THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE NGỪA BỆNH NHIỄM TRÙNG HUYẾT CHO CÁ TRA

  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE NGỪA BỆNH NHIỄM TRÙNG HUYẾT CHO CÁ TRA Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : CHAU PHI RINNE Niên khóa : 2009– 2013 Tháng 06/2013     BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘTBIẾNNHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE NGỪABỆNH NHIỄM TRÙNGHUYẾT CHO CÁ TRA Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS VŨ THỊ THANH HƯƠNG CHAU PHI RINNE Tháng 06/2013       LỜI CÁM ƠN   Với tất lòng kính trọng, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Cảm ơn thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, đặc biệt cô Tô Thị Nhã Trầm, thầy ngồi trường tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báo cho tơi suốt q trình học trường Xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô Vũ Thị Thanh Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận Xin cảm ơn anh, chị cơng tác Phòng Cơng Nghệ Sinh Học Thủy Sản, Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt anhLê Văn Hậu,chị Trương Ngọc Thùy Liên hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Trung Tâm Cảm ơn anh, chị bạn thực tập Phòng Cơng Nghệ Sinh Học Thủy Sản, Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh khuyến khích, ủng hộ, giúp đỡ tơi thực tốt khóa luận Gửi lời cảm ơn đến bạn bè thân yêu lớp DH09SH người bạn thân yêu khác tôi, bạn bên cạnh, động viên, ủng hộ, giúp đỡ, chia vui buồn suốt thời gian qua Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ thành viên gia đình quan tâm, chăm sóc, ln làm chỗ dựa vững cho vượt qua khó khăn Sinh viên thực CHAU PHI RINNE i TÓM TẮT Vi khuẩn Aeromonas hydrophila xác định nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết cá Tra, hàng năm gây thiệt hại lớn sản lượng nuôi trồng thủy sản nói chung Sản xuất vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết (bệnh đốm đỏ)là biện pháp đánh giá cao lợi ích kinh tế môi trường Đáp ứng nhu cầu đề tài “Thử nghiệm độc lực chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhằm ứng dụng nghiên cứu sản xuất vaccinengừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra” đề phục vụ cho nghiên cứu “Tạo chủng Aeromonas hydrophila nhược độc có tiềm làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết cá Tra” Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh Cá Tra thử nghiệm tiêm chủng A hydrophilađột biếnvà chủng A hydrophilahoang dại với nồng độ từ 103 – 107 cfu/ml.Sau đó, đánh giá hiệu bảo vệ chủng A hydrophilađột biến, nhược độc thông qua hệ số RPS Kết quả: chủng A hydrophila hoang dại có độc lực cao, nồng độ 103 cfu/ml gây chết 60% cá, nồng độ 107 gây chết 100% cá.Chủng A hydrophila đột biến bị giảm độc lực nồng độ 105, 106 cfu/ml không gây chết cá (so với chủng A hydrophila hoang dại gây chết 91%, 93% cá), 107 cfu/ml gây chết 40% cá (so với chủng A hydrophila hoang dại gây chết 100% cá) ii SUMMARY   Thesis “Experimental Aeromonas hydrophila strains virulent mutants to study applications in vaccine production for septicemia of catfish” BacteriaAeromonas hydrophila were identified as the main cause of septicemia of catfish, causing major damage each year in aquaculture productionl Vaccine production sepsis is a measure of appreciation for the economic benefits and environmentalbenefits Meeting the needs of the project "Experimental Aeromonas hydrophila strains virulent mutants to study applications in vaccine production for septicemia of catfish" has been proposed for the study "Creating Aeromonas hydrophila strain disadvantages toxic potential vaccine septicemia of catfish "of the Biotechnology Center of Ho Chi Minh city Catfish immunized test A hydrophila mutant and strains of A hydrophilawild with a concentration of 103-107 cfu/ml Then evaluate the