NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIACOLI VÀ BACILLUS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIACOLI VÀ BACILLUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420122 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn chính: TS Nguyễn Huy Hoàng Người hướng dẫn phụ: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – Năm 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 11 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1.Keratin 12 1.2 Keratinase 14 1.3.Một số chủng biểu 18 1.3.1 Chủng chủ E coli 18 1.3.2 Chủng chủ Bacillus subtilis Error! Bookmark not defined 1.4 Ứng dụng keratinase Error! Bookmark not defined 1.4.2 Ứng dụng công nghiệp Error! Bookmark not defined 1.4.3 Đối với môi trường sinh thái Error! Bookmark not defined 1.4.4.Ứng dụng y, dược học Error! Bookmark not defined 1.5 Tình hình nghiên cứu Error! Bookmark not defined 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới Error! Bookmark not defined 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Error! Bookmark not defined PHầN II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.1 Nguyên liệu Error! Bookmark not defined 2.2.Phương pháp Error! Bookmark not defined 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn Error! Bookmark not defined 2.2.2.Phản ứng PCR Error! Bookmark not defined 2.2.3 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn Error! Bookmark not defined 2.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.5 Điện di protein gel Polyacrylamide (SDS-PAGE) defined 2.2.6 Thiết kế vector biểu E Coli Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined 2.2.7 Biến nạp vào tế bào E.coli Error! Bookmark not defined 2.2.8 Biểu keratinase tái tổ hợp E.coli BL21 (DE3) Error! Bookmark not defined 2.2.9 Tổ hợp gen ker phương pháp Megaprimer Error! Bookmark not defined 2.2.10 Thiết kế vector biểu keratinase B.subtilis 168M not defined Error! Bookmark 2.2.11 Biến nạp vectormang gen keratinase tái tổ hợp B.subtilis 168M Error! Bookmark not defined 2.2.12 Biểu keratinase tái hợp B.subtilis 168M defined Error! Bookmark not 2.2.13 Thử hoạt tính keratinase Error! Bookmark not defined PHầN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN DEFINED ERROR! BOOKMARK NOT 3.1 Kết tách ADN tổng số Error! Bookmark not defined 3.2 Nhân gen keratinase PCR Error! Bookmark not defined 3.3.Biểu gen keratinase E.coli Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tách dòng gen KerE vector pJET1.2 để biểu E.coli Bookmark not defined 3.3.2 Kết phân tích trình tự gen Error! Error! Bookmark not defined 3.3.3 Thiết kế vector biểu E.coli Error! Bookmark not defined 3.3.4 Biểu gen Ker E.coli BL21Error! Bookmark not defined 3.4 Biểu gen kerB tế bào B.subtilis 168MError! Bookmark not defined 3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB phương pháp Megaprimer defined Error! Bookmark not 3.4.2 Tách dòng tổ hợp gen keratinase vector pTZ57RT E.coli TOP10F’ Error! Bookmark not defined 3.4.3 Thiết kế vector biểu Bacillus subtilis Error! Bookmark not defined 3.4.4 Biểu keratinase tế bào Bacillus subtilis 168M Error! Bookmark not defined 3.5 Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 B.subtilis 168MError! Bookmark not defined PHầN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ DEFINED ERROR! BOOKMARK NOT 4.1 Kết luận Error! Bookmark not defined 4.2 Kiến nghị Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng – Phó viện trưởng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện KH&CN Việt Nam, người thầy_người anh tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân – cô giáo tận tình hướng dẫn em suốt trình hoàn thành luận văn Trong trình nghiên cứu vừa qua, em nhận giúp đỡ bảo tận tình cán Phòng Hệ gen học chức năng, viện Nghiên cứu hệ gen Đặc biệt Th.S Nguyễn Thu Hiền giúp đỡ em trình nghiên cứu tiến hành thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo nghiên cứu giảng dạy Khoa Sinh, Khoa đào tạo sau đại học – Trường Đại học KHTN truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt năm qua Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ người thân gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn người bạn chia sẻ khó khăn thử thách sống công việc để em có kết Một lần em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 08 năm 2014 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT B.subtilis Bacillus subtilis bp Base pair(c DNA Deoxyribonucleic acid E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium Bromide IPTGIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Ker Keratinase LB Luria-Bertani µl Microlit PCR Polymerase Chain Reaction (Phvà B.sem nhis 168M chia Primer-F MPolymer Primer-R MMPolymer rARN Ribosomal ribonucleic acid VK Vi khul DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Số hiệu Trang Bảng Trình tư cặp mồi 21 Bảng Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng Thành phần gel cô 5% gel tách 10% polyacrymide 25 Bảng Thành phần phản ứng cắt với enzymeXhoI BamHI 26 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR1a 29 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR2 30 Bảng Hoạt tính keratinase từ chủng nghiên cứu 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Số hiệu Trang Hình Một số sản phẩm chứa keratin Hình Cấu trúc xoắnα gấp nếp β keratin Hình Cấu tạo phân tử keratinase Hình Vi khuẩn E.coli Hình Vi khuẩn B subtilis 10 Hình Vector biểu 19 Hình Sơ đồ nghiên cứu biểu gen Ker E.coli B.subtilis 22 Hình Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker promoter gen α-amylase chủng B subtilis 168M phương pháp Megarprimer 28 Hình Ảnh điện di DNA tổng số 33 Hình 10 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Keratinase 34 Hình 11 Điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn XhoI BamHI 36 Hình 12 Trình tự đọc mồi vector (T7 promoter T7 terminator) 37 Hình 13 Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn 39 Hình 14 Điện di protein gel polyacrylamide –SDS nồng độ 12,5% 40 Hình 15 Điện di đồ sản phẩm PCR 42 Hình 16 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra vector tách dòng enzyme giới hạn 43 Hình 17 Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] cắt kiểm tra SmaI KpnI 45 Hinh 18 Kết kiểm tra hoạt tính tế bào B subtilis 168M tái tổ hợp mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker] 46 Hình 19 Điện di dịch enzyme thô gel SDS-PGE 47 10 MỞ ĐẦU Ngày nay, ngành công nghệ sinh học chiếm vị trí quan trọng kinh tế nước ta Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp trọng đầu tư công nghệ then chốt lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp đời dựa sở thành tựu sinh học phân tử Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập khuếch đại gen từ genome sinh vật để nghiên cứu, biến đổi chuyển vào thể sinh vật khác Việc nâng cao hoạt tính khả tổng hợp enzyme kỹ thuật tái tổ hợp DNA ứng dụng rộng rãi Trong có tạo dòng sản xuất keratinase Keratinase enzyme có khả thủy phân protein cứng, cấu trúc phức tạp lông, tóc, móng, sừng Nhiều nghiên cứu ghi nhận keratinase thành viên nhóm protease serine Đây là nhóm enzyme thương ma ̣i , có nhiều ứng dụng quan trọng ngành công nghiê ̣p, trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin, ngành công nghiệp gia cầm công nghê ̣da Với bùng nổ ngành công nghiệp gia cầm, hàng năm tồn đọng hàng lông gà tự nhiên, điều gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường Trong đó, lông gà chiếm khoảng 90% keratin, việc thủy phân keratin đem lại ứng dụng to lớn, làm phân bón , keo, tạo axit amin serin , cystein prolin, đặc biệt tạo thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, xử lý lông vũ loại hóa chất phương pháp trước làm hàm lượng axit amin thức ăn tốn Trong đó, sử dụng keratinase trình thủy phân lông vũ để sản xuất thức ăn chăn nuôi không làm hàm lượng dinh dưỡng mà giá thành rẻ làm giảm ô nhiễm môi trường Hiê ̣n , keratinase đươ ̣c thu từ nhiề u nguồ n khác nấ m , xạ khuẩn , vi khuẩ n Trong đó, nhóm vi khuẩn có kh ả sinh keratinase cao, hoạt