TẬP HỢP VÀ CÙNG BIỂU HIỆN NHIỀU GENE MÃ HÓA CHO NHIỀU ENZYME CHỊU NHIỆT TRONG E. COLI, ỨNG DỤNG TRONG SINH CHUYỂN HÓA IN VITRO

40 Phần Công nghệ sinh học thú y, kinh tế, môi trường kỹ thuật khác TẬP HỢP VÀ CÙNG BIỂU HIỆN NHIỀU GENE MÃ HÓA CHO NHIỀU ENZYME CHỊU NHIỆT TRONG E COLI, ỨNG DỤNG TRONG SINH CHUYỂN HÓA IN VITRO Phạm Huỳnh Ninh 1, Kohsuke Hond2, Takaaki Sakai2, Kenji Okano2 Hisao Ohtake2 Bộ môn Dinh dưỡng thức ăn chăn nuôi, Phân Việ n chăn nuôi Nam bộ, Viện Chăn nuôi Biotechnology department, Graduate school of engineering, Osaka university, Japan TÓM TẮT Xây dựng quy trình chuyển hóa nhân tạo phương pháp bật sinh chuyển hóa hóa chất công nghiệ p Tuy nhiên, nhiều enzyme phải chuẩn bị (tinh chế) cách riêng lẻ cho việc xây dựng quy trình chuyển hóa in vitro hạn chế việc ứng dụng phương pháp thực tế Trong nghiên cứu này, chín gene mã hóa cho chín enzyme chịu nhiệt cấu tạo nên quy trình chuyển hóa glucose không sinh ATP tập hợp operon nhân tạo thể tế bào tái tổ hợp E coli Mức độ biểu gene mã hóa cho enzyme chịu nhiệt kiểm soát trình tự chúng operon nhân tạo Hoạt tính enzyme tái tổ hợp tế bào E coli chứa chín gene tái tổ hợp cao gấp 5.0 -1.370 lần so với hoạt tính chúng chủng tái tổ chứa gene mã hóa cho loại enzyme chịu nhiệt Chỉ cần xử lý nhiệt dung dịch tế b tái tổ hợp chứa nhiều enzyme chịu nhiệt làm bất hoạt protein nội sinh E coli bước chuẩn bị quy trình chuyển hóa in vitro gồm lượng giới hạn enzyme chịu nhiệt Phối hợp quy trình với enzyme chịu nhiệt khác NADH oxidase hay malate/lactate dehydrogenase sản xuất pyruvate lactate tương ứng mẽ phản ứng GIỚI THIỆU Ngành sản xuất hóa chất công nghiệp dựa xúc tác sinh học cho thấy có nhiều lợi so với tổng hợp hóa học, ví dụ sản xu ất có chọn lọc đồng phân quang học sử dụng sinh khối, hỗn hợp phức tạp phân tử hữu cơ, làm nguyên liệu Thêm vào đó, phản ứng chuổi với nhiều enzyme thực mẻ phản ứng không cần phải tiến hành t inh lọc chất trung gian sau phản ứng (Burda ctv, 2008) Các lợi trình sản xuất dựa vào lên men vi sinh chủ yếu đến từ tính chất chọn lọc độc đáo enzyme Sự lên phương pháp sinh chuyển hóa (metabolic engineering) mang lại ứng dụng rộng rải quy trình lên men cho sản xuất hàng loạt chất hóa học công nghiệp bao gồm hóa chất thương mại (Nakamura Whited, 2003; Whited ctv, 2010), dược phẩm (Ajikumar ctv, 2010; Paddon ctv, 2013) lượng (Atsumi ctv, 2008; Choi Lee, 2013) Tuy nhiên, việc đưa hệ thống trao đổi chất nhân tạo vào vi sinh vật thường dẫn đến việc cạnh tranh chất trung gian cofactor với hệ thống trao đổi chất vi sinh vật, làm giảm hiệu sản xuất hoạt chất mong muốn Một chiến lược để vượt qua hạn chế tránh dùng vi sinh vật sống, dùng enzyme cấu tạo nên hệ thống trao đổi chất mà muốn Gần đây, loạt đường trao đổi chất nhân tạo thiết kế cho việc sản xuất loạ i alcohol (Guterl ctv, 2012; Krutsakorn ctv, 2013), axít hữu (Ye ctv, 2012, 2013), carbohydrate Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 41 (You ctv, 2013), hydrogen (Woodward ctv, 2000; Zhang ctv, 2007), điện sinh học (Zhu ctv, 2014) Việc áp dụng phản ứng sinh chuyển hóa phức tạp cách tập hợp hàng loạt enzyme quy trình trao đổi chất thể nhiều lợi hạn chế hình thành phụ phẩm, dự đoán lượng sản phẩm sinh đơn giản trình tinh lọc, thu hồi sản phẩm (Ye ct v, 2012) Mặc thấy nhiều điểm bật trên, phương pháp sinh chuyển hóa in vitro nhiều hạn chế cần phải cải thiện Rollin cộng (2013) đưa điểm hạn chế cần phải khắc phục trước áp dụng vào sản xuất, bao gồm sản xuất enzyme chi phí thấp, kéo dài thời gian phản ứng enzyme, công nghiệp hóa sản xuất cofactor tối ưu hóa, mô hình hóa quy trình phản ứng Bên cạnh đó, việc enzyme quy trình phản ứng nhân tạo phải chuẩn bị riêng lẻ mẻ nuôi cấy khác hạn chế việc khai thác đặc tính bật phản ứng sinh học, việc thực nhiều phản ứng mẻ (multistep reactions in a single reactor) Giải pháp tiềm cho vấn đề đến từ việc sử dụng enzyme chịu nhiệt chất xúc tác thiết kế quy trình chuyển hóa Xử lý nhiệt tế bào vi khuẩn (vd: E coli), chứa toàn hệ thống enzyme chịu nhiệt cấu tạo nên chuổi phản ứng mà muốn, làm biến tính enzyme nội s inh tế bào cần bước chuẩn bị để có hỗn hợp enzyme chịu nhiệt Thêm vào đó, đặc tính bền enzyme chịu nhiệt nên hạn chế bất lợi của sinh chuyển hóa in vitro, khả tổng hợp protein tái tạo Trong nghiên cứu này, gene mã hóa cho enzyme chịu nhiệt, enzyme tạo nên quy tình chuyển hóa glucose không sinh ATP (non -ATPforming chimeric glycolytic pathway) (Ye ctv, 2012), tập hợp operon nhân tạo biểu tế bào E coli Bằng cách kết hợp dịch chiết xử lý nhiệt E coli chứa enzyme chịu nhiệt với enzyme chịu nhiệt khác H 2O-forming NADH oxidase hay malate/lactate dehydrogenase, ta chuyển hóa glucose thành sản phẩm tương ứng pyruvate hay lactate VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi khuẩn plasmid E coli DH5a sử dụng để nhân dòng plasmid biểu gene Bacillus subtilis BUSY9797 (Hiroe ctv, 2012), có khả ức chế hoạt động b iểu gene Pr promoter, sử dụng cho việc tập hợp nhiều gene vào operon nhân tạo Cả E coli B subtilis nuôi cấy môi trường Luria -Bertani (LB) 37 oC Ampicillin (100 mg/mL) tetracycline (10 mg/mL) sử dụng để chọn lọc chủng tái tổ hợp Hệ thống (promoter cảm ứng nhiệt/chất ức chế biểu hiện) Pr/CI857 (Jechlinger ctv, 1999) sử dụng cho việc biểu gene tái tổ hợp E coli việc sử dụng loại promoter khác tạo nên việc biểu gene ngoại lai k hông thể kiểm soát B subtilis có xu hướng cản trở việc tập hợp gene vào operon nhân tạo (Nishizaki ctv, 2007) Biểu gene ngoại lai E coli thực cách tăng nhiệt độ nuôi cấy vi khuẩn lên 42 oC vào cuối giai đoạn pha log Tiếp đến, vi khuẩn nuôi cấy 42 oC sau ly tâm thu tế bào E coli-B subtilis shuttle vector, pGETS118 (Kaneko ctv, 2005), loạt 42 Phần Công nghệ sinh học thú y, kinh tế, môi trường kỹ thuật khác vector pUC19 với trình trự cắt giới hạn (DraIII) thiết kế để nhân dòng gene mã hóa cho enzyme chịu nhiệt (Hiroe ctv, 2012), quà tặng từ Tiến sỹ K Tsuge (Đại học Keio, Nhật) Vector pRCI, sở hữu Pr promoter cassette biểu cho hệ thống ức chế (cI857 phage) Pr promoter Tập hợp gene vào operon nhân t ạo Các gene, tối ưu codon phiên mã, mã hóa cho glucokinase (GK), glucose -6phosphate isomerase (PGI), 6-phosphofructokinase (PFK), fructose-bisphosphate aldolase (FBA), triosephosphate isomerase (TIM), enolase (ENO), and pyruvate kinase (PK) vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus HB8, non-phosphorylating glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase (GAPN) vi khuẩn cổ (archaea) Thermococcus kodakarensis KOD1, phosphoglycerate mutase không phụ thuộc cofactor (PGM) vi khuẩn cổ Pyrococcus horikoshii OT3, tập hợp vào operon nhân tạo theo thứ tự định B subtilis phương pháp OGAB ( Ordered Gene Assembly in B.subtilis) (Tsuge ctv, 2003) Trình tự 5’ không mã hóa (UTR) chứa vị trí bám ribosome (RBS) vector pET21a tạo sau (upstream) trình tự codon khởi động gene nhân tạo (gen sử dụng tổng hợp nhân tạo) Cả đầu 5’ 3’ gen tổng hợp nhân tạo thiết kế vị trí cắt enzyme cắt giới hạn BspQI Các gene tổng hợp sau cắt với enz yme cắt giới hạn BspQI đưa vào vị trí tương ứng vector nhân dòng pUC Các vector nhân dòng chứa gene nhân tạo (pUC19V-1st-GAPN, pUC19V-2nd-FBA, pUC19V-3rd-GK, pUC19V-4th-ENO, pUC19V-5th-PGM, pUC19V-6th-PFK, pUC19V-7th-PK, pUC19V-8thTIM, pUC19V-9th-PGI) sau cắt với enzyme cắt giới hạn DraIII để tạo đoạn gene có đầu với đầu so le chứa base (được thiết kế đặc biệt cho để kết nối gen vào vị trí xác định operon nhân tạo) Các đoạn DNA với đầu so le sau tinh sạch, trộn với (2 fmol/mL loại gene) kết nối vào vị trí cắt S fiI vector pGETS118 T4 DNA ligase (Toyobo, Osaka, Nhật) Quá trình biến nạp plasmid tái tổ hợp vào B subtilis thực mô tả Tsuge ctv (2003) Plasmid tái tổ hợp chứa gene mong muốn tách chiết từ B subtilis (pGETS-CGP) sau biến nạp vào E coli DH5a Vi khuẩn E coli DH5a biến nạp plasmid pRCI Real-Time PCR Mức độ phiên mã mRNA gene tái tổ hợp xác định Real-time PCR (RT-PCR) RNA tổng số tách chiết RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA), sau sử dụng cho phản ứng phiên mã ngược với ReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo) RTPCR tiến hành với máy RT -PCR StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA) sử dụng SYBR green real-time PCR Master Mix-plus (Toyobo) Đường chuẩn dựng để tính toán hàm lượng mRNA với phương pháp hồi quy tuyến tính Mức độ biểu gene tái tổ hợp E coli chuẩn hóa cách so sánh với mức biểu gene tham khảo rrsA (16s rRNA) Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 43 Xác định hoạt lực enzyme Vi khuẩn E coli tái tổ hợp sản xuất enzyme chịu nhiệt trộn với dung dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0) tiến hành phá tế vào song siêu âm với máy UD 201 ultrasonicator (Kubota, Osaka, Nhật) Dịch tế bào sau xử lý nhiệt 70 oC 30 phút ly tâm để loại bỏ mảnh tế bào Phần dịch thu sử dụng dung dịch enzyme Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme thực theo mô tả trước Ye ctv (2012) Tóm tắt quy trình sau, lượng enzyme GK vừa đủ dung dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0) với 0,2 mM ATP, mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, mM NADP, 0,1 mM glucose-1-phosphate, lượng thừa enzyme PGI, PFK, FBA, TIM, GAPN Hỗn hợp enzyme ủ 70 oC phút, sau phản ứng bắt đầu cách bổ sung 0,1 mM glucose Mức giảm NADP đo đạc máy quang phổ hồng ngoại bước sóng (Model UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Nhật) Tương tự , hoạt tính PGI, PFK, FBA, TIM, GAPN đo đạc máy quang phổ với việc thay glucose chất