Nghiên cứu “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 bằng phương pháp lên men chìm” được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 bằng phương pháp lên men chìm.
Kỷ yếu Hội nghị: Nghiên cứu “Khoa học Trái đất Môi trường” DOI: 10.15625/vap.2019.000222 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SR3 BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM Nguyễn Phạm Tuấn1, Bằng Hồng Lam2, Nguyễn Cơng Kha1, Nguyễn Hồi Vững1, Nguyễn Phạm Tú1 Huỳnh Cảm Thủy Trang1 Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, Email: ngphamtuan1983@gmail.com Đại học An Giang, Email: bhlam@agu.edu.vn TÓM TẮT Prodigiosin sắc tố màu đỏ ứng dụng phong phú kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, chống ung thư, ức chế miễn dịch bảo vệ trước tác động tia UV có khả tiêu diệt trùng,… Nghiên cứu “Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 phương pháp lên men chìm” thực nhằm đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 phương pháp lên men chìm Kết nghiên cứu cho thấy, vi khuẩn Serratia marcescens SR3 sản xuất prodigiosin điều kiện mơi trường (LB), thể tích vi khuẩn ban đầu bổ sung (7%, v/v), pH môi trường (pH = 8) thời gian lên men (96 giờ), hàm lượng prodigiosin đạt 488,27 Unit/tế bào Từ khóa: prodigiosin, pH, môi trường, thời gian lên men, Serratia marcescens GIỚI THIỆU Prodigiosin sắc tố màu đỏ tripyrrole tuyến tính chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học thứ cấp tích lũy bên màng tế bào hạt bên tế bào Prodigiosin thu hút nhiều quan tâm khả sử dụng làm màu tự nhiên, khả kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt chất kháng ức chế miễn dịch chống khối u (Tsuji et al., 1992) có khả tiêu diệt côn trùng nghiên cứu báo cáo (Wang et al., 2011) Với tiềm ứng dụng prodigiosin y học thuốc trừ sâu sinh học nên prodigiosin thu hút quan tâm ngày tăng nhà khoa học (Siva et al., 2012) Vi khuẩn Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin phương pháp lên men chìm Tuy nhiên, trình lên men chịu tác động nhiều yếu tố sinh học phi sinh học ảnh hưởng đến suất chất lượng sản phẩm Xuất phát từ thực tế đó, đề tài “Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 phương pháp lên men chìm” thực nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu Dòng vi khuẩn Serratia marcescens SR3 lưu giữ phịng thí nghiệm vi sinh Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang Hóa chất thiết bị: peptone, yeast extract, cân phân tích, máy đo quang phổ, máy đo pH, hóa chất thiết bị cần thiết khác 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL mơi trường dinh dưỡng khác bình tam giác 250 mL, điều chỉnh pH môi trường pH = Chủng mL vi khuẩn nội sinh (mật số tế bào 106 tế bào/mL) môi trường nhân sinh khối, ủ điều kiện nhiệt độ 28±20C ngày Hàm lượng prodigiosin tính dựa theo Darshan Manonmani (2016) có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện thí nghiệm: mẫu vi khuẩn nuôi môi trường lên men với nhiệt độ 28±20C tốc độ lắc 200 vòng/phút 72 Tiến hành thu dịch lọc phương pháp ly tâm với tốc độ 5.000 vịng/10 632 Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019 phút, thu phần cặn Phần cặn ly trích với mL hỗn hợp HCL 1N-methanol (4: 96, v/v) để tế bào vi khuẩn phóng thích prodigiosin Sau đó, hỗn hợp ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/10 phút, phần dịch đo λ = 499 nm Prodigiosin (unit/tế bào) = [OD499 - (1,381 x OD620)]/ OD620 x 1000 OD499: độ hấp thụ chất màu; OD620: độ hấp thụ tế bào vi khuẩn; 1,381: hệ số chuyển đổi 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến q trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL mơi trường dinh dưỡng LB lỏng bình tam giác 250 mL, điều chỉnh pH môi trường khác Chủng mL vi khuẩn nội sinh (mật số tế bào 106 tế bào/mL) môi trường nhân sinh khối, ủ nhiệt độ 28±20C, lắc 200 vòng/phút ngày 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến q trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL mơi trường dinh dưỡng LB lỏng bình tam giác 250 mL, chỉnh pH = Chủng mL vi khuẩn nội sinh môi trường nhân sinh khối, ủ nhiệt độ 28±20C, lắc 200 vòng/phút thời gian nuôi cấy khác 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thể tích ban đầu đến q trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL môi trường dinh dưỡng LB lỏng bình tam giác 250 mL, chỉnh pH = thời gian lên men 96 Chủng vi khuẩn nội sinh môi trường nhân sinh khối với lượng thể tích khác nhau, ủ nhiệt độ 28±20C, lắc 200 vòng/phút ngày 2.3 Phƣơng pháp thống kê Các số liệu xử lý thống kê phần mềm Excel Statghraphics plus 16.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến q trình sinh prodigiosin Các loại mơi trường dinh dưỡng khác ảnh hưởng đến trình sản xuất prodigiosin tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu (Hình 1) Mơi trường LB cho hàm lượng cao với prodigiosin đạt 456,57 Unit/tế bào; môi trường NB, prodigiosin đạt 400,15 Unit/tế bào thấp môi trường đậu tương, prodigiosin đạt 397,33 Unit/tế bào Kết nghiên cứu khác so Giri et al (2004), vi khuẩn Serratia marcescens sản xuất prodigiosin cao môi trường NB (0,52 mg/mL) so với peptone glycerol, hàm lượng prodigiosin đạt 0,02 mg/mL Môi trường LB NB có chứa peptone, thịt men chiết xuất Peptone loại tiêu hóa có sẵn thị trường loại protein thực vật động vật cụ thể, tạo sẵn cho sinh vật dạng peptide acid amin để giúp đáp ứng yêu cầu nitơ, lưu huỳnh, carbon lượng Chiết xuất nấm men thịt có chứa mơ nhân chuẩn (nấm men, thịt bị, não tim,…) chiết xuất cách đun sôi cô đặc thành bột nhão sấy khô thành bột sử dụng nguồn acid amin, vitamin coenzyme, yếu tố tăng trưởng sinh vật Nguyên nhân khác biệt loài sinh vật sản xuất hợp chất màu điều kiện sinh trưởng khác 3.2 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh prodigiosin pH ảnh hưởng đến trình sản xuất prodigiosin nghiên cứu nhà khoa học (Ahmed et al., 2013) Buckland et al (1989), pH mơi trường đóng vai trị quan trọng cho phát triển tế bào vi khuẩn sản xuất hợp chất thứ cấp kích thích kìm hãm hoạt tính enzyme Các mức pH khác mơi trường sử dụng để tối ưu hóa q trình sản xuất prodigiosin từ S marcescens Kết quả, giá trị pH khác cho hiệu sản xuất prodigiosin khác (Hình 2) Cụ thể, prodigiosin sản xuất cao mức pH=8, với giá trị prodigiosin 475,78 Unit/tế bào; mức pH = với prodigiosin đạt 413,59 Unit/tế bào; thấp mức pH=5, prodigiosin đạt 291,19 Unit/tế bào Kết tương tự Giri et al (2004), pH kiềm thích hợp cho q trình sản xuất prodigiosin Ngồi ra, tăng giảm pH môi trường sản xuất mức pH tối ưu cho sản xuất prodigiosin, điều thay đổi hoạt động tất gen chịu trách nhiệm sinh tổng hợp prodigiosin (Sole et al., 1997) pH ảnh hưởng đến trình sản xuất chất màu hai lý do, thứ ảnh hưởng đến tính chất mơi trường nuôi cấy 633 Kỷ yếu Hội nghị: Nghiên cứu “Khoa học Trái đất Môi trường” bao gồm độ hòa tan chất dinh dưỡng, vận chuyển ion hóa thứ hai ảnh hưởng pH đến độ ổn định chất màu Hình Ảnh hưởng mơi trường dinh dưỡng pH mơi trường đến q trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 Hình Ảnh hưởng thời gian lên men thể tích chủng đến trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 3.3 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến trình sinh prodigiosin Thời kỳ lên men đóng vai trò quan trọng sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp vi khuẩn Thời gian lên men khác cho hàm lượng prodigiosin khác (Hình 2) Khi gia tăng thời gian lên men hàm lượng prodigiosin tăng tỷ lệ thuận với Cụ thể, thời gian lên men 96 120 giờ, hàm lượng prodigiosin cao đạt 471,72 Unit/tế bào 480,92 Unit/tế bào; thời gian lên men 72 giờ, hàm lượng prodigisoin đạt 243,19 Unit/tế bào thấp nhất, hàm lượng prodigiosin đạt 116,43 Unit/tế bào thời gian lên men 24 3.4 Ảnh hƣởng thể tích ban đầu đến trình sinh prodigiosin Một tham số quan trọng q trình lên men thể tích chủng ban đầu, thể tích chủng ban đầu cần thiết nghiên cứu sản xuất hợp chất sinh học sử dụng phương pháp lên men chìm Nếu thể tích chủng ảnh hưởng đến tăng trưởng vi khuẩn từ dẫn đến sản xuất khơng đủ chất chuyển hóa sản phẩm cuối cần đạt (Varalakshmi Jaya, 2013) (Hình 2) Hàm lượng prodigiosin đạt cao thể tích cấy ban đầu 7% 10%, với hàm lượng prodigiosin 488,27 Unit/tế bào 485,32 Unit/tế bào; thể tích ban đầu 5% với hàm