tin ́ h keratinase ghi nhận rộng rãi chủng từ chi Bacillus Streptomyces Tuy nhiên, khả sinh tổng hợp keratinase từ chủng hoang dại hạn chế, hoạt tính enzyme thấp thường lẫn tạp chất Do để đáp ứng nhu cầu ngày tăng keratinase trọng tâm nâng cao trình độ sản xuất keratinase tái tổ hợp thông qua tách dònggenvà 11 biểu gen Trên giới có nhiều nghiên cứu tách dòng gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương, xạ khuẩn hay nấm men hệ biểu E.coli, B.subtilis hoặcP.pastoris Ở Việt Nam việc nghiên cứu keratinase hạn chế, chưa có sở sản xuất keraitnase quy mô công nghiệp Vì với mục đích tìm chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả sinh karatinase cao để đưa vào sản xuất với qui mô lớn, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu biểu gen mã hóa keratinase tế bào Escherichiacoli Bacillus”  Mục tiêu đề tài Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩntái tổ hợp có khả sinh keratinase cao nhằm ứng dụng nông nghiệp công nghiệp  Nội dung nghiên cứu - Chọn dòng gen biểu keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại - Thiết kế vector tái tổ hợp biểu E.coli B.subtilis - Biểu gen mã hóa keratinase E.coli B.subtilis - Đánh giá mức độ biểu chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Keratin Keratin hợp chất sừng, thành phần da, tóc, lông, móng tay, móng guốc, sừng, len (Hình 1).Đây protein có cấu trúc bền vững, khó hòa tan, chứamột lượng lớn sulfua, axitamin, đặc biệt cystein (chiếm 24%), có axit amin khác như: glycin, alanin, serin valin Ngoài liên kết hydro nội phân tử liên phân tử, keratin có hàm lượng lớn lưu huỳnh cystein Chính cystein tạo thành cầu disulfide.Những cầu nối tạo từ nguyên tử lưu huỳnhliên kết với nhau, không dễ dàng hòa tan, không dễ dàng bị phân hủy enzyme thông thường như: trypsin, pepsin, papain… Tùy thuộc số lượng liên kết 12 cysteindisulfide chứa keratin, chia thành loại: keratin cứng tìm thấy móng guốc keratin mềm tìm thấy mô linh hoạt tóc da (Hình 1) Hình Một số sản phẩm chứa keratin Keratin chiếm khoảng 30% phần biểu bì tế bào sống 85% protein tế bào chết (lớp vảy sừng chết bên da) Trong tóc, keratin chiếm 6595% lông vũchiếmgần90% theotrọng lượng.Mỗi phân tử keratin nhỏ khoảng 10 nm, chúng liên kết với qua cầu disulfide, hydro với muối liên kết khác.Từ sợi keratin có chứa hàm lượng lưu huỳnh lớn ép thành bó keratin lớn Keratin có dạng cấu trúc xoắn α gấp nếp β[50],α-keratin chủ yếu tìm thấy động vật có vú β-keratin tạo thành chuỗi polypeptide dạng mảnh có chủ yếu da loài bò sát loài chim Cấu trúc α β-keratin tóc lông thấy chiếu xạ tia tia X Anpha- keratin (α-keratin): có tóc (kể lông cừu), sừng, móng tay, móng chân, móng guốc động vật có vú Cấu tạo sợi đơn protein liên kết với liên kết hydro Beta keratin (β-keratin): Cótrong móng tay móng vuốt loài bò sát, họ vỏ chelonians (ba ba, rùa, …), lông, mỏ, móng vuốt chim nhím, hình thành chủ yếu tấmβ Cấu trúc β cứng, cấu trúc α β nối với cầu nối disulfide (Hình 2) 13 Hình Cấu trúc xoắnα gấp nếp β keratin Dựa vào số lượng sulfur, keratin chia thành dạng keratin “mềm” keratin “cứng”[45] Keratin mềm tìm thấy da, có cầu nối disulfur mềm dẻo dễ dàng phá vỡ keratin cứng tìm thấy lông vũ, tóc, móng guốc, có nhiều cầu nối disulfur kéo dài ra, keratin cứng không hòa tan nước, khó phân hủy Trong tóc chủ yếu cấu tạo keratin cứng Keratin tồn phổ biến da động vật, sừng, tóc, lông với thành phần axit aminnhư: glutamic, lysin, cystein, alanin tyrosinđây hầu hết axit amin cần thiết mà thể không tự tổng hợp được,đóng vai trò quan trọng việc trì phát triển thể Mặc dù khó phân hủy enzyme thông thường chất thải keratin bị phân hủy vi khuẩn, xạ khuẩn nấm chúng tạo protease – keratinase Thủy phân keratin từ vi sinh vật nghiên cứu từ năm 1959[28], nhiên chế thủy phân từ vi khuẩn chưa nghiên cứu nhiều.Việc giảm cầu nối disulfur có ảnh hưởng đáng kể đến phân hủy keratin[9],[40]Keratinase enzyme, có khả phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan Các keratinase tham gia thủy phân chất thải keratin