protective effect of strain A hydrophila mutant, attenuated through the RPS The strains of A hydrophila virulent wild high concentration of 103 cfu/ml caused 60% of the fish died, at a concentration of 107 100% lethal fish Strains of A hydrophila mutant was attenuated in a concentration 105, 106 cfu/ml did not cause fish kills (compared with wild-type strains of A hydrophila lethal 91%, respectively, 93%), 107 cfu/ml 40% lethal fish (compared with wild-type strains of A hydrophila caused 100% mortality of fish) Key word: virulent strains A hydrophila mutant, hydrophilawild iii virulent strains A MỤC LỤC Trang Lời cám ơn i Tóm tắt .ii Summary iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng .vii Danh sách hình viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3Nội dung thực 2.1 Tổng quan Aeromonas hydrophila 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Đặc điểm chung .3 2.1.3 Môi trường phân lập 2.1.4 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết cá Tra .4 2.1.4.1 Nghiên cứu giới 2.1.4.2 Nghiên cứu nước 2.2 Sơ lược bệnh xuất huyết cá vi khuẩn A hydrophila .6 2.2.1 Đối tượng lây nhiễm .6 2.2.2 Triệu chứng lâm sàng xâm nhiễm 2.2.3 Điều kiện phát sinh bệnh 2.2.4 Chẩn đoán .8 2.2.5 Điều trị khống chế bệnh .9 2.3 Các hình thức cấp vaccine ni trồng thủy sản .10 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 3.2 Vật liệu 13 3.2.1Đối tượng thí nghiệm 13 3.2.2Thiết bị, dụng cụ 13 iv 3.2.3Hóa chất 13 3.2.4Môi trường .15 3.3.Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1Phương pháp kiểm tra cá nhiễm A hydrophilatrước thí nghiệm 16 3.3.2Phương pháp tiêm cá 17 3.3.3Phương pháp phân lập A hydrophila từ mẫu bệnh phẩm 18 3.3.4Phương pháp nhuộm Gram 18 3.3.5Phương pháp PCR khuẩn lạc 19 3.3.6Phương pháp chuẩn bị chủng A hydrophila 20 3.3.7Phương pháp thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dại, đột biến 22 3.3.8Đánh giá tỉ lệ sống cá sau tiêm chủng A hydrophila đột biến 22 3.3.9Xử lý số liệu .23 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24 4.1 Kiểm tra cá nhiễm vi khuẩn A hydrophila trước thử nghiệm 24 4.2 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophilahoang dại 26 4.2.1 Chuẩn bị chủng A hydrophila hoang dại .26 4.2.2 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dại phương pháp tiêm .27 4.3 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila đột biến 31 4.3.1 Chuẩn bị chủng A hydrophila đột biến 32 4.3.2 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila đột biến phương pháp tiêm .32 4.4 Đánh giá tỉ lệ sống cá sau tiêm chủng A hydrophila đột biến 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC     v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT   BHIA :Môi trường Brain heart infusion agar CFU : Colony Forming Unit DNA : Deoxyribo NucleicAcid ĐC (-) : Đối chứng âm ĐC (+) : Đối chứng dương LB : Môi trường Luria Bertani LD50 : Medium Letalisdosis NA : Môi trường Nutrient Agar NMSL 0,65% : Nước muối sinh lý, nồng độ 0,65% OD : Optical Density PBG : Môi trường Peptone beef - extract glycogen PCR : Polymerase Chain Reaction RPS : Relative Percentage Survival RS : Môi trường Rimler Shotts TAE : Tris – Acetate – EDTA TBE : Tris – Borate – EDTA TSA : Môi trường Trypticase soy agar UV : Ultraviolet radiation VASEP : Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers       vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 12 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho cập mồi aroA_F4/aroA_R4 21 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lưc phương pháp tiêm cá 25 Bảng 4.1 Kết ương cá Tra giống từ cá bột 27 Bảng 4.2Số cá chết sau ngày tiêm chủng A hydrophila hoang dại 32 Bảng 4.3 Kết xử lý trắc nghiệm phân hạng số liệu cá chết qua ngày theo dõi 33 Bảng 4.4Tỷ lệ cá chết sau 72 tiêm chủng A hydrophilađột biến 35 Bảng 4.5 Tỉ lệ cá chết sau