enzyme (tương ứng 0,1 mM glucose -6-phosphate, fructose-6-phosphate, fructose-1,6-bisphos-phate, dihydroxyacetone phosphate hay 0,2 mM glyceralde-hyde-3-phosphate) Hoạt tính PGM xác định cách kết hợp với ENO, PK lactate dehydrogenase T thermophilus (TtLDH) Dung dịch phản ứng chứa 0,2 mM ADP, mM MgCl 2, 0,5 mM MnCl2, 0,2 mM NADH lượng dư ENO, PK, TtLDH Sau ủ 70 oC phút, phản ứng bắt đầu cách thêm vào dung dịch 0,2 mM -phosphoglycerate việc tiêu thụ NADH đo đạt máy quang phổ 340 nm Hoạt tính ENO PK xác định tương tự thay đổi chất tương ứng 0,2 mM 2phosphoglycerate phosphoenolpyruvate Một đơn vị hoạt tính định nghĩa tổng lượng mmol chất tiêu thụ đơn vị thời gian Xác định tốc độ phản ứng sản xuất Pyruvate Tế bào vi khuẩn E coli chứa vector pGETS-CGP pRCI huyền phù dung dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0) với mật độ tế bào 50 mg/mL sau bị phá hủy sóng siêu âm Dịch tế bào sau ủ 70 oC 30 phút sau sử dụng trực tiếp chất xúc tác sinh học mà không cần phải loại bỏ mảnh tế bào hay protein bị biến tính Việc chuẩn bị chất xúc tác sinh học từ hỗn hợp chín loại tế bào vi khuẩn chứa chín loại enzyme khác thực tương tự Các chủng vi khuẩn chứa enzyme chịu nhiệt GK, PGI, PFK, FBA , TIM, GAPN, PGM, ENO PK trộn với theo tỷ lệ tương ứng 5, 1, 2, 5, 1, 32, 2, mg tế bào/mL, phá tế bào sóng siêu âm sau ủ 70 oC for 30 phút Dung dịch phản ứng (1 mL) chứa dung dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0), 0,1 mM glucose, mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 0,2 mM ATP, 0,2 mM ADP, mM NADP, mM glucose-1-phosphate dịch tế bào chuẩn bị từ 50 mg tế bào NADH oxidase Thermococcus profundus thêm vào phản ứng với nồng độ 0,1 U/mL để tái tổng hợp NADP cần cho phản ứng Phản ứng thực 70 oC, khuấy trộn với tốc độ 1.400 vòng/phút sử dụng máy thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Đức) Sau ủ 10 phút, phản ứng dùng lại cách thêm vào dung dịch phản ứng 0,8 ml M HCl 44 Phần Công nghệ sinh học thú y, kinh tế, môi trường kỹ thuật khác dung dịch methanol lạnh Tiếp theo đó, protein biến tính loại bỏ ly tâm sau tiến hành vi lọc Amicon K (Millipore, Billerica, MA) Dịch lọc cho phản ứng với lượng tương đượng với dung dịch o -phenylene diamine (1 mg/mL) hòa tan M HCl (Mühling ctv, 2003) để tạo hỗn hợp chất phản quang từ pyruvate Dịch phản ứng sau ủ 80oC 60 phút sau xác định nồng độ chất phát huỳnh quang máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Sản xuất lactate Dung dịch phản ứng (4 mL) chứa dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0), 0,1 mM glucose, mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 0,2 mM ATP, 0,2 mM ADP, mM NADP, 0,2 mM NADH mM glucose-1-phosphate Dung dịch tế bào, chuẩn bị từ 200 mg tế bào vi khuẩn tái tổ hợp chứa enzyme chịu nhiệt, 0,2 U malate/lactat e dehydrogenase T thermophilus HB8 (MLDH) (Ye ctv, 2012), sử dụng chất xúc tác sinh học Phản ứng tiến hành 70 oC với hệ thống khuấy trộn Dung dịch gồm glucose (24 mM) NADP (10 mM) cung cấp vào phản ứng với tốc độ mL/phút (tương ứng nmol glucose/mL/phút 2,5 nmol NADP mL/phút) sử dụng bơm dung môi Shimadzu LC -20 AD Dung dịch phản ứng (60 m L) thu sau mội giờ, ly tâm loại bỏ mảnh tế bào (15.000 vòng/phút 10 phút) Dịch thu nhận tiến hành vi l ọc với Amicon 3K phân tích HPLC Phương pháp phân tích Pyruvate dạng chất phát huỳnh quang xác định HPLC với cột Cosmosil l5C18-ARII ( 4,6 x 150 mm, Nacalai Tesque, Kyoto, Nhật) Cột rửa 35 oC sử dụng hỗn hợp dung môi gồm 45% methanol 1% axít acetic với tốc độ dòng 0,4 mL/phút Chất phát huỳnh quang xác định đầu dò huỳnh quang RF10A (Shimadzu) với bước sóng kích thích phát quang tương ứng 360 415 nm Lactate phân tích HPLC với việc kết nối cột nối với mô tả Ye ctv (2012) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tập hợp gene Tối ưu hóa quy trình chuyển hóa vấn đề quan trọng cốt lõi để đạt tốc độ phản ứng cao quy trình nhân tạo (Nowroozi ctv, 2014; Oliver ctv, 2014; Pfleger ctv, 2006) Trước đây, chứng minh dòng vật chất qua hệ thống chuyển hóa vật chất nhân tạo kiểm soát cách kiểm soát tiêu thụ hay sản xuất NAD(P)H máy quang phổ (Ye ctv, 2012) Kỹ thuật kiểm soát ch o phép xác định bước giới hạn chuổi phản ứng, cách tăng lượng loại enzyme Tỷ lệ enzyme tối ưu để đạt tốc độ phản ứng thông qua quy trình chuyển hóa thiết kế xác định thực nghiệm thông qua việc thay đổi nồng độ enzyme bước giới hạn chuổi phản ứng (Krutsakorn ctv, 2013; Ye ctv, 2012) Thách thử chủ yếu cho trình tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp Có khả biểu Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 45 tất enzyme chuổi phản ứng việc sản xuất lại tỷ lệ thích hợp enzyme vi khuẩn cách thay đổi mức độ biểu biệu gene Mặc dù mức độ biểu gene bị ảnh hưởng nhiều yếu tố bao