từ lông vũ công nghiệp chăn nuôi gia cầm tạo sản phẩm có giá trị thức ăn chăn nuôi, phân bón, polymer axit amin serin, cystein prolin 1.2 Keratinase Keratinasethuộcnhómcácprotease kiềm cókhả hoạt động mạnh trênkeratinkhông hòa tan Enzyme đóng vai tròquan trọngtrongviệc thủy phân cấu 14 trúc phức tạp keratin có tronglông vũ, tóc, lông cừu, collagenvàcasein,trong việc loại bỏcác rác tắc nghẽntrong cáchệ thốngxử lý nước thải Keratinase vi sinh vật chủ yếu enzyme ngoại bào sinh trưởng môi trường có chứa chất keratin có keratinase nội bào, chúng giúp cho enzyme thủy phân cầu disulfit, sulfite thiosulfate có chất Keratinase ngoại bào thủy phân cấu trúc keratin sừng, lông, móng cách giảm cầu disulfide keratin, trình có diện chất khử natri sulfit, DTT (dithiothreitol), mercaptoethanol, glutathion, cysteinvà thioglycolate Keratinase tạo từ nhiều nguồn vi sinh vật khác vi khuẩn, xạ khuẩn nấm Các enzyme tạo trình phân hủy chất keratin tóc, lông, sừng, …Các đặc tính hóa sinh lý sinh keratinase đa dạng Phần lớn keratinase hoạt động điều kiện tối ưu pH trung tính tới kiềm nhiệt độ từ 300C đến 600C Hơn kerainase có tiềm ứng dụng lớn nông nghiệp, dược học lĩnh vực y sinh học, ứng dụngtrong cáchệ thốngnước thải, thực phẩm, dệt may, dược phẩm,mỹ phẩm, keratinasecũngđượcsử dụng ngành công nghiệpthuộc datrongquá trìnhtẩy lôngcủadađộng vậtthay vìxử lýchúngvớisodium sulfide Ngoài ra, sử dụng keratinase sinh khối sinh học giải phần chuyển đổi lượng tái sử dụng nhiên liệu Keratinase enzyme thương mại hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với protease kiềm(Hình 3) bị ức chế thuốc ức chế giống ức chế protease serine[5].Khối lượng phân tử tùy theo loại sinh vật dao động từ 18 đến 35 kDa protease serine có khối lượng phân tử nhỏ lớn 90 kDa protease serine có khối lượng lớn 15 Hình 3: Cấu tạo phân tử enzyme Keratinase Ðến nay, keratinase nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, Bacillus nghiên cứu nhiều Nhiều chủng B licheniformis B subtilis mô tả có khả thủy phân keratin, loài khác B pumilus B cereus có khả tổng hợp keratinase Sinh tổng hợp keratinase nghiên cứu xạ khuẩn, chủ yếu từ chi Streptomyces Nhóm vi khuẩn phân lập từ vùng đất khác nhau, có khả thủy phân loạt chất chứa keratin tóc, len lông Tính chất: Keratinase thuỷ phân thành axit amin: Với tính chất thuỷ phân keratinase, phá vỡ cầu nối disunfua keratin làm đứt liên kết vòng xoắn Như vậy, sau thuỷ phân hợp chất keratin lông vũ phân huỷ chia nhỏ thành axit amin peptit ngắn Khi protein keratin mang đầy đủ tính chất protein tan là: Tính hoà tan, kết tủa, điện ly lưỡng tính, thuỷ phân phản ứng màu đặc trưng Keratinase chủ yếu công vào liên kết disulfide (S-S), làm suy giảm protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen sợi protein khác pH nhiệt độ: Keratinase hoạt động nhiệt độ từ 30oC - 80oC nhiệt độ tối ưu là: 50oC enzyme ổn định bảo quản -20oC[60] Keratinase bền vững khoảng pH từ 6,0 - 9,0 pH tối ưu 7,5 [51].; 16 Chất kìm hãm: Khi bổ sung đường sucrose lactose làm ức chế tổng hợp keratinase[51] Chất có nồng độ lượng chất cao làm ức chế tổng hợp keratinase[51] Khi bổ sung chất có chứa ion kim loại nặng hoá trị hai như: Cu2+, Ag2+, Hg2+ Pb2+ làm ức chế hoạt động keratinase Một số hoá chất khác ức chế phản ứng enzyme keratinase như: EDTA,…[30] Chất hoạt hoá: Theo nhiều nghiên cứu giới bổ sung chất có chứa ion kim loại hoá trị hai như: Ca2+, Mg2+, Mn2+ kích thích hoạt động keratinase[30] Đặc tính hóa sinh keratinase Các đặc tính enzyme tạo từ vi khuẩn đa dạng, tùy thuộc vào loại vi sinh vật sản xuất keratinase Các enzyme chủ yếu enzyme ngoại bào tiết từ vi sinh vật Phần lớn keratinase tiết từ vi khuẩn có pH kiềm trung tính, pH tối ưu từ 7,5-9,0 Tuy nhiên, số keratinase khác tối ưu hoạt động phạm vi này, pH hoạt động kiềm hóa[10] pH axít[21],[41] Một số keratinase ổn định khoảng pH rộng,như keratinase chủng Nocardiopsis TOA-1, ổn định khoảng pH từ 1,5-12, 24h 30°C[37] Trọng lượng phân tử keratinase xác định Mặc dù trọng lượng phân tử enzyme từ 18 kDa[43] đến 240 kDa [13][11] đa số keratinase có trọng lượng phân tử thấp 50 kDa Phần lớn keratinase đơn enzyme, nhiên phân lớp đa enzyme ghi nhận[18][52].Keratinase có trọng lượng phân tử cao thường kết hợp với keratinase có đặc tính metalloprotease chúng có nguồn gốc từ chịu nhiệt Ảnh hưởng ion kim loại bất hoạt hoạt tính keratinase nghiên cứu Gần nghiên cứu Gupta Ramnani [24]cho thấy ion kim loại hóa trị Ca2+, Mg2+ Mn2+ có xu hướng kích thích hoạt tính enzyme keratinase Ảnh hưởng liên quan tới việc trì hoạt tính enzyme tạo ổn định phức hợp chất enzyme Ngoài ion kim loại bảo vệ cho enzyme 17 chống lại biến tính nhiệt độ[6],[40] Ngược lại, chuyển trạng thái kim loại nặng khác Cu2+, Ag+, Hg2+ Pb2+ nguyên nhân bất hoạt enzyme keratinase Các keratinase thường ổn định diện dung môi hữu DMSO, Triton X-100 1.3.Một số chủng biểu 1.3.1 Chủng chủ E coli E coli vi khuẩn Gram âm, hiếu khí kị khí, không sinh bào tử Chúng có máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ cấp nhiễm sắc thể đơn với khoảng triệu cặp bazơ Tế bào E coli có khả sinh sản với tốc độ nhanh môi trường nuôi cấy đơn giản, trung bình 20 phút chúng lại phân chia lần Đặc biệt, E coli có khả thu nhận nhiều yếu tố di truyền từ môi trường plasmid, phage với khả chép DNA lớn Chính vậy, chúng cải biến để sử dụng vật chủ hữu hiệu kỹ thuật tách dòng biểu gen, có nhiều chủng sử dụng như: E coli BL21(DE3), E coli DH5 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Văn Hiếu Phí Quyết Chiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010), "Tách dòng biểu gen mã hóa protease serin chủng Bacillus subtilis HT 24 Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp 841-846 Văn Thị Hạnh Trần Tích Cảnh (1993), "Tạo protein hoà tan từ kazetine lông vũ phế liệu.", Khoa học công nghệ., 2, pp 1-6.", Khoa học công nghệ, 2, pp 16 Nguyễn Đình Kim (2001), "Giáo trình vi sinh vật đất", pp Nguyễn Đình Quyến Trần Thị Lan Phương (2001), "Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải keratin dùng để chuyển hóa sinh học lông gia cầm", Sinh học, 23(2), pp 27-30 Tiếng anh A Brandelli (2005.), " Production of an extracellular keratinase from Chryseobacterium sp growing on raw feathers", J Biotechnol;, pp 35-37 A Gessesse., R Hatti-Kaul., B.A Gashe., Mattiasson B (2003), "Novel alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather Enzyme and Microbial Technology", 32, pp 519-524 18 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Anbu P., Hilda A., Sur H W., Hur B K., Jayanthi S ( 2008), "Extracellular keratinase from Trichophyton sp HA-2 isolated from feather dumping soil.", Int Biodeterior Biodegrad., 62, pp 287-292 B Zhang, Z Sun, D Jiang, Niu T (2009), "Isolation and purification of alkaline keratinase from Bacillus sp 50-3", African Journal of Biotechnology, 8, pp B Bockle., Muller R (1997), "Reduction of Disulfide Bonds by Streptomyces pactum during Growth on Chicken Feathers Appl Environ Microbiol", 63, pp 790792 Balaji S., Kumar M S., Karthikeyan R., Kumar R., Kirubanandan S., Sridhar R., Sehgal P K (2008), "Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC (9102).", World J Microbiol Biotechnol., 24, pp 2741-2745 Bernal C., Diaz I., Coello N (2006), "Response surface methodology for the optimization of keratinase production in culture medium containing feathers produced by Kocuria rosea", Can J Microbiol., 52(5), pp 445-50 Brandelli A (2008 ), "Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond.", Food Bioprocess Technol 1, pp 105-116 Cai C G., Chen J S., Qi J J., Yin Y., Zheng X D (2008), "Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain", J Zhejiang Univ Sci B., 9(9), pp 713-20 Chao Y P., Xie F H., Yang J., Lu J H., Qian S J (2007), "Screening for a new Streptomyces strain capable of efficient keratin degradation", J Environ Sci (China) 19(9), pp 1125-8 Chitte R R., Dey S (2001), "Cloning and expression of an actinokinase gene from a thermophilic Streptomyces in Escherechia coli", Indian J Exp Biol., 39(5), pp 410-5 Daroit D J., Corrêa A P F., Brandelli A (2009), "Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp P45 isolated from the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicus.", Int Biodeterior Biodegrad., 63, pp 358-363 Dubendorff J.W Studier F.W (1991), " Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.", J Mol Biol 219, pp 45-59 F Xie., Y Chao., X Yang., J Yang., Z Xue Y Luo., Qian S (2009), " Purification and characterization of four keratinases produced by Streptomyces sp strain 16 in native human foot skin medium Bioresour Technol", 101, pp 344-350 Friedrich A B., Antranikian G (1996), "Keratin Degradation by Fervidobacterium pennavorans, a Novel Thermophilic Anaerobic Species of the Order Thermotogales", Appl Environ Microbiol., 62(8), pp 2875-2882 Ghosh A., Chakrabarti K., Chattopadhyay D (2008), "Degradation of raw feather by a novel high molecular weight extracellular protease from newly isolated Bacillus cereus DCUW", J Ind Microbiol Biotechnol., 35(8), pp 825-34 Epub 2008 Apr 22 19 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Gupta Rani, Ramnani Priya (2006), "Microbial keratinases and their prospective applications: an overview", Applied Microbiology and Biotechnology, 70(1), pp 21-33 Gushterova A., Vasileva-Tonkova E., Dimova E., Nedkov P., Haertlé T (2005), "Keratinase production by newly isolated Antarctic actinomycete strains.", World J Microbiol Biotechnol., 21, pp 831-834 H Shi-Hung Lin, Li-Jung Yin, Jiang Shann-Tzong (2009), "Cloning, Expression, and Purification of Pseudomonas aeruginosa Keratinase in Escherichia coli AD494(DE3)pLysS Expression System", J Agric Food Chem, 57, pp 3506–3511 H Gradisar., J Friedrich., I Krizaj., Jerala R ( 2005.), " Similarities and specificities of fungal keratinolytic proteases: comparison of keratinases of Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to some known proteases Appl Environ Microbiol; " 71, pp 3420-3426 Hiếu Nguyễn Văn, Tiến Phí Quyết, Minh Nghiêm Ngọc, Hy Lê Gia (2010), "Tách dòng biểu gen mã hóa protease serin chủng Bacillus subtilis HT 24 Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp 841-846 Hong Hu, Jun He, Bing Yu, Ping Zheng, Zhiqing Huang, Xiangbing Mao, Jie Yu, Guoquan Han, Chen Daiwen (2013), "Expression of a keratinase (kerA) gene from Bacillus licheniformis in Escherichia coli and characterization of the recombinant enzymes.", Biotechnol Lett, 35(2), pp 239-44 Ionata E., Canganella F., Bianconi G., Benno Y., Sakamoto M., Capasso A., Rossi M., La Cara F (2008), "A novel keratinase from Clostridium sporogenes bv pennavorans bv nov., a thermotolerant organism isolated from solfataric muds", Microbiol Res., 163(1), pp 105-12 Epub 2006 Nov J.J Noval., Nickerson W.J (1995), "Decomposition of native keratin by Streptomyces fradiae J Bacteriol", 77, pp 251-263 Kumar A G., Swarnalatha S., Gayathri S., Nagesh N., Sekaran G (2008), "Characterization of an alkaline active-thiol forming extracellular serine keratinase by the newly isolated Bacillus pumilus", J Appl Microbiol., 104(2), pp 411-9 Epub 2007 Oct Lin X Lee C.G., Casale SE and Shih J.C (1992), " Purification and characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus Licheniformis strain ", J Appl Environ Ailcrobiol., 58, pp 3271-3275 Lin X Wong S L., Miller E S., Shih J C (1997), "Expression of the Bacillus licheniformis PWD-1 keratinase gene in B subtilis", J Ind Microbiol Biotechnol, 19(2), pp 134-8., 19(2), pp 134-138 Liu B1, Zhang J, Gu L, Du G, Chen J, X Liao (2014), "Comparative Analysis of Bacterial Expression Systems for Keratinase Production.", Appl Biochem Biotechnol., pp Liu B, Zhang J, Li B, Liao X, Du G, J Chen (2013), " (2013) Expression and characterization of extreme alkaline, oxidation-resistant keratinase from Bacillus licheniformis in recombinant Bacillus subtilis WB600 expression system and its 20 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 application in wool fiber processing.", Word J Microbiol Biotechnol 29, pp 825832 Longeveld JPM, Wang, JJ, Shih, GC, Garssen, Shih (2003), " Enzymatic degradation of prion protein from infected cattle and sheep brain stem EMBO J (submitted)", EMBO J (submitted)pp Matsui T., Yamada Y., Mitsuya H., Shigeri Y., Yoshida Y., Saito Y., Matsui H., Watanabe K (2009), "Sustainable and practical degradation of intact chicken feathers by cultivating a newly isolated thermophilic Meiothermus ruber H328", Appl Microbiol Biotechnol., 82(5), pp 941-50 Epub 2009 Feb Mitsuiki S., Sakai M., Moriyama Y., Goto M., Furukawa K (2002), "Purification and some properties of a keratinolytic enzyme from an alkaliphilic Nocardiopsis sp TOA-1", Biosci Biotechnol Biochem., 66(1), pp 164-7 Nam G W., Lee D W., Lee H S., Lee N J., Kim B C., Choe E A., Hwang J K., Suhartono M T., Pyun Y R (2002), "Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe", Arch Microbiol., 178(6), pp 538-47 Epub 2002 Oct 16 Novagen (1998), " pET System Vectors and Hosts Instruction manual Catalog no TB038", pp P Bressollier., F Letourneau., M Urdaci., Verneuil B (1999), "Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus Appl Environ Microbiol.", 65, pp 2570-2576 Papadopoulos M.C ( 1986 ), "The effect of enzymatic treatment on amino acid content and nitrogen characteristics of feather meal.", Anim Feed Sci Technol, 16, pp 151-156 R Tsuboi., I Ko., K Takamori., Ogawa H (1989), " Isolation of a keratinolytic proteinase from Trichophyton mentagrophytes with enzymatic activity at acidic pH Infect Immun; " 57, pp 3479-3483 Radha S., P Gunasekaran (2009), "Purification and characterization of keratinase from recombinant Pichia and Bacillus strains.", Protein Expr Purif, 64(1), pp 2431 Riessen S., Antranikian G (2001), "Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity", Extremophiles., 5(6), pp 399-408 Sambrook, J., Fritsch, E F., Maniatis, T (1989), "Molecular Cloning a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor, 1, pp Suh H J., Lee H K (2001), "Characterization of a keratinolytic serine protease from Bacillus subtilis KS-1", J Protein Chem., 20(2), pp 165-9 Syed D G., Lee J C., Li W J., Kim C J., Agasar D (2009), "Production, characterization and application of keratinase from Streptomyces gulbargensis", Bioresour Technol., 100(5), pp 1868-71 Epub 2008 Nov 21 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Szabo L., Benedek A., Szabo M L., Barabas G (2000), "Feather degradation with a thermotolerant Streptomyces graminofaciens strain.", World J Microbiol Biotechnol , 16, pp 252-255 Tec Mo Bi (2005), "Bacillus subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions." Tork SE, Shahein YE, El-Hakim AE, Abdel-Aty AM, MM Aly (2013), "Production and characterization of thermostable metallo-keratinase from newly isolated Bacillus subtilis NRC 3.", Int J Biol Macromol, 55(169-75), pp W Akhtar., Edwards H.G (1997 ), "Fourier-transform Raman spectroscopy of mammalian and avian keratotic biopolymers Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc;" 53A, pp 81-90 Williams C.M., Richtcr C.S., J.C.I Mackenzie J.R and Shih (1990 ), "Isolation, identification and characterization of a feather-degrading bacterium", J Appl Environ Microbiol, 56, pp 1509-1515 Bockle B., Galunsky B., Muller R (1995), "Characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530", Appl Environ Microbiol, 61(10), pp 3705-10 Brandelli A., Daroit D J., Riffel A (2010), "Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications", Appl Microbiol Biotechnol, 85(6), pp 1735-50 Lin H H., Yin L J., Jiang S T (2009), "Cloning, expression, and purification of Pseudomonas aeruginosa keratinase in Escherichia coli AD494(DE3)pLysS expression system", J Agric Food Chem, 57(9), pp 3506-11 Yamamura S., Morita Y., Hasan Q., Rao S R., Murakami Y., Yokoyama K., Tamiya E (2002), "Characterization of a new keratin-degrading bacterium isolated from deer fur", J Biosci Bioeng, 93(6), pp 595-600 22 [...]... sinh karatinase cao để có thể đưa vào sản xuất với qui mô lớn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào Escherichiacoli và Bacillus  Mục tiêu đề tài Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩntái tổ hợp có khả năng sinh keratinase cao nhằm ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp  Nội dung nghiên cứu - Chọn dòng gen biểu hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang... thì trọng tâm là nâng cao trình độ sản xuất keratinase tái tổ hợp thông qua tách dònggenvà 11 biểu hiện gen Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách dòng và hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương, xạ khuẩn hay nấm men trong hệ biểu hiện E.coli, B.subtilis hoặcP.pastoris Ở Việt Nam hiện nay việc nghiên cứu keratinase còn hạn chế, chưa có cơ sở nào sản xuất keraitnase ở quy mô công nghiệp Vì... vi khuẩn hoang dại - Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B.subtilis - Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B.subtilis - Đánh giá mức độ biểu hiện của chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Keratin Keratin là một hợp chất sừng, thành phần chính trong da, tóc, lông, móng tay, móng guốc, sừng, răng và len (Hình 1).Đây là protein có cấu trúc bền... Hình 3: Cấu tạo phân tử của enzyme Keratinase Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong đó Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất Nhiều chủng B licheniformis và B subtilis được mô tả có khả năng thủy phân keratin, những loài khác như B pumilus và B cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ khuẩn, chủ yếu là từ các chi... 12 cysteindisulfide chứa trong keratin, có thể chia thành 2 loại: keratin cứng được tìm thấy trong móng guốc và keratin mềm tìm thấy trong mô linh hoạt như tóc và da (Hình 1) Hình 1 Một số sản phẩm chứa keratin Keratin chiếm khoảng 30% phần biểu bì của các tế bào sống và 85% protein của các tế bào chết (lớp vảy hoặc sừng đã chết ở bên ngoài da) Trong tóc, keratin chiếm 6595% và ở lông vũchiếmgần90%... nhận[18][52] .Keratinase có trọng lượng phân tử cao thường kết hợp với các keratinase có đặc tính của metalloprotease hoặc chúng có nguồn gốc từ chịu nhiệt Ảnh hưởng của các ion kim loại và các bất hoạt hoạt tính keratinase đã và đang được nghiên cứu Gần đây các nghiên cứu của Gupta và Ramnani [24]cho thấy các ion kim loại hóa trị 2 như Ca2+, Mg2+ và Mn2+ có xu hướng kích thích hoạt tính enzyme keratinase. .. trí quan trọng trong nền kinh tế nước ta Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đang được chú trọng đầu tư và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời dựa trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một gen từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể... cải biến để sử dụng như một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng cùng như biểu hiện gen, có rất nhiều chủng được sử dụng như: E coli BL21(DE3), E coli DH5 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1 2 3 4 5 6 Nguyễn Văn Hiếu Phí Quyết Chiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010), "Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protease serin của chủng Bacillus subtilis HT 24 trong Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh... tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi Trong đó có tạo dòng và sản xuất keratinase Keratinase là enzyme có khả năng thủy phân các protein cứng, các cấu trúc phức tạp trong lông, tóc, móng, sừng Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase là thành viên của nhóm protease serine Đây là nhóm enzyme thương ma ̣i , có nhiều ứng dụng quan trọng trong. .. hiếm như serin, cystein và prolin 1.2 Keratinase Keratinasethuộcnhómcácprotease kiềm cókhả năng hoạt động mạnh trênkeratinkhông hòa tan Enzyme này đóng vai tròquan trọngtrongviệc thủy phân cấu 14 trúc phức tạp của keratin có tronglông vũ, tóc, lông cừu, collagenvàcasein ,trong việc loại bỏcác rác tắc nghẽntrong cáchệ thốngxử lý nước thải Keratinase ở vi sinh vật chủ yếu enzyme ngoại bào khi sinh trưởng