tiêm A hydrophila hoang dại, đột biến 38 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH   Hình 2.1Vi khuẩn A hydrophilaquan sát kính hiển vi Hình 2.2 Cá Tra có biểu bệnh nhiễm trùng huyết Hình 3.1 Thang DNA dùng điện di 12 Hình 3.3 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophilahoang dại đột biến 14 Hình 3.4 Đánh giá tỷ lệ sống cá thơng qua hệ số RPS 15 Hình 3.5 Kỹ thuật tiêm cá thí nghiệm 19 Hình 3.6Phương pháp pha lỗng dịch vi khuẩn 23 Hình 3.7 Đánh giá tỷ lệ sống cá sau tiêm chủng A hydrophilaWT,M25 26 Hình 4.1Mẫu máu cá cấy môi trường RS 28 Hình 4.2Khuẩn lạc phân lập từ mẫu nước trước sau thay nước 29 Hình 4.3 Kết điện di gel agarose 1,2% sản phẩm PCR khuẩn lạc 30 Hình 4.4 Cá chết sau tiêmchủng A hydrophilahoang dại 33 Hình 4.6 Vi khuẩn A.hydrophila mọc môi trường RS 34 Hình 4.8Hình thái khuẩn lạc vật kính x100 34 Hình 4.9 Cá chết sau tiêm chủng A hydrophilahoang dại 38 Hình 4.10 Các dạng khuẩn lạc mọc mơi trường RS 38   viii Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Chủng A hydrophila hoang dại có độc lực cao, nồng độ 103 cfu/ml gây chết 60% cá - Chủng A hydrophila đột biến bị giảm độc lực nồng độ 105, 106 cfu/ml không gây chết cá (so với chủng A hydrophila hoang dại gây chết 91%, 93% cá) , 107 cfu/ml gây chết 40% cá (so với chủng A hydrophila hoang dại gây chết 100% cá) 5.2 Đề nghị - Cần lặp lại thí nghiệm nhiều lần để xác định LD50 chủng A hydrophila hoang dại, đột biến - Cá đợt thử nghiệm nên đồng nguồn gốc để có kết xác, tin cậy - Tiếp tục lặp lại thử nghiệm đánh giá tỉ lệ sống cá sau tiêm chủng A hydrophila đột biến 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Quốc Bình, Trương Ngọc Thùy Liên 2011 Tạo chủng Aeromonas hydrophila phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra.Luận văn Thạc sĩ Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Trần Anh Dũng 2005 Khảo sát tác nhân gây bệnh nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh An Giang Luận văn Thạc sĩ Khoa Thủy Sản, Trường Đại họcCần Thơ Vũ Thị Minh Đức 2001 Thực tập Vi sinh vật học Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Thị Bạch Mai, Phạm Thị Nhung 2011 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila cá Tra(Pangasianodon hypopthalamus) Luận văn Thạc sĩ Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Lê Đình Minh Phương 2011 Ngành cá Tra Việt Nam(Pangasius).Báo cáo Ngành 1: 1-7 Bùi Quang Tề 2006 Bệnh vi khuẩn Bệnh học Thủy sản Nhà xuất Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I 5:161 – 173 Nguyễn Hữu Thịnh, Đổ Viết Phương 2011 Thử nghiệm Vaccine đơn giá Asromonas hydrophila Vaccine đa giá Acromonas hydrophila / Edwadsiella ictaluri cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus).Luận văn Thạc sĩ Khoa Thủy sản, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng nước ngồi Ansary A., Haneef R.M., Torres J.L and Yadav M 1992 Plasmids and antibiotic resistance in Aeromonas hydrophila isolated in Malaysia from healthy and diseased fish Journal of Fish Diseases 15: 191-196 Azad I.S., Shankar K.M., Mohan C.V and Kalita B 1999 Biofilm vaccine of Aeromonas hydrophila – standardization of dose and duration for oral vaccination of carps Fish and shellfish Immunology 7: 519 – 528 10 Baba T., Imamura J., Izawa K and Ikeda K 1988 Immune protection in carp, Cyprinus carpio L., after immunization with Aeromonas hydrophila crude lipopolysaccharide Journal of Fish Diseases Volume 11 3: 237 – 244 11 Chandran M.R., Aruna B.V., Logambal S.M and Michael R.D 2002 Field immunization of Idian major carps agianst Aeromonas hydrophila by immersion Journal of Aquaculture in the Tropics 17 4: 311 - 318 12 Del Corral F., Shotts E.B.Jr and Brown J 1990 Adherence, haemagglutination, and cell surface characteristics of motile aeromonads virulent for fish Journal of Fish Diseases 13: 255-268 13 Dixon B.A and