gồm sức mạnh promoter hiệu trình giải mã, tập t rung vào vị trí gene để giảm bớt yếu tố cần khảo sát Việc sử dụng operon đơn lẻ giúp hạn chế thay đổi trình kiểm soát phiên mã (Pfleger ctv, 2006) mức độ phiên mã cistron polycistron có xu hướng giảm dần phía xa promoter (Nishizaki ctv, 2007) Dựa giả thuyết rằng, gene mã hóa cho enzyme chịu nhiệt quy trình chuyển hóa glucose xếp operon nhân tạo vị trí thích hợp Để xác định vị trí gene, chín gene đưa vào sau Pr promoter vector pRCI biểu E coli DH5a Mức độ phiên mã tạo mRNA hoạt tính enzyme chịu nhiệt mã hóa từ gene vi khuẩn E coli xác định số lượng mRNA cần thiết để tạo nên đơn vị hoạt tính enzyme trình bày bảng 1, dòng Lượng enzyme để đạt tốc độ phản ứng tạo pyruvate 0,005 µmol/phút thông qua toàn chuổi phản ứng xác định thực nghiệm sử dụng dịch chiết tế bào chứa enzyme mô tả Ye ctv (2012), lượng mRNA cần thiết để mã hóa lượng enzyme tối ưu tính toán bảng 1, dòng Kết gene mã hóa cho GAPN cần phải phiên mã nhiều tất gene Theo đó, gene mã hóa cho GAPN cần đặt vị trí gần promoter nhất, gene mã hóa cho FBA, GK, ENO, PGM, PFK, PK, TIM PGI (bảng 1, dòng 7) Các gene tập hợp operon nhân tạo sau đưa vào vector pGETS118 kiểm soát Pr promoter phương pháp OGAB (Tsuge ctv, 2003) Điện di đoạn DNA sau cắt vector tái tổ hợp (pGETS -CGP) EcoRI cho kết tính toán, điều chứng tỏ gene đưa vào operon nhân tạo xác vị trí mong muốn (Hình 1) Bảng Sự biểu gene hoạt tính enzyme tế bào tái tổ hợp chứa enzyme GAPN FBA GK ENO PGM PFK PK TIM PGI Số lượng mRNA (×109 sao/mg tế bào) Enzyme 39,8 135 60,2 216 46,0 42,1 4,11 139 148 Hoạt tính enzyme (×10-3 U/mg tế bào) 0,52 7,10 4,01 26,1 14,2 20,1 31,1 2010 4600 mRNA/đơn vị enzyme a (×1010 sao) 7650 1900 1500 828 324 210 13,2 6,92 3,22 Lượng enzyme tối ưu b (×10−3 U/ml) 6,03 16,4 19,2 11,1 21,1 30,1 15,4 9,10 19,0 Lượng mRNA cần thiết c (×108 sao/ml) 4615 3118 2882 919 684 632 20,3 6,28 6,12 Trình tự gene a Số lượng mRNA cần để sản xuất U enzyme tính toán cách chia mức độ biểu mRNA (dòng 2) cho hoạt tính enzyme (dòng 3) b Hàm lượng enzyme xác định thí nghiệm để đạt tốc độ tiêu t hụ glucose 2,5 nmol/phút/ml c Lượng mRNA cần thiết để sản suất lượng enzyme tối ưu tính toán cách nhân mRNA/đơn vị enzyme (dòng 4) nồng độ enzyme tối ưu (dòng 5) 46 Phần Công nghệ sinh học thú y, kinh tế, môi trường kỹ thuật khác Hình (A) Sơ đ vị trí genen pGETS-CGP kích thước đoạn DNA ước tính cắt vector tái tổ hợp EcoRI (B) Điện di đoạn DNA sau cắt EcoRI Khoảng 0,1 g pGETS-CGP cắt với EcoRI tách rời điện di gel agarose (cột phải) DNA bị cắt HindIII sử dụng làm marker (cột trái) Sự biểu gene tái tổ hợp Sự phiên mã mRNA gene mã hóa cho enzyme chịu nhiệt tế bào tái tổ hợp xác định RT-PCR (Hình 2) Mức độ biểu gene tương ứng với vị trí chúng operon nhân tạo, ngoại trừ gene mã hóa cho ENO PGM Mức độ biểu gene cao mong muốn Kết hình thành promoter khác, trình tối ưu hóa gene cho việc biểu E coli, nằm gene mã hóa cho GK Mức độ biểu cao ge ne mã hóa cho enzyme ENO PGM đế từ khác tính bền cistron Mặc dù nguyên nhân dẫn đến biểu hiên vượt trội gene chưa làm rõ, nhiên khác tính bền cistron polycistron mRNA đượ c quan sát tự nhiên tế bào vi khuẩn E coli (Esquerré ctv, 2014) Sự khác mức ảnh hưởng yếu tố cis-acting RNA hoạt động endoribonuclease nội sinh đóng góp vào tính bền vững mRNA SDS PAGE cho thấy hầu hết protein nội sinh dịch chiết tế bào E coli vector pGETSCGP bị biến tính 70 oC 30 phút (Hình 3, cột 2) Trong đó, dịch chiết xử lý nhiệt tế bào E coli có vector pGETS-CGP cho thấy có vạch mà không tìm thấy tế bào E coli không chứa vector tái tổ hợp (Hình 3A, cột 4) Việc sản xuất enzyme chịu nhiệt ngoại lai tế bào tái tổ hợp E coli khẳng định cách so sánh di chuyển vạch protein tế bào tái tổ hợp có vector chứa gene mã hóa cho enzyme vạch tế bào E coli tái tổ hợp có vector chứa gene mã hóa cho enzyme (Hình B) Thêm vào đó, việc xác định hoạt lực tất enzyme chịu nhiệt tế bào vi khuẩn E coli chứa vector pGETS -CGP tái khẳng định bi ểu gene tái tổ hợp (bảng 2) Hoạt tính enzyme chịu nhiệt dịch chiết tế b E coli tái tổ hợp so sánh với chúng hỗn hợp gồm tế bào (mỗi tế bào chứa loại enzyme) Tỷ lệ tế bào chứa enzyme hỗn hợp đượ c tính toán nhằm đảm bảo tốc độ phản ứng sản xuất pyruvate thông qua toàn chuổi phản ứng 0,005 µmol/phút/mL (cụ thể chúng tương đương Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 47 với số liệu bảng 1, dòng 5) Hoạt tính enzyme chủng tái tổ hợp chứa enzyme cao từ 5,0 (FBA) đến 1.370 (PGM) lần so với hoạt tính chúng hỗn hợp chủng khác (bảng 2) Hình Mức độ biểu gene mã hóa cho enzyme chịu nhiệt chuyển hóa glucose tế bào E coli tái tổ hợp Dữ liệu RT-PCR phân tích lặp lại lần thể hình giá trị trung bình độ lệch chuẩn Hình (A) Sử biểu protein vi khuẩn E coli chứa