hàng gen (DQ178347.1) CEL2F là mồi xuôi bao gồm các vị trí nucleotide 325-342, RX1E2

là mồi ngƣợc bao gồm các vị trí nucleotide 571-590 và 765-774, FX2E2 là mồi xuôi bao gồm các vị trí nucleotide 581-590 và 765-783, CEL2R là mồi ngƣợc bao gồm các vị trí nucleotide 1692-1671

Hai mồi CEL1F, CEL2F đƣợc thiết kế có gắn vị trí nhận biết của enzyme cắt

giới hạn EcoRI và hai mồi RX23E1, CEL2R đƣợc thiết kế gắn thêm vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn NotI Hai vị trí nhận biết của các enzyme cắt đƣợc thiết lập

ở đầu để tạo điều kiện cho việc sát nhập gen mục tiêu vào vector biểu hiện pPIC9K

Các mồi dùng trong giải trình tự bao gồm: LOWE1, UPE1 cho egl1 và LOWE2, UPE2 cho egl2

Các mồi đƣợc thiết kế bằng phần mềm Oligo Explore 1.1.2 và tính toán thông

số Tm bằng phần mềm FastPCR 6.1.40 Beta 3 dựa trên nồng độ Na+ là 50mM và Mg2+ là 2,0mM

Quy trình tạo dòng các gen mã hóa EGI, EGII từ T reesei vào tế bào

P pastoris bao gồm các bước sau:

- Thu nhận các DNA mã hóa hai enzyme EGI, EGII từ T reesei bằng phương

pháp OE-PCR

- Tạo dòng các gen mã hóa egl1 và egl2 trong tế bào E coli DH5α thông qua

vector nhân dòng đầu bằng pJET1.2

- Thu nhận gen egl1 và egl2 từ vector tái tổ hợp pJET1.2 bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI và NotI; Tạo vector biểu hiện pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2

- Nhân dòng vector pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 vào E coli DH5α

- Biến nạp vector biểu hiện pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 vào tế bào P pastoris

2.2.2 Thu nhận các DNA mã hóa các enzyme endoglucanase I, endoglucanase

II từ T reesei

Chủng T reesei VTCC F1401 được nuôi cấy trên môi trường PDB ở nhiệt độ

28oC với tốc độ lắc 250 vòng/phút Sau 48 giờ lọc qua giấy lọc Whatman để thu sợi nấm và tách chiết DNA tổng số bằng Dneasy Plant mini kit theo quy trình của hãng

30

Qiagen (phụ lục II) Điện di DNA bộ gen trên gel agarose 1% để kiểm tra tính nguyên vẹn và đo độ hấp thu (OD) ở bước sóng 260 và 280 nm nhằm xác định nồng

độ và độ tinh sạch

Từ nguồn DNA bộ gen đã tách chiết, tiến hành thu nhận các đoạn DNA mã

hóa hai enzyme endoglucanase I, II từ T reesei bằng phương pháp overlap

extension PCR (OE-PCR)

Phương pháp OE-PCR

Overlap extension PCR là một phương pháp dùng để tạo đột biến điểm cũng như các ghép nối các đoạn gen nhanh chóng, đơn giản và hiệu quả [16, 20] Các mồi trong được thiết kế có chiều dài khoảng 40 nucleotide mang các vùng trùng lắp cần thiết giữa các exon, thường vùng trùng lắp này khoảng 20 nucleotide [55] Phản ứng PCR đầu tiên được tiến hành nhằm khuếch đại các exon của gen Tiếp theo tiến hành phản ứng PCR lần hai với cặp mồi ngoài và có khuôn là các sản phẩm của lần PCR đầu tiên Sau phản ứng PCR lần hai ta có thể thu được đoạn DNA chỉ chứa các exon

Gen mã hóa enzyme endoglucanase I có 3 exon và 2 intron Riêng do exon thứ ba chỉ có 20 nucleotide nên mồi RX23E1 được thiết kế bao gồm cả exon này và một phần cuối của exon thứ hai Trong khi đó gen mã hóa enzyme endoglucanase II chỉ bao gồm 2 exon nên việc thiết kế mồi ngoài đơn giản hơn Các mồi trong của các gen được thiết kế trùng lắp nhau khoảng 20 nucleotide: mồi ngược của exon thứ nhất chứa khoảng 10 nucleotide đầu tiên của exon thứ hai và mồi xuôi của exon thứ hai được thiết kế bao gồm khoảng 10 nucleotide cuối cùng của exon thứ nhất Cặp

mồi CEL1F/RX1E1 khuếch đại exon 1 của egl1, cặp mồi FX2E1/RX23E1 khuếch đại exon 2 và 3 của egl1, cặp mồi CEL2F/RX1E2 khuếch đại exon 1 của egl2, cặp mồi FX2E2/CEL2R khuếch đại exon 2 của egl2 (hình 2.5)

31

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả quá trình OE-PCR của hai gen mã hóa EGI, EGII

E1: exon 1; E2: exon 2; E3: exon 3; I1: introN 1; I2: intron 2

Qui trình OE-PCR tổng hợp các DNA mã hóa hai enzyme endoglucanase I

và endoglucanase II đƣợc tiến hành qua hai giai đoạn: Phản ứng PCR đầu tiên đƣợc

tiến hành trong 25 chu kỳ nhằm khuếch đại hai exon của mỗi gen Trình tự DNA

mục tiêu đƣợc tổng hợp từ hỗn hợp các exon là sản phẩm của PCR lần một thông

qua phản ứng PCR lần hai Phản ứng PCR lần hai đƣợc thực hiện với 7 chu kỳ

không bổ sung mồi, sau đó bổ sung các cặp mồi ngoài và thực hiện tiếp 25 chu kỳ

để thu DNA có chiều dài nguyên vẹn Cặp mồi ngoài CEL1F/ RX23E1 và

CEL2F/CEL2R lần lƣợt đƣợc dùng để thu nhận DNA của egl1 và egl2 Sản phẩm

của quá trình PCR lần hai đƣợc tinh sạch qua gel bằng kit tinh sạch qua gel của

Qiagen Sản phẩm này đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tạo dòng tiếp theo

PCR 1

PCR 2