Issvoran G 1993 Antibacterial drug resistance in Aeromonas spp isolated from domestic goldfish and koi from California Journal of the World Aquaculture Society 24: 102-104 38 14 Dixon B.A., Yamashita J and Evelyn F 1990 Antibiotic resistance of Aeromonas spp isolated from tropical fish imported from Singapore Journal of Aquatic Animal Health 2: 295-297 15 Eissa I.A.M., Badran A.F., Moustafa M and Fetaih H 1994 Contribution to motle Aeromonas hydrophila in some cultured and wild freshwater fish Veterinary Medical Journal Giza 42 1: 63-69 16 Esteve C Biosca E.G and Amaro C 1993 Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water Diseases of Aquatic Organisms 16: 15-20 17 Fang H.M., Ge R and Sin Y.M 2004 Cloning, characterisation and expression of Aeromonas hydrophila major adhesin Fish & Shellfish Immunology 16: 645-658 18 Grizzle J.M and Kiryu Y 1993 Histopathology of gill, liver, and pancreas, and serum enzyme levels of channel catfish infected with Aeromonas hydrophila complex Journal of Aquatic Animal Health 5: 36-50 19 Hernanz Moral, C., E Flano, P Lopez Fierro, A.Villena, J Anguita, A Cascon M Sa´nchez Salazar, B Razquin Peralta, and G Naharro Carrasco 1998 Molecular characterization of the Aeromonas hydrophila aroA gene and potential use of an auxotrophic aroA mutant as a live attenuated vaccine.Infect Immun 66:1813–1821 20 Huizinga H.W., Esch G.W and Hazen T.C 1979 Histopathology of red-sore disease (Aeromonas hydrophila)in naturally and experimentally infected largemouth bass Micropterus salmoides (Lacepede) Journal of Fish Diseases 2: 263-277 21 Janda J.M., Abbott S.L., Khashe S., Kellogg G.H and Shimada T 1996 Further studies on biochemical characteristics and serologic properties of the genus Aeromonas Journal of Clinical Microbiology 34 8: 1930 – 1933 22 Jeney Z and Jeney G 1995 Recent achievements in studies on diseases of common carp (Cyprinus carpio L.) Aquaculture 129: 397-420 23 Karunasagar I., Rosalind G.M., Karunasagar I and Gopal Rao K 1989 Aeromonas hydrophila septicaemia of Indian major carps in some commercial fish farms of West Godavari District, Andhra Pradesh Current science 58: 1044-1045 24 KhalilA.H and Mansour E.H 1997 Toxicity of crude extracellular products of Aeromonas hydrophila in tilapia, Tilapia nilotica Letters in Applied Microbiology 25: 269-273 25 Ko W., Chiang S., Lee H., Tang H., Wang Y and Chuang Y 2003 In Vitro and In Vivo Activities of Fluoroquinolones againstAeromonas hydrophila Antimicrobial Agents & Chemotherapy 47: 2217-2222 26 Krovacek K., Peterz M., Faris A and Mansson I 1989 Enterotoxigenicity and drug sensitivity ofAeromonas hydrophila isolated from well water in Sweden: A case study International Journal of Food Microbiology 8: 149-154 27 Kusuda R., Chen C., and Kawai K 1987 Changes in the agglutinating antibody titre and serum protein composition of colored carp after immunization with Aeromonas hydrophila Fish Pathology 22: 141 – 146 28 Lamers C.H.J., De Haas M.J.H and Van Muiswinkel W.B 1985 The reaction of the immune system of fish to vaccination: Development of immunological memory in carp, Cyprinus carpio L., following direct immersion in Aeromonas hydrophila bacterin Journal of Fish Diseases 3: 253 – 262 39 29 Landre J., Gavriel A., Rust R and Lamb A 2000 The response of Aeromonas hydrophila to oxidative stress induced by exposure to hydrogen peroxide Journal of Applied Microbiology 89: 145-151 30 Leung K.Y., Wong L.S., Low K.W and Sin Y.M 1997 Mini-Tn5 induced growth – and protease – deficient mutants of Aeromonas hydrophila as live vaccines for blue gourami, Trichogaster tichopterus (Pallas) Aquqculture 158: 11 – 22 31 Liu Y.J and Lu C.P 2004 Role of Ichthyophthirius multifiliis in the Infection of Aeromonas hydrophila Journal of Veterinary Medicine B 51, 222-224 32 Loghothetis P.N and