pGETS118 (không chứa gene ngoại lai, cột 2) pGETS-CGP (chứa gene ngoại lai, cột 4) Dịch chiết tế bào chuẩn bị từ mg tế bào, xử lý nhiệt (cột 3) sau xử lý nhiệt (cột 4) 70°C 30 phút sau chạy gel 12% acrylamide (B) SDS-PAGE dịch chiết tế bào tái tổ hợp chứa enzyme chịu nhiệt tế bào chứa enzyme chịu nhiệt Khối lượng phân tử enzyme tái tổ hợp (kDa) sau: GAPN, 55,5; PK, 51,1; PGI, 46,1; ENO, 45,5; PGM, 45,1; PFK, 33,5; FBA, 32,3; GK, 31,5 TIM, 27,0 48 Phần Công nghệ sinh học thú y, kinh tế, môi trường kỹ thuật khác Bảng Hoạt tính riêng enzyme tế bào tái tổ hợp cứa chí enzyme hỗn hợp chín loại tế bào chứa enzyme a Enzyme GAPN FBA GK ENO PGM PFK PK TIM PGI Tế bào chứa chín enzyme (×10−3 U mg−1 wet cells) 1,81 1,69 4,10 158 577 44,8 371 23,1 10,3 Hỗn hợp chín tế bào chứa enzyme b (×10−3 U mg−1 wet cells) 0,12 0,32 0,38 0,22 0,42 0,60 0,30 0,18 0,38 a Hoạt tính enzyme xác định dịch chiết tế bào vi khuẩn tái tổ hợp x lý nhiệt Hoạt tính enzyme tính toán quy khối lượng ướt tế bào sử dụng để chuẩn bị dịch chiết enzyme (50 mg tế bào chứa enzyme 50 mg hỗn hợp chín tế bào chứa enzyme) b Hỗn hợp chín tế bào E coli chứa enzyme GAPN, FBA, GK, ENO, PGM, PFK, PK, TIM GI trộn với theo tỷ lệ 32:5:5:1:2:2:1:1:1 (khối lượng ướt) Việc sản xuất protein ngoại lai vi sinh vật tái tổ hợp thường hình thành cấu trúc lỗi dẫn đến việc tích lũy potein không tan nước (inclusion body) Trong thực nghiệm, SDS-PAGE dịch chiết chủng vi khuẩn chứa enzyme chịu nhiệt cho thấy số enzyme chịu nhiệt hình thành dạng protein không tan (ví du PFK FBA) Trong đó, enzyme khác ENO GK hầu hết biểu dạng protein hoạt động (hòa tan nước) (hình 4) Các quan sát khác hiệu trình cuộn gập protein có đóng góp vào kiểm soát chặt chẻ trình biểu đa gene Nói chung, việc tích lũy protein dạng inclusion body không đáng kể vi khuẩn tái tổ hợp chứa nhiều enzyme, tạo nên hoạt tính cao enyzm chủng tái tổ hợp đa enzyme chịu nhiệt Hình SDS-PAGE protein tan (soluble -S) không tan (insoluble-I) tế bào tái tổ hợp chứa enzym chứa enzyme chịu nhiệt Dịch chiết tế bào chuẩn bị từ mg tế bào ướt Phần protein tan không tan tách cách ly tâm 15.000 × g 15 phút Phần protein tan nước xử lý nhiệt 70 oC 30 phút, sau lý tâm, phần dịch thu dùng cho SDS-page Phần không tan nước rửa lần với dung dịch đệm dùng c ho SDS-page mà không cần xử lý nhiệt Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 49 Xác định tốc độ phản ứng thông qua toàn quy trình chuyển hóa in vitro Tốc độ chuyển hóa glucose thành pyruvate thông qua toàn chuổi phản ứng với chín enzyme chịu nhiệt xác định cách sử dụng chủng tái tổ hợp chứa chín enzyme NADH oxidase chịu nhiệt từ T profundus, xúc tác chuyển electron từ O sang H2O sử dụng NADH chất cho electron (Jia ctv, 2008), thêm vào phản ứng nhằm tổng hợp cofactor cần cho phản ứng Khi 50 mg tế bào chứa enzym e hỗn hợp loại tế bào vi khuẩn chứa chín loại enzyme sử dung Tế bào chứa enzyme cho tốc độ phản ứng sản xuất pyruvate cao 4,2 lần so với hỗn hợp loại tế bào (hình 4) Hoạt tính cao enzyme tế bào chứa enzyme (bảng 2) dường góp phần làm nên tốc độ phản ứng cao Việc sử dụng dịch tế bào (dịch thô, bao gồm mảnh vỡ tế bào) chứa enzyme hỗn hợp chín tế bào chứa loại enzyme cho kết cao 1,4 2,1 lần tốc độ sản xuất pyruvate so với việc sử dụng tế bào nguyên vẹn (xử lý nhiệt không phá tế bào sóng siêu âm) Kết việc gom, đóng gói nhiều enzyme vào tế bào có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng Cấu trúc màng tế bào E coli bị phá phần hay toàn nhiệt độ cao phần enzyme chịu nhiệt (dạng hòa tan nước) thoát môi trường phản ứng (Ninh ctv, 2013) Chúng tiến hành đánh giá mức độ thất thoát lượng enzyme chịu nhiệt từ tế bào môi trường tế bào tái tổ hợp chứa enzyme (hình ) Mặc dù mức độ thất thoát khác enzyme, nhiên 80% lượng enzyme giữ tế bào E coli Điều có nghĩa cấu trúc màng tế bào vi khuẩn E coli không bị phá hủy hoàn toàn (chỉ phần) điều kiện thí nghiệm Màng tế bào tồn phần ảnh hưởng đến khuếch tán chất vào bên tế bào làm giảm tốc độ phản ứng Tốc độ phản ứng chậm phản ứng sử dụng tế bào (đã xử lý nhiệt) đến từ tình trạng đông đúc đại phân tử sinh học bên tong tế bào Tổng lượng protein RNA tế bào E coli nằm khoảng 300 -400 mg/mL chúng chiếm từ 20-30% thể tích tế bào chất (Ellis, 2001) Do đó, khuếch tán phân tử có kích thước nhỏ tế bào chậm từ đến lần so với khuếch tán nước (Kao ctv, 1993) Tốc độ khuếch tán chậm làm giảm tốc độ phản ứng chuổi nhân tạo bên tế bào Hình Tốc độ sản xuất pyruvate với tế bào chứa enzyme (cột màu xám) hỗn hợp chín tế bào chứa chín enzyme (cột màu trắng) Tốc độ sản xuất xác định sử dụng 50 mg (khối lượng ướt) tế bào dịch tế bào (tế bào bị phá sóng siêu âm) Hỗn hợp tế bào chứa chín en zyme có tỷ lệ GK, PGI, PFK, FBA, TIM, GAPN, PGM, ENO PK sau: 5: 1: 2: 5: 1: 32: 2: 1: (khối lượng ướt) 50 Phần Công nghệ sinh học thú y, kinh tế, môi trường kỹ thuật khác Hình Rò rỉ enzyme khỏi tế bào có enzyme tác động nhiệt độ Tế bào chứa enzyme xử lý nhiệt 70°C 30 (cột màu đen), 60 (cột màu xám) 90 phút (cột màu tr ắng) Sau ly tâm bỏ tế bào, phần dịch sử dụng để kiểm tra mức độ rò rỉ enzyme từ tế bào Phần trăm rò rỉ enzyme tính cách so hoạt tính enzyme dịch xử lý nhiệt tế bào với hoạt tính enzyme xác định từ dịch tế bào chuẩn bị sóng siêu âm Sản xuất lactate in vitro Dịch tế bào (bao gồm mảnh tế bào) E coli tái tổ hợp chứa enzyme chịu nhiệt sử dụng làm chất xúc tác cho trình sản xuất lactate từ glucose mẻ phản ứng MLDH, xúc tác chuyển pyruvate thành lactate diện NADP (Ye ctv, 2012), kết hợp với chín enzyme quy trình chuyển hóa glucose để đạt cân tiêu thụ tái sản xuất cofactor Cung cấp nhiều glucose vào hệ thống phản ứng đến tình trang phosphoryl hóa glucose nhanh chóng, tiêu thụ hầu hết ATP nên đế thiếu APT cho phản ứng phosphoryl hóa PFK (Ye ctv, 2012) Do đó, cung cấp glucose cho phản ứng với tỷ lệ nmol/phút/mL, ½ tốc độ phản ứng mà xác định thực nghiệm phản ứng qua toàn chuổi (hình 4) NADP củng liên tục cung cấp cho phản ứng với tỷ lệ với tỷ lệ mà chất bị phân hủy nhiệt độ cao (2,5 nmol/phút/ml) Tốc độ phản ứng trì mức tính toán (12 nmol/phút/ml) đầu phản ứng (hình 7) Theo đó, 2,2 mM lactate sản xuất từ 1,1 mM glucose với hiệu suất 100%, khẳng định enzym nội sinh tế bào E coli bị bất hoạt nhiệt độ nên phản ứng sinh sản phẩm phụ Sau h, tốc độ phản ứng chậm hiệu suất chuyển hóa giảm xuống 82% lúc h Hiện tượng pha loãng dung dịch phản ứng ta liên tục cung cấp dung dich nguyên liệu glucose cofactor (tăng 6,0% tổng thể tích sau h) trình lấy mẫu m enzyme (giảm 4,5% tổng số enzyme sau h phản ứng) Chúng phát rằng, enzyme GK, PFK, ENO PK từ 20-25% hoạt tính chúng sau ủ 70 oC 4h Giải pháp cho vấn đề sử dụng enzyme từ vi khuẩn có nhiệt độ sống u cao nhiệt độ tối ưu T thermophilus nhằm cải thiện tính bền nhiệt enzyme Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 51 2.5 Lactate (mM) 1.5 0.5 0 60 120 180 Thời gian phản ứng (phút) 240 Hình Sản xuất lactate với dịch tế bào (chứa enzym) chuẩn bị sóng siêu âm KẾT LUẬN Chúng thành công việc tập hợp chín gene mã hóa cho enzyme chịu nhiệt chuyển hóa glucose vào operon nhân tạo biểu chúng tế bào E coli Mức độ biểu enzyme chịu nhiệt tái tổ hợp kiểm soát vị trí chúng operon nhân tạo Bằng cách xử lý nhiệt dịch tế bào t tổ hợp, hệ thống sinh chuyển hóa in vitro không phản ứng phụ xây dựng sử dụng cho việc sản xuất pyruvate lactate mẻ phản ứng Chúng ta kiểm soát gắt gao việc biểu gene ngoại lai operon tổng hợp cách kết hợp vị trí tối ưu gene với trình tự gắng ribosome (Nowroozi ctv, 2014; Oliver ctv, 2014) Việc cải thiện tốc độ phản ứng toàn chuổi Thêm vào đó, thấy dịch tế bào cho tốc độ phản ứng cao so với sử dụng tế bào (không phá hủy sóng siêu âm) Nguyên nhân đến từ việc màng tế bào hạn chế khuếch tán chất vào tế bào hay ảnh hưởng đông đúc đại phân tử sinh học tế bào Kết đặt câu hỏi tính xác, tính hiệu việc sử dụng mô hình tóan học dùng để mô dòng vật chất chuyển hóa qua chuổi phản ứng in vivo rút từ thí nghiệm enzyme in vitro Phương pháp chúng tôi, quy trình trao đổi chất đơn giản bao gồm enzym tạo nên quy trình tái xây dựng bên tế bào, đóng góp vào việc phân tích động lực học phản ứng enzyme bên tế bào trình trao đổi chất Nghiên cứu cấp kinh phí từ tổ chức k hoa học kỹ thuật Nhật (PRESTO/CREST program) Nghiên cứu phần hỗ trợ Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant (26450088) Chúng xin chân thành cám ơn Tiến sỹ K Tsuge cung cấp vector cần cho nghiên cứu hỗ trợ kỹ thuật OGAB Bài báo dịch từ http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.25338/epdf 52 Phần Công nghệ sinh học thú y, kinh tế, môi trường kỹ thuật khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Ajikumar P.K., Xiao W.H., Tyo K.E.J., Wang Y., Simeon F., Leonard E., Mucha O., Phon T.H., Pfeifer B., Stephanopoulos G 2010 Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor over production in Escherichia coli Science 330:70- 74 Atsumi S., Hanai T., Liao J.C 2008 Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels Nature 415:86-89 Burda E., Hummel W., Gröger H 2008 Modular chemoenzymatic one-pot syntheses in aqueous media: Combination of a palladium-catalyzed cross-coupling with an asymmetric biotransformation Angew Chem Int 47:9551-9554 Choi Y.J., Lee S.Y 2013 Microbial production of short-chain alkanes Nature 502:571-574 Ellis RJ 2001 Macromolecular crowding: Obvious but underappreciated Trends Biochem Sci 26:597-604 Esquerré T., Laguerre S., Turlan C., Carp ousis A.J., Girbal L., Cocaign-Bousquet M 2014 Dual role of transcription and transcript