Sản xuất Interferon alpha 2b của người (hIFN-α2b) bằng hệ thống nấm men Pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC **** Sản xuất Interferon alpha 2b người (hIFN-α2b) hệ thống nấm men Pichia pastoris GVHD: TS Lê Kim Hòa Nhóm 6: Hoàng Văn Dương Lăng Văn Đức Phạm Thị Bích Phượng Nguyễn Kim Oanh Nội dung Giới thiệu hIFN-α2b Pichia pastoris Tạo dòng biểu hIFN-α2b Lên men Pichia pastoris sản xuất protein hIFN-α2b Lọc tinh protein hIFN-α2b Đông khô protein hIFN-α2b Interferon alpha 2b người (hIFN-α2b) - Gene mã hóa hIFN-α2b nằm 9p22 với chiều dài 498 bp - Protein hIFN-α2b có kích thước 165 aa, trọng lượng phân tử 19,2 kDa - Ứng dụng điều trị viêm gan B, Viên gan C số bệnh ung thư (da, thân…) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=6520 Hệ thống biểu Pichia pastoris - Pichia pastoris eukaryote  cung cấp môi trường thích hợp cho protein tái tổ hợp tiết gấp cuộn thực biến đổi sau dịch mã - Khi Pichia pastoris biểu protein độc tế bào protein trì sản xuất tế bào Pichia pastoris - Có thể biểu protein với hàm lượng từ mg tới g Hệ thống biểu Pichia pastoris - Gen mục tiêu sát nhập vào gen Pichia pastoris theo đường tái tổ hợp tương đồng tạo thể biến nạp ổn định (E coli thực được) - Có promoter mạnh AOX1 Chất cảm ứng Methanol (rẻ chất cảm ứng sử dụng E coli) - Có thể phát triển với mật độ cao nhiều lần so với S cerevisiae - Có khả phát triển pH từ 3-7 QUI TRÌNH SẢN XUẤT hIFN-α2b Tổng hợp gene mã hóa cho hIFN-α2b Cơ chế khuyếch đại gene mã hóa hIFN-α2b phương pháp PCR Nhân dòng gen mã hóa cho hIFN-α2b Gắn gen mã hóa hIFN α2b vào vector pJET1.2 Biến nạp vào E coli DH5α (bằng pp điện biến nạp) KT diện gen (LB có Amp 50μg/ml, PCR với cặp mồi pJET-F/pJET-R, giải trình tự) Thu nhận vector pJET1.2 chứa gene mã hóa hIFN-α2b Thu vector pPIC9K chứa gen hIFN-α2b Biến nạp vào E coli DH5α (điện biến nạp) Gắn gen hIFN-α2b vào vector pPIC9K Thu nhận gen hIFN-α2b (EcoRI NotI) Biểu hIFN-α2b Pichia pastoris Vector pPIC9K chứa gen hIFN-α2b cắt SalI chuyển vào tê bào Pichia pastoris GS115 (bằng pp điện biến nạp) Kiểm tra tế bào chứa protein hIFN-α2b (YPD K/s G418 (4mg/ml) MM có methanol) Kiểm tra biểu protein hIFNα2b (SDS-PHAGE, lai khuẩn lạc với kháng thể đơn dòng) Thu dòng Pichia pastoris biểu mạnh protein hIFN-α2b (Minimal Methanol, 20 o C/72 h 90 men protein hIFN-α2b Lên men Lên Pichia pastoris sản xuất hIFN-α2b Lọc protein hIFN-α2b Lọc protein hIFN-α2b Microfiltration system Lọc protein hIFN-α2b Lọc protein hIFN-α2b Retentate tank Permeate tank Permeate tank Tinh protein hIFN-α2b phút Tinh protein hIFN-α2b thu protein hIFN-α2b có hoạt tính 1,5 × 108 IU/mg Đông khô Trước đông khô Nguyên liệu: protein hIFN-α2b, Manitol, Amonium acetate, NaCl, Tween 80, nước cất -Tiến hành pha chế thành phần bổ sung nước cho đủ thể tích cần - Thử hoạt tính sinh học (tế bào WISH virus EMC) -Kiểm tra nội độc tố Đông khô Quy trình đông khô cho hIFN-α2b • Sử dụng tá chất Manitol • Nhiệt độ cuối sản phẩm 22 oC ToC 6oC Làm đông Thời gian TCS -25oC Quá trình làm đông sản phẩm 1) Giữ lạnh máy đông khô trạng thái -50C 2) Cho thuốc vào tủ đông khô, giữ nhiệt độ -100C (2 giờ) 3) Từ nhiệt độ -100C hạ xuống nhiệt độ -45oC (giữ giờ), hút chân không thời gian Làm khô cấp 1: - Hút chân không từ -45oC lên -10 oC, bảo lưu -11 - Áp suất buồng thây đổi từ 0,06 mbar-0,3 mbar Làm khô cấp - Hút chân không, nhiệt độ điều chỉnh -10 oC nâng lên đạt 22oC - Khi đạt nhiệt độ 22oC giữ 1,5 trước hàn ống - Áp suất buồng thây đổi từ 0,3 mbar-1,3 mbar Kết thúc đông khô Sản phẩm sau đông khô đóng gói với nắp nhôm Bảo quản Ở nhiệt độ - 8oC -> giữ năm Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Hà Văn Cường (2006) , Nghiên cứu quy trình sản xuất thuốc tiêm đông khô methylprednisolon sodium succinate, ĐH Y Dược TP HCM Phạm Thị Kim Trâm (2011), Tạo dòng biểu Interferon alpha 2b người hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris, ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP HCM Tài liệu tiếng Anh A Ayed et al High level production and purification of human interferon alpha 2b in high cell density culture of Pichia pastoris (2008) David R Higgins James M Cregg Methods in molecular biology, vol.103: Pichia protocols Elisabeth Russell et al Harvest of a Therapeutic Protein Product from High Cell Density Fermentation Broths: Principles and Case Study (2007), page 1-58 Magnus Sjoblom Doctoral thesis: Mucin-like Fusion Proteins Produced in Pichia pastoris as Enhancers of Immunogenicity of Recombinant Vaccines Stephen R Hamilton , et al Production of Complex Human Glycoproteins in Yeast Science 301, 1244 (2003) Zhang, Wenhui et al Fermentation Strategies for Recombinant Protein Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris Papers in Biochemical Engineering, paper 11 (2000) Cảm ơn Thầy bạn lắng nghe!!! [...]... khô Sản phẩm sau khi đông khô được đóng gói với nắp nhôm Bảo quản Ở nhiệt độ 2 - 8oC -> có thể giữ được ít nhất 2 năm Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt 1 Hà Văn Cường (2006) , Nghiên cứu quy trình sản xuất thuốc tiêm đông khô methylprednisolon sodium succinate, ĐH Y Dược TP HCM 2 Phạm Thị Kim Trâm (2011), Tạo dòng và biểu hiện Interferon alpha 2b của người trên hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris, ... permeate pressure Lọc protein hIFN- 2b - Sử dụng TFF cho lọc protein tạo ra bằng lên men sử dụng Pichia pastoris vì: + Sản phẩm lên men chứa xấp sỉ 50% các chất rắn + Protein đích được biểu hiện ra ngoài tế bào Sử dụng TFF cho lọc protein hIFN- 2b Lọc protein hIFN- 2b Lọc protein hIFN- 2b Lọc protein hIFN- 2b Microfiltration system Lọc protein hIFN- 2b Lọc protein hIFN- 2b Retentate tank Permeate tank...Lên men Pichia pastoris sản xuất hIFN- 2b Môi trường: BSM: 26.7 mL 85% H3PO4, 0.93 g CaSO4, 18.2 g K2SO4, 14.9 g MgSO4.7H2O, 4.13 g KOH, và 40.0 g glycerol PTM1: 6.0 g CuSO4.5H2O, 0.08 g NaI, 3.0 g MnSO4.H2O, 0.2 g Na2MoO4.2H2O, 0.02 g H3BO3, 0.5 g CoCl2, 20.0 g ZnCl2, 65.0 g FeSO4.7H2O, 0.2 g biotin và 5.0 mL H2SO4 4,35 ml PTM1 được cho vào mỗi lit môi trường BSM Lên men Pichia pastoris sản xuất. .. cho vào mỗi lit môi trường BSM Lên men Pichia pastoris sản xuất hIFN- 2b • BioFlo III fermentor trang bị một bộ vi xử lý để điều khiển DO, nhiệt độ, PH, tốc độ khuấy, tỉ lệ bổ sung môi trường CÁC GIAI ĐOẠN CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN • Tạo sinh khối từ những tế bào đông lạnh Lên men Pichia pastoris sản xuất hIFN- 2b * Chuẩn bị chủng lên men 1 Rã đông tế bào (khoảng 1ml) ở nhiệt độ phòng sau đó nuôi cấy lắc... human interferon alpha 2b in high cell density culture of Pichia pastoris (2008) David R Higgins và James M Cregg Methods in molecular biology, vol.103: Pichia protocols Elisabeth Russell et al Harvest of a Therapeutic Protein Product from High Cell Density Fermentation Broths: Principles and Case Study (2007), page 1-58 Magnus Sjoblom Doctoral thesis: Mucin-like Fusion Proteins Produced in Pichia pastoris. .. protein hIFN- 2b phút Tinh sạch protein hIFN- 2b thu được protein hIFN- 2b có hoạt tính 1,5 × 108 IU/mg Đông khô Trước khi đông khô Nguyên liệu: protein hIFN- 2b, Manitol, Amonium acetate, NaCl, Tween 80, nước cất -Tiến hành pha chế các thành phần và bổ sung nước cho đủ thể tích cần - Thử hoạt tính sinh học (tế bào WISH và virus EMC) -Kiểm tra nội độc tố Đông khô Quy trình đông khô cho hIFN- 2b • Sử dụng... chủng vào fermentor sử dụng ống tiêm vô trùng Quá trình lên men 1 Glycerol Batch • DO tăng cao Hết glycerol • OD600nm = 65-70 2 Glycerol fed-batch • Giải phóng promoter PAOX1 khỏi sự kìm hãm • OD600nm = 110-120 • DO spike: khóa bơm glycerol và đo thời gian xem mất bao lâu để nồng độ oxy hòa tan tăng 10% Khi DO tăng 10%, bơm glycerol lại được mở ra 3 Methanol fed-batch Lọc protein hIFN- 2b Tangential... tích cần - Thử hoạt tính sinh học (tế bào WISH và virus EMC) -Kiểm tra nội độc tố Đông khô Quy trình đông khô cho hIFN- 2b • Sử dụng tá chất Manitol • Nhiệt độ cuối của sản phẩm 22 oC ToC 6oC Làm đông Thời gian TCS -25oC Quá trình làm đông sản phẩm 1) Giữ lạnh máy đông khô trạng thái -50C 2) Cho thuốc vào tủ đông khô, giữ ở nhiệt độ -100C (2 giờ) 3) Từ nhiệt độ -100C hạ xuống nhiệt độ -45oC (giữ ở 5... Immunogenicity of Recombinant Vaccines Stephen R Hamilton , et al Production of Complex Human Glycoproteins in Yeast Science 301, 1244 (2003) Zhang, Wenhui et al Fermentation Strategies for Recombinant Protein Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris Papers in Biochemical Engineering, paper 11 (2000) Cảm ơn Thầy và các bạn đã lắng nghe!!! ... thiệu hIFN- 2b Pichia pastoris Tạo dòng biểu hIFN- 2b Lên men Pichia pastoris sản xuất protein hIFN- 2b Lọc tinh protein hIFN- 2b Đông khô protein hIFN- 2b Interferon alpha 2b người (hIFN- 2b) - Gene... hIFN- 2b (Minimal Methanol, 20 o C/72 h 90 men protein hIFN- 2b Lên men Lên Pichia pastoris sản xuất hIFN- 2b Lên men Pichia pastoris sản xuất hIFN- 2b Môi trường: BSM: 26.7 mL 85% H3PO4, 0.93... biểu Interferon alpha 2b người hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris, ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP HCM Tài liệu tiếng Anh A Ayed et al High level production and purification of human interferon alpha