lượng prodigiosin 469,81 Unit/tế bào thấp thể tích 1% với hàm lượng prodigiosin 400,09 Unit/tế bào Khi thể tích chủng thấp 7% làm giảm hàm lượng prodigiosin sản xuất, nguyên nhân khác biệt không sản xuất đủ sinh khối (thể tích chùng thấp) hình thành chất ức chế ảnh hưởng đến sản phẩm tạo thành (Bilgrami Verma, 1981) KẾT LUẬN Vi khuẩn Serratia marcescens SR3 nguồn sản xuất prodigiosin tự nhiên sản xuất prodigiosin phương pháp lên men chìm Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình ly 634 Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019 trích, tinh bảo quản prodigiosin, kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật gây bệnh, tế bào ung thư prodigiosin điều kiện in vitro in vivo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ahmad WA, Wan Ahmad WY, Zakaria ZA and Yusof NZ, 2012 Appl Bact Pigments Colorant 2012 doi: 10.1007/978-3-642-24520-6 [2] Buckland, B., Gbewonyo, K., Hallada, T., Kaplan, L and Masurekar, P, 1989 Production of lovastatin, an inhibitor of cholesterol accumulation in humans In: Novel Microbial Products for Medicine and Agriculture, A.L.Demain, G.A.Somkuti, JC.Hunter-Cevera and H.W.Rossmoore, eds., 161-169, Elsevier [3] Darshan N, Manonmani HK, 2016 Prodigiosin and its potential applications J Food Sci Technol;52, 5393-5407 doi: 10.1007/s13197-015-1740-4 [4] Giri AV, Anandkumar N and Muthukumaran G, 2004 A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil BMC Microbiol, 4, 11-18 [5] VaralakshmiV., Jaya K, 2013 Optimization of L-Asparaginase production by Aspergillus terreus MTCC 1782 using Bajra seed flour under solid state fermentation International Journal of Research in Engineering and Technology, (9), 121-126 [6] Siva R, Subha K and Bhakta D, 2012 Characterization and enhanced production of prodigiosin from the spoiled coconut Appl Biochem Biotechnol, 166, 187-196 [7] Sole M, Francia A and Rius N, 1997 The role of pH in the glucose effect on prodigiosin production by non-proliferating cells of Serratia marcescens Lett Appl Microbiol 25, 81-84 [8] Tsuji R.F., Magae J., Jamashita M., Nagai K and Yamasaki M, 1992 Immunomodulating properties of prodigiosin 25-C, an antibiotic which preferentially suppresses of cytotoxic T cells J Antibiot 45, 1295-1302 [9] Wang SL, Wang CY and Yen YH, 2011 Enhanced production of insecticidal prodigiosin from Serratia marcescens TKU011 in media containing squid pen Process Biochem, 47, 1684-1690 INVESTIGATING FACTORS AFFECTING PRODIGIOSIN PRODUCTION FROM SERRATIA MARCESCENS SR3 BY SUBMERGED FERMENTATION Nguyen Pham Tuan1, Bang Hong Lam2, Nguyen Cong Kha1, Nguyen Hoai Vung1, Nguyen Pham Tu1 Huynh Cam Thuy Trang1 Biotechnology An Giang Center Email: ngphamtuan1983@gmail.com An Giang University Email: bhlam@agu.edu.vn ABSTRACT Prodigiosin is a red pigment and widely applied as antimicrobial, antifungal, anti-malarial, anti-cancer, immunosuppressant agent, UV protection and disinfestation, This study "Investigating factors affecting prodigiosin production from S marcescens SR3 by submerged fermentation" was conducted to analyze the effect of various factors on prodigiosin production process of S marcescens SR3 by submerged fermentation method The results showed that S marcescens SR3 could produce prodigiosin in LB medium with initial bacterial volume (7%, v/v), pH = 8, fermentation time (96 hours), and prodigiosin content reached 488.27 Unit/cell Keywords: Prodigiosin, pH, Serratia marcescens, medium, time of fermentation 635 ... tích chủng đến q trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 3.3 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến trình sinh prodigiosin Thời kỳ lên men đóng vai trị quan trọng sản xuất chất... hai ảnh hưởng pH đến độ ổn định chất màu Hình Ảnh hưởng mơi trường dinh dưỡng pH mơi trường đến q trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 Hình Ảnh hưởng thời gian lên men. .. chất ức chế ảnh hưởng đến sản phẩm tạo thành (Bilgrami Verma, 1981) KẾT LUẬN Vi khuẩn Serratia marcescens SR3 nguồn sản xuất prodigiosin tự nhiên sản xuất prodigiosin phương pháp lên men chìm Nghiên