stability in the regulation of gene expression in Escherichia coli cells cultured on glucose at different growth rates Nucleic Acids Res 42:2460-2472 Guterl J.K., Garbe D., Carsten J., Steffler F., Sommer B., Reiße S., Philipp A., Haack M., Rühmann B., Koltermann A., Kettling U., Thomas Brück T., Sieber V 2012 Cell-free metabolic engineering: Production of chemicals by minimized reaction cascades ChemSusChem 5:2165- 2172 Hiroe A., Tsuge K., Nomura C.T., Itaya M., Tsuge T 2012 Rearr angement of gene order in the phaCAB operon leads to effective production of ultrahigh-molecular-weight poly[(R)-3-hydrobutyrate] in genetically engineered Escherichia coli Appl Environ Microbiol 78:3177- 3184 Jechlinger W., Szostak M.P., Witte A., Lubitz W 1999 Altered temperature induction sensitivity of the lambda pR/cI875 system for controlled gene expression in E coli FEMS Microbiol Lett 173:347-352 10 Jia B., Park S.C., Lee S., Pham B.P., Yu R., Han S.W., Yang J.K., Choi M.S., Baumeister W., Cheong G.W 2008 Hexameric ring structure of a thermophilic archaeon NADH oxidase that produces predominantly H2O FEBS J 275:5355-5366 11 Kaneko S., Akioka M., Tsuge K., Itaya M 2005 DNA shuttling between plasmid vectors and a genome vector: Systematic conversion and preservation of DNA libraries using the Bacillus subtilis genome (BGM) vector J Mol Biol 349:1036-1044 12 Kao H.P., Abney J.R., Verkman A.S 1993 Determinants of the translational mobility of a small solute in cell cytoplasm J Cell Biol 120:175- 184 13 Krutsakorn B., Honda K., Ye X., Imagawa T., Bei X., Okano K., Ohtake H 2013 In vitro production of nbutanol from glucose Metab Eng 20:84-91 14 Mühling J., Fuchs M., Campos M.E., Gonter.J, Engel J.M., Sablotzki A., Menges T., Weiss S., Dehne M.G., Krüll M., Hempelmann G 2003 Quantitative determination of free intracellular a keto acids in neutrophils J Chromatogr B 789:383-392 15 Nakamura C.E., Whited G.M 2003 Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol Curr Opin Biotechnol 14:454- 459 16 Ninh P.H., Honda K., Yokohigashi Y., Okano K., Omasa T., Ohtake H 2013 Development of a continuous bioconversion system using a thermophilic whole-cell biocatalyst Appl Environ Microbiol 79:1996-2001 17 Nishizaki T., Tsuge K., Itaya M., Doi N., Yanagawa H 2007 Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis in Escherichia coli by ordered gene assembly in Bacillus subtilis Appl Environ Microbiol 73:1355-1361 18 Nowroozi F.F., Baidoo E.E.K., Ermakov S., Redding-Johanson A.M., Batth T., Petzold C.J., Keasling J.D 2014 Metabolic pathway optimization using ribosome binding site variants and combinatorial gene assembly Appl Microbiol Biotechnol 98:1567-1581 19 Oliver J.W.K, Machado I.M.P, Yoneda H., Atsumi S 2014 Combinatorial optimization of cyanobacterial 2,3-butanediol production Metab Eng 22:76-82 20 Paddon C.J., Westfall P.J., Pitera D.J., Benjamin K., Fisher K., McPhee D., Leavell M.D., Tai A., Main A., Eng D., Polichuk D.R., Teoh K.H., Reed D.W., Treynor T., Lenihan J., Fleck M., Bajad S., Dang G., Diola Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 53 D., Dorin G., Ellens K.W., Fickes S., Galazzo J., Gaucher S.P., Geistlinger T., Henry T., Hepp M., Horning T., Iqbal T., Jiang H., Kizer L., Lieu B., Melis D., Moss N., Regentin R., Secrest S., Tsuruta H., Vazquez R., Westblade L.F., Xu L., Yu M., Zhang Y., Zhao L., Lievense J., Covello P.S., Keasling J.D., Reiling K.K., Renninger N.S., Newman J.D 2013 High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin Nature 496:528-532 21 Pfleger B.F., Pitera D.J., Smolke C.D., Keasling J.D 2006 Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes Nat Biotechnol 24:1027-1032 22 Rollin J.A., Tam T.K., Zhang Y.H.P 2013 New biotechnology paradigm: Cell-free biosystem for biomanufacturing Green Chem 15:1708-1719 23 Tsuge K., Matsui K., Itaya M 2003 One step assembly of multiple DNA fragments with a designed and orientation in Bacillus subtilis plasmid Nucleic Acids Res 31(21):E113 24 Whited G.M., Feher F.J., Benko D.A., Cervin M.A., Chotani G.K., McAuliffe J.C., LaDuca R.J., BenShoshan E.A., Sanford K.J 2010 Technology update: Development of a gas-phase bioprocess for isoprenemonomer production using metabolic pathway engineering Ind Biotechnol 6:152-163 25 Woodward J., Orr M., Cordaray K., Greenbaum E 2000 Enzymatic production of biohydrogen Nature 405:1014- 1015 26 Ye X., Honda K., Morimoto Y., Okano K., Ohtake H 2013 Direct conversion of glucose to malate by synthetic metabolic engineering J Biotechnol 164:34-340 27 Ye X., Honda K., Sakai T., Okano K., Omasa T., Hirota R., Kuroda A., Ohtake H 2012 Synthetic metabolic engineering - a novel, simple technology for designing a chimeric metabolic pathway Microb Cell Fact 11:120 28 You C., Chen H., Myung S., Sathitsuksanoh N., Ma H., Zhang X.Z., Li J., Zhang Y.H.P 2013 Enzymatic transformation of nonfood biomass to starch Proc Natl Acad Sci USA 110:7182-7187 29 Zhang Y.H.P, Evans B.R., Mielenz J.R., Hopkins R.C., Adams M.W.W 2007 High-yield hydrogen production from starch and water by a synthetic enzymatic pathway PLoS ONE 2:e456 30 Zhu Z., Tam T.K., Sun F., You C., Zhang Y.H.P 2014 A high-energy-density sugar biobattery based on a synthetic enzymatic pathway Nat Commun 5:3026 [...]... 180 Thời gian phản ứng (phút) 240 Hình 7 Sản xuất lactate với dịch tế bào (chứa 9 enzym) chuẩn bị bằng sóng siêu âm KẾT LUẬN Chúng tôi đã thành công trong việc tập hợp chín gene mã hóa cho 9 enzyme chịu nhiệt chuyển hóa glucose vào operon nhân tạo và cùng biểu hiện chúng trong một tế bào E coli Mức độ biểu hiện của các enzyme chịu nhiệt tái tổ hợp được kiểm soát bởi vị trí của chúng trong operon nhân... xử lý nhiệt dịch tế bào t ái tổ hợp, hệ thống sinh chuyển hóa in vitro không phản ứng phụ đã được xây dựng và sử dụng cho việc sản xuất pyruvate và lactate chỉ trong 1 mẻ phản ứng Chúng ta có thể kiểm soát gắt gao hơn nữa việc biểu hiện của các gene ngoại lai trong operon tổng hợp bằng cách kết hợp giữa vị trí tối ưu của các gene với các trình tự gắng của ribosome (Nowroozi và ctv, 2014; Oliver và ctv,... 2012), được kết hợp với chín enzyme trong quy trình chuyển hóa glucose để đạt được sự cân bằng về tiêu thụ và tái sản xuất cofactor Cung cấp quá nhiều glucose vào hệ thống phản ứng sẽ dẫu đến tình trang phosphoryl hóa glucose nhanh chóng, tiêu thụ hầu hết ATP nên dẫu đế thiếu APT cho các phản ứng phosphoryl hóa tiếp theo bởi PFK (Ye và ctv, 2012) Do đó, chúng tôi cung cấp glucose cho phản ứng với tỷ lệ... enzym nội sinh của tế bào E coli đã bị bất hoạt bởi nhiệt độ nên không có phản ứng sinh sản phẩm phụ Sau 3 h, tốc độ phản ứng chậm đi và hiệu suất chuyển hóa giảm xuống 82% lúc 4 h Hiện tượng này có thể do sự pha loãng dung dịch phản ứng khi ta liên tục cung cấp dung dich nguyên liệu glucose và cofactor (tăng 6,0% tổng thể tích sau 4 h) và do quá trình lấy mẫu là m mất enzyme (giảm 4,5% tổng số enzyme. .. sinh học thú y, kinh tế, môi trường và kỹ thuật khác Hình 6 Rò rỉ enzyme ra khỏi tế bào có 9 enzyme do tác động của nhiệt độ Tế bào chứa 9 enzyme được xử lý nhiệt ở 70°C trong 30 (cột màu đen), 60 (cột màu xám) và 90 phút (cột màu tr ắng) Sau khi ly tâm bỏ tế bào, phần dịch trong được sử dụng để kiểm tra mức độ rò rỉ của enzyme từ tế bào Phần trăm rò rỉ của enzyme được tính bằng cách so hoạt tính enzyme. .. tính enzyme trong dịch xử lý nhiệt tế bào với hoạt tính enzyme xác định từ dịch tế bào chuẩn bị bằng sóng siêu âm Sản xuất lactate in vitro Dịch tế bào (bao gồm cả mảnh vở tế bào) E coli tái tổ hợp chứa 9 enzyme chịu nhiệt được sử dụng làm chất xúc tác cho quá trình sản xuất lactate từ glucose trong một mẻ phản ứng MLDH, xúc tác chuyển pyruvate thành lactate dưới sự hiện diện của NADP (Ye và ctv, 2012),... quả của việc sử dụng mô hình tóan học dùng để mô phỏng dòng vật chất chuyển hóa qua chuổi phản ứng in vivo được rút ra từ các thí nghiệm enzyme in vitro Phương pháp của chúng tôi, một quy trình trao đổi chất đơn giản chỉ bao gồm các enzym tạo nên quy trình đó được tái xây dựng bên trong tế bào, có thể đóng góp vào việc phân tích động lực học của các phản ứng enzyme bên trong tế bào và quá trình trao... N., Yanagawa H 2007 Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis in Escherichia coli by ordered gene assembly in Bacillus subtilis Appl Environ Microbiol 73:1355-1361 18 Nowroozi F.F., Baidoo E.E.K., Ermakov S., Redding-Johanson A.M., Batth T., Petzold C.J., Keasling J.D 2014 Metabolic pathway optimization using ribosome binding site variants and combinatorial gene assembly Appl Microbiol Biotechnol... mẫu là m mất enzyme (giảm 4,5% tổng số enzyme sau 4 h phản ứng) Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng, enzyme GK, PFK, ENO và PK mất từ 20-25% hoạt tính của chúng sau khi ủ ở 70 oC trong 4h Giải pháp cho vấn đề này là sử dụng enzyme từ vi khuẩn có nhiệt độ sống tối ư u cao hơn nhiệt độ tối ưu của T thermophilus nhằm cải thiện tính bền nhiệt của enzyme Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi năm 2013 - 2015 51... Oliver và ctv, 2014) Việc này có thể cải thiện tốc độ phản ứng của toàn chuổi Thêm vào đó, chúng ta thấy rằng dịch tế bào cho tốc độ phản ứng cao hơn so với sử dụng tế bào (không phá hủy bằng sóng siêu âm) Nguyên nhân có thể đến từ việc màng tế bào hạn chế sự khuếch tán của cơ chất vào trong tế bào hay cũng có thể do ảnh hưởng của sự đông đúc các đại phân tử sinh học trong tế bào Kết quả này đặt ra một câu