Austin B 1994 Antibody responses of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) to live Aeromonas hydrophila as assessed by various antigen preparations Fish and Shellfish Immunology 6: 455 – 464 33 Loghothetis P.N and Austin B 1996 Immune response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) to Aeromonas hydrophila Fish and Shellfish Immunology 3: 239 – 245 34 Mitchell A.J and Plumb J.A 1980 Toxicity and efficacy of Furanace on channel catfish Ictalurus punctatus (Rafinesque) infected experimentally with Aeromonas hydrophila Journal of Fish Diseases 3: 93-99 35 Moral C.H., Del Castillo E.F., Fierro P.L., Cortes A.V., Castillo J.A., Soriano A.C., Salazar M.S., Peralta B.R and Carrasco G.N 1998 Molecular charaterization of the Aeromonas hydrophila aroA gene and protential use of and auxotrophic aroA mutant as a live attenuated vaccine Infection and Immunity 66 5: 1813 – 1821 36 Nayak D.K., Asha A., Shankar K.M and Mohan C.V 2004 Evaluatrion of biofilm of Aeromonas hydrophila for oral vaccination of Clarial batrachus – a carnivore model Fish and shellfish Immunology 16 5: 613 – 619 37 Nielsen M.E., Hoei L., Schmidt A.S., Qian D., Shimada T., Shen J.Y and Larsen J.L 2001 Is Aeromonas hydrophila the dominant motile Aeromonas species that causes disease outbreaks in aquaculture production in the Zhejiang Province of China? Diseases of Aquatic Organisms 46 1: 23 – 29 38 Nusbaum K.E and Morrison E.E 2002.Edwardsiella ictaluri bacteraemia elicits shedding of Aeromonas hydrophila complex in latently infected channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque) Journal of Fish Diseases 25: 343-350 39 Palumbo S.A., Morgan D.R and Buchanan R.L 1985 Influence of the temperature, NaCl and pH on the growth of Aeromonas hydrophila Journal of Food Science 50: 1417-1421 40 Rahman M.H and Kawai K 2000 Outer membrane proteins of Aeromonas hydrophila induce protective immunity in goldfish Fish and shellfish Immunology 10 4: 379 – 382 41 Rahman, M H., S Suzuki, and K Kawai 2001 Formation of viable but nonculturable state (VBNC) of Aeromonas hydrophila Carassius auratus Microbiol Res 156:103–106 42 Suanyuk, N., H Kanghear, R Khongpradit and K Supamattaya, 2005 Streptococcus agalactiae infection in tilapia (Oreochromis niloticus) Songklanakarin J Sci Technol., 27: 307-319 43 Sugita H., Nakamura T., Tanaka K and Deguchi Y 1994 Identification of Aeromonas species isolated from freshwater fish with the microplate hybridization method Applied and Environmental Microbiology 60: 3036-3038 40 44 Ventura M.T and Grizzle J.M 1987 Evaluation of portals of entry of Aeromonas hydrophila in channel catfish Aquaculture 65: 205-214 45 Vivas J., Razquin B., Lopez-Fierro P and Villena A.J 2005 Modulation of the immune response to an Aeromonas hydrophila aroA live vaccine in rainbow trout: effect of culture media on the humoral immune responseand complement consumption Fish & Shellfish Immunology 18: 223-233 46 Vivekanandhan G., Savithamani K., Hatha A.A.M and Lakshmanaperumalsamy P 2002 Antibiotic resistance ofAeromonas hydrophila isolated from marketed fish and prawn of south India International Journal of Food Microbiology 76: 165-168 47 Walter M.W., Valladares M.H., Adlington R.M., Amicosante G., Baldwin J.E., Frere J., Galleni M., Rossolini G and Schofield C.J 1999 Hydroxamate Inhibitors of Aeromonas hydrophila AE036 Metallo-B-lactamase Bioorganic Chemistry 27: 35-40 48 Zervosen A., Valladares M.H., Devreese B., Prosperi-Meys C., Adolph H., Mercuri P.S., Vanhove M., Amicosante G., Beeumen J., Frere J and Galleni M 2001 Inactivation ofAeromonas hydrophila metallo-{beta}-lactamase by cephamycins and moxalactam European Journal of Biochemistry 268: 3840-3850 41 PHỤ LỤC Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm tiêm chủng A hydrophila hoang dại Nghiệm