NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THAN Bacillus anthracis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NGỌC BẢO NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THAN Bacillus anthracis Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62420107 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 Công trình đƣợc hoàn thành Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đoàn Trọng Tuyên TS Lê Thu Hà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp vào hồi ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Bệnh than bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân nhiễm trực khuẩn than B.anthracis B anthracis thường gây bệnh cho loại động vật móng guốc, ăn cỏ như: trâu, bò, ngựa, dê, cừu…người mắc bệnh ngẫu nhiên tiếp xúc trực tiếp với động vật mắc bệnh sản phẩm từ động vật như: thịt, sữa, da, lông[1] Vi khuẩn than xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm bệnh cảnh lâm sàng đường lây phong phú, gây tử vong cao, tồn bền vững môi trường Chính vì, dễ sản xuất tàng trữ nên B.anthracis thường nước sử dụng loại vũ khí sinh học phòng chống đánh trả, có nguy sử dụng chiến tranh [4] Phòng chống bệnh than vấn đề mang tính cấp thiết, sử dụng kháng biện pháp ngắn hạn, chỗ Biện pháp bảo vệ lâu dài chủ động diện rộng tiêm phòng vắc-xin cho nhóm nguy cao: người dân vùng dịch, nhân viên y tế trực tiếp điều trị bệnh nhân than, nhân viên xét nghiệm phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, dự phòng bệnh than cho quân nhân thực nhiệm vụ điều kiện tác chiến có nguy sử dụng trực khuẩn than vấn đề nhiều quốc gia giới đặt Hiện nay, quan điểm sử dụng vaccine phòng bệnh than cho người có hai xu hướng khác Đối với nước như: Anh, Mỹ, vaccine phòng bệnh than đưa vào sử dụng loại vaccine phòng bệnh than hấp phụ, sử dụng phần cấu trúc tế bào với kỳ vọng gây miễn dịch đặc hiệu, an toàn, phản ứng phụ so với vaccine toàn tế bào Trường phái nước như: Nga; Trung quốc, Ấn độ,, sản xuất vaccine bào tử than, toàn tế bào với mục đích gây đáp ứng miễn dịch nhanh sản xuất đơn giản đầu tư Do cần có nghiên cứu cụ thể hai phương pháp để có phương án phù hợp với Việt Nam Tại Việt Nam, hàng năm dịch than xảy gia súc lây sang người chưa có vaccine dự phòng cho người Đến nay, chưa có nghiên cứu phù hợp chủng gây bệnh Việt Nam chủng dùng sản xuất vaccine Việc nhập vaccine phòng bệnh than cho người có nhiều khó khăn không đáp ứng yêu cầu chủ động phòng bệnh Chính để đáp ứng yêu cầu cộng đồng, yêu cầu Quân đội triển khai nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sản xuất vaccine than Bacillus anthracis” nhằm mục đích: Tuyển chọn chủng sản xuất vaccine chủng than gây bệnh đầy đủ độc lực Việt Nam để đánh giá thử thách Sản xuất hai loại vaccine phòng bệnh than với hai nguyên lý khác quy mô phòng thí nghiệm Đánh giá tính an toàn, tính sinh miễn dịch hiệu lực bảo vệ hai loại vaccine than động vật Những đóng góp luận án: Phân lập chủng than (B.anthracis) từ ổ dịch cũ, từ mẫu lâm sàng có tính đại diện cho vùng dịch (Lai Châu, Hà Giang) Các chủng phân lập từ môi trường chứng khẳng định ổ dịch lưu hành tự nhiên địa phương Đóng góp xây dựng ngân hàng chủng nhóm B cereus, chủng than độc lực không độc lực Tuyển chọn chủng sản xuất vaccine phù hợp có tính tương đồng cao, có hiệu lực bảo vệ với chủng gây bệnh phân lập Việt Nam Giải trình tự đăng ký vùng gene Pacủa chủng độc lực Việt Nam ngân hàng gene NCBI Xây dựng quy trình sản xuất hai loại vaccine phòng bệnh than, đánh giá tính an toàn, tính sinh miễn dịch hiệu lực bảo vệ mô hình động vật Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh than hấp phụ sử dụng cho người lần đầu áp dụng Việt Nam quy mô phòng thí nghiệm Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh than - anthrax 1.1.1 Đặc điểm lưu hành bệnh than giới 1.1.2 Đặc điểm lưu hành bệnh than nước 1.1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh than 1.1.4 Dự phòng điều trị dự phòng bệnh than 1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn than B anthracis 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Hình thể 1.2.3 Tính chất phát triển 1.2.4 Khả đề kháng phương thức tồn vi khuẩn than 1.2.4.1 Sức đề kháng 1.2.4.2 Phương thức tồn 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên 1.2.6 Độc tố trực khuẩn than 1.2.7 Cấu trúc hệ thống gene B anthracis 1.2.8 Đặc điểm chủng B anthracis dự tuyển sản xuất vaccine 1.3 Qui trình sản xuất vaccine phòng bệnh than Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu:  Chủng B.anthracis + 02 chủng độc lực (ký hiệu: Toxin) không độc lực (Non Toxin) Học viện Quân y cung cấp + 03 chủng vi khuẩn Bacillus anthracis VCM1167 chủng B anthracis VCM1166 BaVCM1168; Hai chủng BaVCM1167 BaVCM1166 có nguồn gốc từ chủng 34F2 FAO cung cấp + 01 chủng ký hiệu Vaccine lưu giữ Khoa vi sinh vật- Viện Y học dự phòng Quân đội + Chủng phân lập từ mẫu môi trường mẫu bệnh phẩm lâm sàng + Trình tự chủng ngân hàng gene: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi http://patricbrc.org/portal/portal/patric/Blast? dm=result&pk=-466528958  Vaccine phòng bệnh than - Vaccine bào tử than sống giảm độc lực, toàn tế bào (TTB) từ chủng dự tuyển - Vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) từ chủng dự tuyển 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Sinh phẩm, hoá chất nghiên cứu a Môi trường nuôi cấy, phân lập tuyển chọn chủng B anthracis b Sinh phẩm PCR: c Sinh phẩm giải trình tự gene hãng ABI cung cấp d Kháng huyết kháng nguyên: e Định lượng kháng thể: f Thanh định danh trực khuẩn bacillus API 50CHB/E API 20E ( Pháp) 2.2.2 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 2.2.2.1 Máy móc dụng cụ - Tủ ấm 370C, Memmert, kính hiển vi Olympus, tủ lạnh âm (-200C) - Máy đông khô Edward 3400 – Anh quốc - Buồng cấy vô trùng Class II Nuaire – USA - Máy Khuếch đại gene Parking Elmer 2400 ( Mĩ) - Máy điện di Power pac 300 ( Bio - rad) - Máy ly tâm, máy đo MacFanland, máy ủ (370C) - Máy sequencer 3130 genetic Analyzer –ABI (Mỹ) - Cân điện tử, hộp Roux, đĩa Petri dụng cụ chuyên dùng 2.2.2.2 Dụng cụ tiêu hao 2.2.2.3 Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắng khỏe mạnh: 18 – 22g/con - Chuột lang khỏe mạnh: 250 – 350 g/con - Thỏ khỏe mạnh trọng lượng 2,5 – 3,5 kg/con (thỏ newzeland Trung tâm nghiên cứu dê, thỏ Xuân Canh Ba Vì cung cấp) 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng sản xuất vaccine chủng vi khuẩn than gây bệnh làm chủng thử thách:  Kỹ thuật phân lập định danh vi khuẩn:  Phƣơng pháp xác định khả gây bệnh thực nghiệm: - Phương pháp xác định độc tính cấp LD50 chủng than độc lực  Phƣơng pháp phát B anthracis yếu tố độc lực kỹ thuật sinh học phân tử - Kỹ thuật PCR semi-Nested PCR xác định gene độc lực B.anthracis - Kỹ thuật giải trình tự gene so sánh trình tự vùng gene: 2.3.2 Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine 2.3.2.1 Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine bào tử sống giảm độc lực - Kiểm tra chủng giống Chủng Bacillus anthracis BaVCN1167 đông khô Hoàn nguyên chủng với canh thang TSB (370C/6h) (370C/hhggggiờ)giờ) - Kiểm tra khiết Thạch dinh dưỡng (NA) 370C/24 Nhân chủng canh thang TSB 370C/15 - Chọn khuẩn lạc Nuôi cấy thu sinh khối VK Thạch NA hộp Roux 37oC/48 Gặt vi 37 khuẩn C/48 giờtá dược (12ml/hộp Roux) Bất hoạt vi khuẩn (650C/1giờ) - Kiểm tra khiết Phân 0,5 ml dịch vi khuẩn vào lọ đông khô - Kiểm tra độ sống - Kiểm tra vật lý, độ ẩm - Kiểm tra an toàn chung Đông khô vaccine máy đông khô - Kiểm tra đáp ứng miễn dịch công hiệu Vắc xin thành phẩm Hình 1: Quy trình sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực Dsfdfgd Fgfgh Ghj 2.3.2.2 Phƣơng pháp sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) Môi trường nhân giống (1) Nhân giống 24 h Môi trường lên men Tiếp giống 10% Tối ưu điều kiện môi trường (2) Lên men (2) (3) Kiểm tra tốc độ sinh trưởng (4a) (4b) Xác định lượng protein tạo thành Thu mẫu sau 36h lên men (5) Loại bỏ tế bào Bổ sung amluminum hydroxide 0.1% Kiểm tra protein phản ứng Western, ELISA (7) (6) Tủa cồn 50 % (9) (8) Chia nhỏ đông khô (10) Hình 2 Quy trình sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) 2.2.2.2.1 Các bƣớc thực quy trình lên men: 2.3.2.2.2 Các phƣơng pháp áp dụng sản xuất đánh giá độ tinh protein PA vaccine hấp phụ  Lựa chọn môi trường thích hợp lên men chủng dự tuyển sản xuất vaccine  Điều kiện môi trường sinh tổng hợp protein PA B.anthracis  Kỹ thuật thu nhận protein PA [119]  Xác định độ tinh kỹ thuật điện di gel polyacrylamide 12,6 %  Tinh protein phương pháp tủa Ethanol  phương pháp sắc ký trao đổi ion  Sắc ký lọc gel Biogel P100  Phương pháp Western Blot [3, 25] 2.3.3 Phƣơng pháp đánh giá tính an toàn sinh miễn dịch vaccine phòng bệnh than 2.3.3.1 Kỹ thuật xác định độc tính cấp vaccine động vật thực nghiệm (LD50) - Cách xác định LD50 theo phương pháp Kaerker behrens - Cách tính LD50 theo công thức Spearman-Karber 2.3.3.2 Đánh giá tính an toàn vaccine: 2.3.3.3 Kỹ thuật gây miễn dịch thỏ Máu Máu tuần Máu Máu 4 tuần tuần Tiêm mũi tuần tuần 10 tuần Tiêm mũi Hình 3: Lịch tiêm thời gian lấy máu đánh giá đáp ứng miễn dịch thỏ tiêm vaccine 2.3.3.4 Định lƣợng kháng thể (anti-PA) kháng kháng nguyên bảo vệ Pa-83 Kda từ huyết thỏ 2.3.3.5 Phƣơng pháp đánh giá vaccine phòng bệnh than tiêu chuẩn kiểm định vaccine phòng bệnh than Bảng Tiêu chuẩn chất lƣợng vaccine bào tử than, sống giảm độc lực TT Chỉ tiêu Kiểm tra vật lý pH Thuần khiết (*) Độ sống (*) Độ ẩm tồn dư Độ ổn định Chí nhiệt tố Tính sinh miễn dịch thỏ Tiêu chuẩn - Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không chảy nước - Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch đồng nhất, không vẩn cặn 6,8-7,5 - Hình thái đặc trưng trực khuẩn Than, Gram (+) - Không có tạp nhiễm x 108 – x 108 CFU/ml  3% Độ sống đạt 1x108 - 5x108 CFU/ml đến năm, bảo quản nhiệt độ 2oC - 8oC - Đánh giá yếu tố gây sốt gây viêm vaccine, tiêm thỏ Vết tiêm phản ứng viêm, Thỏ không tăng nhiệt sau tiêm - Liều tiêm: + TTB 0,5ml x 108tbvk/thỏ - Hiệu giá, hàm lượng kháng thể thỏ tiêm vaccine (u/ml = ng/ml) 10 Công hiệu, đánh giá thử thách - Sau 10 ngày thử thách (ngày 21-30), với phác đồ tiêm vaccine 0,14 ngày: + Chuột chứng: Chết 100% + Chuột tiêm vaccine liều: + 107btvk/ml/con: sống 90% + 108btvk/ml /con: sống 100% Bảng 2 Tiêu chuẩn vaccine hấp phụ phòng bệnh than AVA TT Chỉ tiêu Kiểm tra vật lý pH Vô trùng Độ sống Aluminum hydrorid aluminum potassium sulfate formaldehyde Benzethorium chlorid Độ ẩm tồn dư 10 Chí nhiệt tố 11 Tính sinh miễn dịch thỏ 12 Công hiệu, đánh giá thử thách Tiêu chuẩn - Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không chảy nước - Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch đồng nhất, không vẩn cặn 6,8 - 7,5 - Không nhiễm vi khuẩn, nấm, vi sinh vật khác Không 0,65mg / liều (AVA-Mỹ) 0,52 mg / liều (Merck) 0,01% (AVA-Mỹ) 0,0025% - 0,01%  3% - Đánh giá yếu tố gây sốt, gây viêm vaccine thỏ Vết tiêm phản ứng viêm, thỏ không tăng nhiệt sau tiêm - Liều tiêm: + AVA 0,1ml x 50µg/thỏ - Hiệu giá, hàm lượng kháng thể thỏ tiêm vaccine (u/ml = ng/ml) - Hiệu lực bảo vệ vaccine tăng theo liều tiêm nồng độ kháng nguyên PA83 2.3.3.6 Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu vaccine AVA 2.3.3.7 Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu vaccine TTB: 2.4 Quy trình, kỹ thuật đông khô vaccine 2.5 Xử lý số liệu: Thống kê xử lý số liệu theo thuật toán y học phần mềm nghiên cứu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG SẢN XUẤT VẮC XIN VÀ CHỦNG THỬ THÁCH 3.1.1 Kết phân lập định danh vi khuẩn than từ loại mẫu khác Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng mẫu môi trường thu thập phân lập Khoa Vi sinh vật viện Y học dự phòng Quân đội Mẫu phân lập chọn lọc môi trường thạch máu, sau lựa chọn khuẩn lạc, nhuộm soi hình thể cấu trúc, tính chất bắt màu trình tự xếp Các chủng nghi ngờ định danh API 50CHB/E API 20E, để xác định tính chất sinh vật hóa học định danh phần mềm hãng BioMerieux Bảng 1: Kết định danh chủng nghi ngờ từ mẫu bệnh phẩm chủng đƣợc cung cấp kit API 50CHB/E TT Ký hiệu mẫu Nguồn mẫu Số mẫu/ chủng Nguồn gốc Toxin Bệnh nhân HVQY 01 Chủng Non Toxin Bệnh nhân HVQY 01 Chủng Vaccine Viện VSPDQD 01 Chủng BaVCM1167 01 Chủng Ba VCM 1168 01 Chủng 1NS 01 Thể da 4NS 01 Thể dàyruột 3KV (3B) Khâu Vai - HG 01 Thể da 18C Tuần Giáo - Điện Biên 01 Thể da Viện CNSH cung cấp Viện CNSH cung cấp Niêm Sơn-Mèo Mạc-Hà Giang Niêm Sơn-Mèo Vạc-HG Kết định danh Bacillus anthracis (99,7%) Bacillus cereus II (99,9%) Bacillus cereus II (99,9%) Bacillus anthracis (99,9%) Bacillus anthracis (99,6%) Bacillus cereus (99,9%) Bacillus anthracis (99,8%) Bacillus anthracis (99,1%) VK không mọc Kết bảng cho thấy: Kết định danh xác định 05 chủng trực khuẩn than (B anthracis) từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng mẫu chủng cung cấp với độ tin cậy 99%: Toxin, BaVCM1167, BaVCM1168, 4NS, 3KV Bảng 3.2 Kết định danh chủng nghi ngờ từ mẫu môi trƣờng kit API 50CHB/E T T Điểm thu thập mẫu Khâu Vai- Hà Giang Quỳnh Nhai- Sơn La Trung Thu- Tủa chùaĐiện Biên Niêm Sơn- Niêm Tòng – Mèo Vạc – Hà Giang Số mẫu Đất (nơi bò chết) 03 Đất (nơi chôn) 02 Phân bò mắc bệnh 01 Đất nơi bò chết 02 Lông bò 01 Phân bò 01 Đất nơi xung quanh nơi 05 trâu mắc bệnh Phân trâu 01 Đất nơi ổ dịch cũ 03 Nước sinh hoạt 01 Lông, sừng trâu 06 Loại mẫu Kết định danh 2/3 chủng B.anthracis chủng B.anthracis B.cereus B.cereus B.anthracis B.anthracis 2/5 chủng B.anthracis B.cereus B.anthracis B.cereus Âm tính 3/6 chủng B.cereus 3.1.5 Kết đánh giá chủng than độc lực sử dụng làm chủng thử thách Bảng 3.5 Kết xác định LD50 chủng 4NS chuột lang Liều tiêm chủng 4NS (tbvk/ml) 10 tbvk/ml 100 tbvk/ml 1000 tbvk/ml 10.000 tbvk/ml (n) 5 5 Số chuột sống Số chuột chết (%) (%) (80,0%) (40,0%) (0,0%) (0,0%) (20,0%) (60,0%) (100,0%) (100,0%) Tƣơng quan sống/chết 0.2 0.6 1 ∑Li =2.8 LD50 tính theo phương pháp Kep∂epa LD50 = lgDN - ∂ (∑Li – 0,5) - lgDN: logarit liều tiêm lớn 10.000 = - ∂ : log hệ số pha loãng 10 = Ta có : LgLD50 = – 1(2,8 – 0,5) = 1.7  LD50 = 50 bào tử 3.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN THAN 3.2.1 Nghiên cứu sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) 3.2.1.1 Chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp khả sinh tổng hợp protein PA chủng BaVCM1167 phục vụ sản xuất vaccine hấp phụ Nghiên cứu sinh trưởng chủng BaVCM1166 BaVCM1167 môi trường 1, dạng đặc dạng lỏng, 37 oC điều kiện kỵ khí hoàn toàn Khả sinh trưởng phát triển sinh tổng hợp protein PA chủng nuôi cấy hai môi trường 1, dạng rắn tốt mật độ tế bào đạt 108 CFU/ml sau 36 h nuôi cấy Trong đó, môi trường (mt C) dạng lỏng chủng vi khuẩn phát triển yếu môi trường (mt R) Kết điện di kiểm tra protein gel polyacrylamide 12,6% 11 kDa 1, 6: Protein chủng Ba VCM 1166 môi trường rắn lỏng 100 2, 7: Protein chủng Ba VCM 1167 môi 83 70 trường rắn lỏng 3, 8: Protein chủng Ba VCM 1166 môi trường rắn lỏng 4, 9: Protein chủng Ba VCM 1167 môi trường rắn lỏng 5: Thang protein chuẩn Hình 3.2: Điện di phát sản phẩm protein Pa chủng B.anthracis nuôi cấy môi trường sau 42 3.2.1.2 Nghiên cứu thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp protein PA môi trƣờng dạng lỏng rắn – 5: Protein chủng Ba VCM 1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 nuôi cấy 6: Thang protein chuẩn – 11: Protein chủng Ba VCM 1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 nuôi cấy Hình 3.3: Điện di phát sản phẩm protein PA chủng B.anthracis thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h môi trường dạng rắn – 5: Protein chủng Ba VCM 1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 nuôi cấy 6: Thang protein chuẩn – 11: Protein chủng Ba VCM 1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 nuôi cấy Hình 3.4: Điện di phát protein PA chủng B.anthracis sinh tổng hợp thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy môi trường dạng lỏng 12 – 5: Protein chủng Ba VCM 1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 nuôi cấy 6: Thang protein chuẩn – 11: Protein chủng Ba VCM 1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 nuôi cấy Hình 3.5: Điện di phát protein PA chủng B.anthracis sinh tổng hợp thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy môi trường 2dạng lỏng Môi trường d ng lỏng, chủng BaVCM1166 tổng hợp protein PA nhiều sau 48 (giếng hình 3.10); thời gian thích hợp để chủng BaVCM1167 tổng hợp PA l i 36 (giếng hình 3.10) Ở môi trường 2, chủng BaVCM1167 có thời gian tổng hợp PA dải môi trường (từ 36 đến 72 so với 36 – 48 ) Các kết cho thấy khoảng thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp protein PA chủng BaVCM1167 36 – 48 giờ, sinh tổng hợp protein PA tốt nuôi môi trường dạng lỏng 3.2.1.3 Sản xuất protein kháng nguyên bảo vệ PA chủng BaVCM1167 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 14 18 22 26 30 34 pH OD pH Biểu đồ động thái trình lên men sinh khối protein 36 Thời gian Hình 3.6: Động thái trình lên men chủng BaVCM1167 nhiệt độ 37 oC điều kiện kỵ khí hoàn toàn sản xuất vaccine AVA 13 0.4 OD Đường chuẩn protein PA y = 0.0163x + 0.0246 R2 = 0.9828 0.35 OD 0.3 0.25 0.8 Series1 0.2 y = 0.4299x + 0.0648 R2 = 0.9833 Linear (Series1) 0.6 0.15 0.4 0.1 0.2 0.05 0 10 15 20 25 BSA (mg/ml) 0.5 1.5 2.5 PA Hình 3.7: Đường chuẩn Bradford cho xác định hàm lượng protein tổng số dịch lên men phương trình đường chuẩn protein PA cho xác định hàm lượng protein PA dung dịch sau ly tâm Hình 3.8: Điện di protein tổng số chủng BaVCM 1167 85 kDa 83 kDa Giếng 1: Protein PA tinh s ch sau tủa băng thanol Giếng 2: protein trước tinh s ch Giếng 3: Thang protein chuẩn 3.2.1.4 Nghiên cứu trình tinh protein PA từ chủng BaVCM1167  Kết tinh protein PA phƣơng pháp tủa ethanol Kết cho thấy nồng độ Ethanol 50 % protein khác bị loại bỏ đồng thời băng protein kích thước 83 kDa tăng lên rõ nét Từ đó, tiến hành tinh hàm lượng lớn protein PA nồng độ kDa 83 kD a 85 kDa 83 kDa 100 85 70 Hình 3.9: Tinh protein PA phương pháp tủa ethanol nồng độ khác 1-6: sản phẩm điện di tủa protein nồng đ cồn 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 7: thang chuẩn protein 14 Kết tinh protein qua cột sắc ký trao đổi ion  0.12 P1 0.1 P2 0.08 P3 P4 20 25 0.06 0.04 0.02 0 10 15 30 35 Hình 3.35 sắc ký đồ DEAE phân đoạn đẩy khỏi cột Hình : kết quản A xác đinh có mặt protein PA đỉnh 1-4: đỉnh thu tu sắc ký đồ P1 – P4 5: ĐC ( saline buffer)  Kết tinh protein qua cột sắc ký biogel P100 KDa 85 83 Hình 3.10: Hình ảnh điện di phân đoạn tinh protein sắc ký biogel P100 1: Marker 2: protein trước tinh s ch - 9: phân đo n tinh  Khẳng định biểu protein PA phản ứng Western blot 15 Hình 3.25a Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin màng lai PVDF Giếng Thang chuẩn protein Hình 3.25b Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA màng lai PVDF Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 8: Đối chứng (Huyết thỏ trước gây miễn dịch) 2.2 Sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực Công ty Vaccine Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt: Phụ lục 3.3 ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN, VÀ SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN AVA VÀ VẮC XIN TTB TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 3.3.1 Kiểm tra tiêu chuẩn an toàn vaccine 3.3.1.1 Yếu tố vật lý: - Vaccine hấp phụ: + Bóc nhãn lọ đựng vaccine, nhìn đánh giá mắt thường: vaccine đóng lọ thủy tinh trắng, vaccine đông khô tạo thành bánh xốp, màu trắng, bong, không teo, không chảy nước + Cho 6ml nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch màu đồng nhất, không vẩn cặn - Vaccine toàn tế bào: Lọ Vaccine phòng bệnh than đông khô có màu trắng, xốp, bong ra, không bị chảy nước 16 3.3.1.2 Kiểm tra pH vaccine: - Vaccine hấp phụ: Hút dung dịch nhỏ lên giấy quỳ so màu với thang màu kết cho thấy khoảng màu pH=7,0 - Vaccine toàn tế bào: Các lô vaccine phòng bệnh than đông khô có giá trị pH đạt 6,8 – 7,5 3.3.1.3 Kết kiểm tra vô trùng  Vaccine hấp phụ: Cho 6ml nước muối sinh lý vô trùng vào lọ vaccine, lắc Tiến hành lấy 0,5 ml cho vào môi trường thạch máu, thạch dinh dưỡng thạch sabouraud Lấy que cấy ria huyền dịch đĩa thạch, ủ đĩa cấy nhiệt độ 370C/ 24 + Kết vi khuẩn hiếu khí: âm tính + Kết vi khuẩn tan huyết: âm tính + Kết nấm men, nấm mốc: âm tính  Vaccine toàn tế bào: 3.3.2 Kết đánh giá tính an toàn sinh miễn dịch vaccine: 3.3.2.1 Đánh giá phản ứng toàn thân chỗ sau tiêm vaccine thỏ: Bảng 3.6 Kết theo dõi nhiệt độ phản ứng chỗ thỏ sau tiêm 02 loại vaccine, so sánh với nhóm chứng nhóm plascebo Mã số thỏ Thỏ Thỏ Vaccine AVA Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Vaccine toàn tế bào (TTB) Thỏ Thỏ Thỏ 10 Thỏ 11 Thỏ 12 Thỏ 13 Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng Trƣớc tiêm -2 -1 37,8 38,2 39 39,1 38,8 38 38,2 38,1 39,1 38,9 38,9 39 39,5 38,9 38,9 39 38,9 39 39,1 39 37,5 38,2 38,9 38,5 38 39 39 39 38 38.5 38.2 38 39,1 39 39,2 39,3 38,2 38,5 39,1 39,2 39,2 38,9 39,2 39 37,6 38,1 38 38,2 38,9 38,9 39,1 38,4 39,4 38,5 38,9 38,9 39 39 39,1 38,5 39,1 38,5 17 Sau tiêm 39 39,4 38,2 38,3 39 39,2 38,1 38,4 39,5 39 39 39 38,9 39 39 39 39,2 39 38,8 38,5 39,1 39 39,3 39 38,5 39,4 38,2 39 38,1 39,5 39 38,9 39 39 38,5 39,1 39,3 38,5 T0 dao động 0,7 0,0 0,2 -0,8 0,2 0,7 0,2 0,8 -0,1 -0,2 0,0 1,1 -0,4 Vết tiêm Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng Thỏ 14 Thỏ 15 chứng plascebo Thỏ 16 Thỏ 17 Thỏ 18 Thỏ 19 Thỏ 20 39 38,7 39 39 38,9 38,2 38,1 39 38,8 38,8 38,2 38,1 38,4 39 chiều 39 39 39 39 39,2 39 38,1 38,5 39 38,5 38 38,5 38,8 39 38,2 38,5 38,6 39,2 39,2 39 38,9 39,5 38,8 38,8 38,6 39,6 39,2 39 38,9 38,9 39,2 39 38,5 38,7 38,2 38,9 38,5 39 39.2 39 thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 0,3 -0,1 39,5 38,8 39,6 38,6 39 0,7 -0,1 0,8 0,4 Bình thường 0,2 38,7 3.3.2.2 Đánh giá độc cấp tính vaccine (LD50) chuột nhắt trắng  Độc tính cấp vaccine AVA Bảng 3.7 Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine AVA chuột nhắt trắng Lô chuột thử Nồng độ AVA ( nghiệm µg/chuột) Số lƣợng chuột Chết Sống Tổng số Tỉ lệ chết (%) Lô sô (n=8) 1800.00 25,00 Lô sô (n=8) 1440.00 25,00 Lô sô (n=8) 1152.00 8 0,00 Lô sô (n=8) 921.60 8 0,00 Lô sô (n=8) 737.28 8 0,00 Áp dụng công th c: logLD50 = Log X100 – Log Fd (∑t – n/2) n LD50 = 90.000 µg/kg Kết qủa cho thấy độc tính vaccine AVA thấp, hàm lượng PA cao mà tạo gây chết 50 % động vật thí nghiệm  Độc tính cấp vaccine TTB Bảng 3.8 Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine TTB chuột nhắt trắng Số lô chuột Lô sô n Số lƣợng tế bào/ liều Kết theo dõi số lƣợng chuột Chết Sống Tương quan 1,25 x108 18 7/8 Tỉ lệ chết (%) 87,50 Lô sô Lô sô Lô sô Lô sô 8 1,00 x108 0,75 x108 4 6/8 4/8 75,00 50,00 0,50 x108 1/8 12,5 0,25 x108 8 0,00 Áp dụng công th c: Từ công thức áp dụng cụ thể trường hợp là: LD50 = 2,27 x 109 tbvk/kg Kết qủa cho thấy độc tính vaccine TTB tương đối cao Liều an toàn chuột 0.25 x 108 tương đương 1,25 x 109 tbvk/kg 3.3.2.3 Kết đánh giá tính sinh miễn dịch vaccine AVA TTB thỏ  Kết đánh giá kháng thể thỏ xác định ngƣỡng dƣơng tính Bảng 3.9 Nồng độ kháng thể huyết thỏ trƣớc tiêm vaccine Vaccine thử nghiệm dự kiến Vaccine hấp phụ (AVA) Vaccine toàn tế bào (TTB) Số thỏ Ký hiệu thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ 10 Thỏ 11 Thỏ 12 Thỏ 13 Thỏ 14 Thỏ 15 Thỏ 16 Tổng (16 thỏ) Định lƣợng nồng độ anti-PA83 thỏ trƣớc tiêm vaccine P OD GMT Xm ± SD (α=0,05) 0,576 0,365 0,533 0,584 0,365 0,334 0,305 0,416 0,305 0,495 0,504 0,365 0,347 0,640 0,495 0,423 0,437 ± 0,121 0,889 0,435 0,45 ± 0,108 0,429 0,442 ± 0,111 Ghi chú: n: số lượng thỏ th nghiệm; : đ lệch chuẩn Xm giá trị trung bình c ng kháng thể GMT: giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể 19  Kết định lƣợng kháng thể thỏ tuần thứ sau tiêm mũi vaccine Bảng 10 Nồng độ anti-PA83 lô thỏ vào tuần thứ sau tiêm vaccine Định lƣợng nồng độ anti-Pa 83 thỏ Lô thỏ n Lô (tiêm vaccine AVA) Lô (tiêm vaccine toàn tế bào) Lô (chứng placebo) Ký hiệu Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ 10 Thỏ 11 Thỏ 12 Thỏ 13 Thỏ 14 Thỏ 15 Thỏ 16 Thỏ 17 Thỏ 18 Thỏ 19 anti-PA (µg/ml) 59,926 6,240 8,713 6,862 49,752 6,272 11,848 10,280 36,004 51,740 36,702 33,224 45,634 24,478 50,544 46,380 7,732 3,460 6,738 Ghi chú: Mẫ dương t nh O >= 0,885; µg/ml Ln(PA) GMT (µg/ml) 11,000 8,738 9,072 8,833 13,065 10,814 8,743 9,379 9,237 10,491 10,854 10,510 10,411 39,518 10,728 10,105 10,830 10,744 8,953 8,149 5,648 8,815 P (α=0,05) P(1,2) = 0,0052 P(1;3) = 0,170 P(2;3) = 0,000547 1000 U/ml= 1000 nanogram/ml= Kết qủa sau tuần gây miễn dịch nồng độ kháng thể trung bình thỏ tiêm vaccine TTB tăng cao, cao gấp lần so với thỏ tiêm vaccine AVA  Kết định lƣợng kháng thể thỏ tuần thứ sau tiêm hai mũi vaccine Bảng 11 Nồng độ anti-PA83 lô thỏ tiếp nhận vaccine tuần thứ Lô thỏ Lô (tiêm vaccine AVA) n Ký hiệu Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ anti-Pa 83 huyết thỏ Anti-PA GMT Ln(PA) (µg/ml) (µg/ml) 50,512 10,830 33,984 10,434 15,179 7,126 8,872 5,154 8,548 20 P (1;2) (α=0,05) 0.636 Lô (tiêm vaccine TTB) Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ 10 Thỏ 11 Thỏ 12 Thỏ 13 Thỏ 14 Thỏ 15 Thỏ 16 59,926 9,782 12,564 6,070 12,174 19,554 15,158 9,550 15,670 14,458 42,776 39,064 11,001 9,188 9,439 8,711 9,407 9,881 9,626 9,164 9,660 9,579 10,664 10,573 18,383 Ghi chú: 1000 U/ml= 1000 nanogram/ml= µg/ml, n: số lượng chuẩn, P: xác suất có điều kiện : đ lệch Nồng độ kháng thể trung bình nhóm thỏ tiêm vaccine AVA tăng cao thời điểm tuần, thỏ tiêm vaccine toàn tế bào lại giảm  Kết định lƣợng kháng thể thỏ tuần thứ 10 sau hai mũi vaccine Bảng 3.12 Định lƣợng anti-PA83 huyết thỏ tiếp nhận vaccine tuần thứ 10 (lấy máu lần 4) anti-PA 83 thỏ Lô thỏ n Ký hiệu anti-Pa GMT P (1;2) Ln(PA) (µg/ml) (µg/ml) (α=0,05) Thỏ 47,142 10,761 Thỏ 39,872 10,593 Thỏ 14,412 9,576 Lô Thỏ 12,874 9,463 (tiêm 15,321 vaccin Thỏ 59,926 11,001 e AVA) Thỏ 11,476 9,348 0,861 Thỏ 14,252 8,355 Thỏ 2,978 7,999 Thỏ 8,182 9,010 Thỏ 10 11,056 9,311 Lô Thỏ 11 16,244 9,695 (tiêm 16,599 Thỏ 13 16,820 9,730 vaccin Thỏ 14 15,172 9,627 e TTB) Thỏ 15 31,172 10,347 Thỏ 16 29,712 10,299 Nồng độ kháng thể trung bình nhóm thỏ tiêm vaccine AVA tăng cao thời điểm tuần, thỏ tiêm vaccine toàn tế bào lại giảm 21 Hình 3.21 Đáp ứng miễn dịch cá thể thỏ tiếp nhận vắc xin ava Tính sinh miễn dịch không cá thể thỏ Hình 3.11: Đáp ứng miễn dịch cá thể thỏ tiếp nhận vaccine TTB Tất cẩ cá thể thỏ đề có đáp ng MD tốt Đáp ứng miễn dịch của thỏ hai loại vaccine AVA TTB khác nhau: Lô thỏ tiêm vaccine AVA đáp ứng miễn dịch không đều, đáp ứng mang tính cá thể 3/8 thỏ có đáp ứng tốt Lô thỏ tiêm Vaccine TTB đáp ứng miễn dịch sinh đồng tất thỏ Ngưỡng (+) Hình 3.12: Đáp ứng kháng thể thỏ anti-PA trung bình GMT theo thời gian Nồng độ kháng thể kháng PA83 thỏ đáp ứng với hai loại vaccine có xu hướng khác Thỏ tiêm vaccine AVA nồng độ kháng thể có xu hướng tăng dần, thỏ tiêm vaccine TTB nồng độ kháng thể tăng cao lúc đầu giảm dần theo thời gian 22 3.3.3 Đánh giá công hiệu vaccine chuột lang 3.3.3.1 Đánh giá hiệu lực bảo vệ vaccine TTB (bảng 3.31) 3.3.3.1 Hiệu lực bảo vệ vaccine TTB Hình 13: Đánh giá hiệu lực bảo vệ vaccine TTB chuột lang Biến đ ng số lượng chu t sống sót nhóm chu t lang, nhóm 10 con, nhóm tiêm vaccine (từ nồng đ 105, 106, 107, 108 tbvk/ml, phác đồ lần tiêm vào ngày ngày 14), nhóm ch ng không tiêm vaccine Chủng th thách đầ đủ đ c lực gây nhiễm ngày th 21 đường ổ bụng Liều th thách nhóm thí nghiệm 100 x LD50, liều th thách nhóm ch ng 10x LD50 Theo dõi 10 ngày 3.3.3.2 Đánh giá hiệu lực bảo vệ vaccine AVA (Bảng 3.27) Hình 14:Đánh giá hiệu lực bảo vệ vaccine AVA chuột lang Biến đ ng số lượng chu t sống sót nhóm chu t lang, nhóm 10 con, nhóm tiêm vaccine (từ nồng đ 50 µg, 100 µg 200 µg, phác đồ lần tiêm vào ngày ngày 14), nhóm ch ng không tiêm vaccine Chủng th thách đầ đủ đ c lực gây nhiễm ngày th 21 đường ổ bụng Liều th thách nhóm thí nghiệm 100 x LD50, liều th thách nhóm ch ng 10x LD50 Theo dõi 10 ngày 23 - Vaccine TTB nồng độ 107tbvk/ml bảo vệ 100% số chuột thử thách với chủng đầy đủ độc lực 4NS - Vaccine AVA liều 200 µg/ml bảo vệ 40% số chuột thử thách với chủng 4NS KẾT LUẬN Tuyển chọn đƣợc chủng BaVCM1167 đủ tiêu chuẩn sản xuất vaccine phòng bệnh than chủng độc lực để đánh giá thử thách - Chủng dùng sản xuất vaccine có độ tương đồng cao với chủng than gây bệnh phân lập vùng dịch - Phân lập 14 chủng B.anthracis, có 04 chủng B.anthracis mang đầy đủ yếu tố độc lực ( Toxin, Ba1168, 4NS, 1C3) - lD50 = 50 bào tử (chủng 4NS, đường tiêm da chuột lang) Nghiên cứu sản xuất thành công hai loại vaccine dự phòng bệnh than: vaccine hấp phụ (AVA) vaccine toàn tế bào (TTB) từ chủng BaVCM1167 - Môi trường thích hợp giúp vi khuẩn tổng hợp PA hiệu môi trường dạng lỏng, thời gian sinh tổng hợp protein PA tốt 36- 48h - Phương pháp tinh hiệu … Thử nghiệm thành công loại vaccine mô hình động vật - Vaccine phòng bệnh than đảm bảo tiêu chuẩn an toàn (LD50 AVA 90000 µg/kg , TTB 2,27 x 109 tbvk/kg) - Vaccine TTB cho đáp ứng miễn dịch nhanh đồng đều, hiệu lực bảo vệ chuột lang là: 100% (2 mũi tiêm 0,5 x109 sau 20 ngày) - Vaccine hấp phụ phòng bệnh than đáp ứng miễn dịch chậm không đồng (40% số chuột lang, mũi tiêm x 200 µg/ml sau 20 ngày) KIẾNNGHỊ Nghiên cứu sản xuất hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine phòng bệnh than thử nghiệm thêm động vật nhóm nhỏ người tình nguyện Đánh giá hiệu lực bảo vệ vaccine phòng bệnh than nhiều mô hình thử nghiệm động vật khác với chủng thử thách tuyển chọn vùng địa lý khác với đường gây nhiễm khác 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn Xuân Thành (2013), “Nghiên cứu đặc điểm di truyền phân tử số yếu tố độc lực chủng Bacillus anthracis lưu hành khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam”, Kỷ yếu H i nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 1, trang 594-598 Nguyễn Ngọc Bảo, Nguyễn Minh Tiếp, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn Xuân Thành (2014), “Nghiên cứu số đặc điểm lưu hành bệnh than số tỉnh miền núi phía Bắc Việt nam”, T p chí Y học Quân sự, số 298, trang 25-30 Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Cao Thị Minh Ngọc, Phạm Thị Kim Nhung, Nguyễn Xuân Thành (2014), “Đánh giá tính an toàn, sinh miễn dịch hiệu lực bảo vệ vacxin dự phòng bệnh than động vật thí nghiệm”, T p chí Y học Quân sự, số 300, trang 13-17 25