thức Ngày Đối chứng âm 103 104 105 106 107 0 5 8 13 12 10 0 2 6 4 2 0 0 1 0 1 1 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Tổng số cá chết Tỷ lệ cá chết trung bình (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 12 10 14 13 12 14 15 15 12 15 15 15 60 80 86,7 93 100 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tiêm chủng chủng A hydrophila hoang dại, số liệu Bảng 1, số liệu xử lý theo ngày theo dõi A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 0.78 0.389 0.10 0.9050 nt 207.61 41.522 10.77 0.0009 Error 10 38.56 3.856 Non-additivity 0.81 0.811 0.19 Residual 37.74 4.194 Total 17 246.94 Grand Mean= 5.944 Grand Sum= Coefficient of Variation= 33.03% 107.000 Total Count= 18 Means for variable (ngay1) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 5.667 6.167 6.000 Means for variable (ngay1) for each level of variable (nt): Var Var Value Mean 0.000 5.333 6.333 5.667 6.667 11.667 - A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 2.33 1.167 0.30 0.7479 nt 357.17 71.433 18.32 0.0001 Error 10 39.00 3.900 Non-additivity 0.02 0.019 0.00 Residual 38.98 4.331 Total 17 398.50 Grand Mean= 8.833 Grand Sum= Coefficient of Variation= 159.000 22.36% Means for variable (ngay2) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 8.667 8.500 9.333 Total Count= 18 Means for variable (ngay2) for each level of variable (nt): Var Var Value Mean 0.000 7.667 9.000 11.000 11.000 14.333   A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 1.78 0.889 0.23 0.7967 nt 394.28 78.856 20.63 0.0001 Error 10 38.22 3.822 Non-additivity 0.24 0.245 0.06 Residual 37.98 4.220 Total 17 434.28 Grand Mean= 9.389 Grand Sum= Coefficient of Variation= 169.000 20.82% Means for variable (ngay3) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 9.167 9.167 9.833 Means for variable (ngay3) for each level of variable (nt): Total Count= 18 Var Var Value Mean 0.000 8.000 10.333 11.333 11.667 15.000 -  A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 2.11 1.056 0.28 0.7625 nt 447.78 89.556 23.64 0.0000 Error 10 37.89 3.789 Non-additivity 0.52 0.522 0.13 Residual 37.37 4.152 Total 17 487.78 Grand Mean= 10.111 Grand Sum= Coefficient of Variation= 182.000 19.25% Means for variable (ngay4) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 10.500 9.667 10.167 Means for variable (ngay4) for each level of variable (nt): Var Value Var Mean 0.000 8.333 11.000 Total Count= 18 12.667 13.667 15.000 -  A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 4.33 2.167 0.73 0.5058 nt 454.00 90.800 30.61 0.0000 Error 10 29.67 2.967 Non-additivity 0.24 0.239 0.07 Residual 29.43 3.270 Total 17 488.00 Grand Mean= 10.333 Grand Sum= Coefficient of Variation= 186.000 Total Count= 18 16.67% Means for variable (ngay25) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 10.833 9.667 10.500 Means for variable (ngay25) for each level of variable (nt): Var Var Value Mean 0.000 8.667 11.667 13.000 13.667 15.000 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Source Degrees of Freedom Sum of Squares Mean Square F-value Prob lll 5.78 2.889 1.07 0.3779 nt 453.78 90.756 33.75 0.0000 Error 10 26.89 2.689 Non-additivity 0.11 0.113 0.04 Residual 26.78 2.975 Total 17 486.44 Grand Mean= 10.444 Grand Sum= Coefficient of Variation= 188.000 Total Count= 18 15.70% Means for variable (ngay6) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 11.000 9.667 10.667 Means for variable (ngay6) for each level of variable (nt): Var Var Value Mean 0.000 9.000 12.000 13.000 13.667 15.000 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob -lll 5.78 2.889 1.07 0.3779 nt 453.78 90.756 33.75 0.0000 Error 10 26.89 2.689 Non-additivity 0.11 0.113 0.04 Residual 26.78 2.975 Total 17 486.44 Grand Mean= 10.444 Grand Sum= Coefficient of Variation= 188.000 Total Count= 18 15.70% Means for variable (ngay7) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 11.000 9.667 10.667 Means for variable (ngay7) for each level of variable (nt): Var Var Value Mean 0.000 9.000 12.000 13.000 13.667 15.000 - Bảng 3Bảng trắc nghiệm phân hạng mức ý nghĩa 0,05 thí nghiệm tiêm chủng chủng A hydrophila hoang dại, số liệu Bảng 2, số liệu xử lý theo ngày theo dõi Error Mean Square = 4.194 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.783 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 C Mean = 11.67 A Mean = 5.330 B Mean = 6.670 B Mean = 6.330 B Mean = 6.330 B Mean = 5.670 B Mean = 5.670 B Mean = 6.670 B Mean = 5.330 B Mean = 11.67 A Mean = 0.0000 C Error Mean Square = 4.331 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.844 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 C Mean = 14.33 A Mean = 7.670 B Mean = 11.00 AB Mean = 9.000 B Mean = 11.00 AB Mean = 11.00 AB Mean = 9.000 B Mean = 11.00 AB Mean = 7.670 B Mean = 14.33 A Mean = 0.0000 C Error Mean Square = 4.220 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.794 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 C Mean = 15.00 A Mean = 8.000 B Mean = 11.67 AB Mean = 10.33 B Mean = 11.33 AB Mean = 11.33 AB Mean = 10.33 B Mean = 11.67 AB Mean = 8.000 B Mean = 15.00 A Mean = 0.0000 C Error Mean Square = 4.152 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.764 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 D Mean = 15.00 A Mean = 8.330 C Mean = 13.67 AB Mean = 11.00 BC Mean = 12.67 AB Mean = 12.67 AB Mean = 11.00 BC Mean = 13.67 AB Mean = 8.330 C Mean = 15.00 A Mean = 0.0000 D Error Mean Square = 3.270 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.340 at alpha = 0.050 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 0.0000 8.670 11.67 13.00 13.67 Ranked Order C B AB A A Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 15.00 13.67 13.00 11.67 8.670 A A A AB B Mean = 15.00 A Mean = 0.0000 C Bảng 4Số liệu dùng cho xử lý thơng kê thí nghiệm tiêm chủng A.hydrophila đột biến  Ngày Nghiệm Tổng số Tỉ lệ % thức cá chết cá chết 105 0 0 0 0 0 0 0 106 0 0 0 0 0 0 0 107 5 0 0 0 0 12 40 Bảng 5Bảng ANOVA thí nghiệm tiêm chủng A.hydrophila đột biến dựa số liệu Bảng 4, sau 19 sau 24 sau tiêm A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 0.67 0.333 1.00 0.4444 nt 18.00 9.000 27.00 0.0048 Error 1.33 0.333 Non-additivity 1.33 1.333 18014398509481990.00 Residual -0.00 -0.000 Total 20.00 Grand Mean= 1.000 Grand Sum= Coefficient of Variation= 57.74% Means for variable (19h) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 0.667 1.000 1.333 Means for variable (19h) for each level of variable (nt): Var Var 9.000 Total Count= Value Mean 0.000 0.000 3.000 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 0.67 0.333 1.00 0.4444 nt 2.00 1.000 3.00 0.1600 Error 1.33 0.333 Non-additivity 1.33 1.333 18014398509481990.00 Residual -0.00 -0.000 Total 4.00 Grand Mean= 0.333 Grand Sum= Coefficient of Variation= 173.21% Means for variable (24h) for each level of variable (lll): Var Value Var Mean 0.000 0.667 0.333 Means for variable (24h) for each level of variable (nt): Var Value Var Mean 0.000 0.000 1.000 3.000 Total Count= ... hydrophila đột biến nhằm ứng dụng nghiên cứu sản xuất vaccinengừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra đề phục vụ cho nghiên cứu “Tạo chủng Aeromonas hydrophila nhược độc có tiềm làm vaccine ngừa bệnh nhiễm. .. SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘTBIẾNNHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE NGỪABỆNH NHIỄM TRÙNGHUYẾT CHO CÁ TRA Hướng dẫn khoa học Sinh viên... ngày Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila đột biến cá Tra giống Các bước thực bao gồm: Ương nuôi cá bột -cá hương -cá giống, chuẩn bị chủng A hydrophila ột biến, thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila