TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME β 1,3GLUCANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME β -1,3-GLUCANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐẶNG DUY LINH Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME β -1,3-GLUCANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS CAO THÀNH TRUNG ĐẶNG DUY LINH ThS NGUYỄN VIẾT DŨNG Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Để khố luận hồn thành, nhận nhiều giúp đỡ, động viên nhiều người Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn ThS Cao Thành Trung ThS Nguyễn Viết Dũng cho hội làm đề tài tận tình hướng dẫn, dạy tạo điều kiện thuận lợi để luận văn hoàn thành Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu suốt thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tận tình dạy dỗ, cung cấp kiến thức cho suốt thời gian học tập trường Xin cảm ơn bạn Sinh Viên lớp DH07SH động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối ghi nhớ công lao dưỡng dục lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình nơi động viên, giúp đỡ, chia khó khăn vui buồn suốt thời gian học tập vừa qua Đặng Duy Linh i TÓM TẮT Bacillus amyloliquefaciens vi khuẩn Garm dương có khả tiết enzyme β1,3-glucanase ngoại bào giúp thủy phân β-glucan Từ đó, chúng tơi tiến hành tạo dòng biểu enzyme tái tổ hợp β-1,3-glucanase từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens cách sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại trình tự gen dài 729 bp mã hóa cho tiền enzyme β-1,3-glucanase (precursor enzyme) có chứa trình tự mã hóa cho chuỗi peptide tín hiệu (signal-peptide) gồm 29 amino acid đầu N chuỗi polypeptide tiền phân tử enzyme β-1,3-glucanase Đồng thời trình tự gen có độ dài 642 bp mã hóa cho phân tử enzyme β-1,3-glucanase khơng có chuỗi peptide tín hiệu khuếch đại nhờ phản ứng PCR Các trình tự sau chuyển vào vector pQE-Ec biểu tế bào E coli WK6 Kết nghiên cứu cho thấy biểu khả tinh chế enzyme tái tổ hợp β-1,3-glucanase cao, hệ thống tinh chế lực His-tag Kết nghiên cứu cho thấy khả hoạt động chuỗi peptide tín hiệu chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens có khả hoạt động tế bào vi khẩn E coli ii SUMMARY Thesis title “Molecular cloning and expression of enzyme β-1,3-glucanase from Bacillus amyloliquefaciens” Bacillus amyloliquefaciens is Gram-positive bacteria that are able to excrete enzyme β-1,3-glucanase extracellular hydrolytic β-1,3-glucan We cloned and overexpressed recombinant enzyme β-1,3-glucanase from Bacillus amyloliquefaciens by a PCR-based strategy using DNA template from Bacillus amyloliquefaciens PCR amplify a sequences of 729 bp gene coding for the enzyme pre-β-1,3-glucanase containing the sequence coding for the signal peptide sequence consists 29 amino acid polypeptide at the N-terminal of enzyme pre-β-1,3-glucanase At the same time a sequence should be longer 642 bp gene coding for the enzyme β-1,3-glucanase without signal peptide sequence and amplified by PCR reaction The sequences were then transferred into the vector pQE-Ec and were expressed in cell E coli WK6 Research results suggest that the expression and the ability to purify the recombinant enzyme β-1,3-glucanase high by system purification affinity his-tagged Research results suggested that various signal peptides of Bacillus amyloliquefaciens can be recognized by the E coli iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược β-glucan 2.1.1 Cấu trúc β-glucan 2.1.2 Tính chất β-glucan 2.2 Sơ lược enzyme β-glucanase 2.2.1 Nguồn gốc enzyme β-glucanase 2.2.2 Ứng dụng enzyme β-glucanase 2.3 Tình hình nghiên cứu enzyme β-glucanase 2.3.1 Nghiên cứu nước 2.3.2 Nghiên cứu nước 2.4 Kỹ thuật tạo dòng biểu gen ngoại lai 2.4.1 Tạo dòng 2.4.2 Tế bào E coli dùng biểu 2.4.3 Các kỹ thuật vật liệu sử dụng tạo dòng Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Vật liệu hóa chất 14 3.1.1 Dụng cụ thiết bị 14 iv 3.1.2 Hóa chất môi trường 14 3.1.2.1 Hóa chất 14 3.1.2.2 Môi trường 16 3.1.3.3 Vật liệu sinh học 17 3.2 Phương pháp tạo dòng biểu gen 18 3.2.1 Tạo dòng gen signal-glu gen glu 18 3.2.1.1 Chuẩn bị gen 18 3.2.1.2 Chuẩn bị vector pQE-Ec mở vòng enzyme BamHI 20 3.2.1.3 Tạo vector tái tổ hợp 22 3.2.1.4 Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli JM109 22 3.2.1.5 Tuyển lựa dòng tế bào E coli JM109 mang vector tái tổ hợp 22 3.2.1.6 Phân tích giải trình tự 24 3.2.2 Biểu enzyme tái tổ hợp 24 3.2.2.1 Tạo dòng biểu E coli WK6 mang vector tái tổ hợp 24 3.2.2.2 Cảm ứng biểu enzyme tái tổ hợp E coli WK6 25 3.2.3 Tinh chế enzyme tái tổ hợp 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1.Kết 28 4.1.1 Nhân dòng thiết kết vector biểu 28 4.1.1.1 Nhân dòng trình tự gen signal-glu thiết kế vector biểu 28 4.1.1.2 Nhân dòng tự gen glu thiết kế vector biểu 33 4.1.2 Biểu tinh chế protein tái tổ hợp 35 4.1.2.1 Tạo dòng biểu 35 4.1.2.2 Khảo sát cảm ứng biểu enzyme tái tổ hợp 36 4.1.2.3 Tinh chế enzyme tái tổ hợp 39 4.2 Thảo luận 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ampr Gen kháng ampicilline APS Amonium persulfate dATP 3’-deoxyadenine-5’-triphosphate dCTP 3’-deoxycytosine-5’-triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide dGTP 3’-deoxyguanine-5’-triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’-deoxynucleotide-5’-triphosphate dTTP 3’-deoxythyamine-5’-triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamin tetracetic acid IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside Kp Kilobase pair KDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani MCS Multiple cloning site OD Optical density ORF Open reading frame PCR Polymerase chain reaction PBS Phosphate buffer saline SDS Sodium dodecyl sulfat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel TAE Tricacetic ethylene diamine tetra acetate Taq Thermus aquaticus TE Tris ethylene diamine tetra acetate TEMED N,N,N`,N`-tetramethylethylene diamine vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 18 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt gen với enzyme BamHI 19 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng mở vòng vector với enzyme BamHI 20 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng xử lý vector sau cắt với BamHI 20 Bảng 3.6 Thành phần phản nối gen vào vector 21 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra dòng 22 Bảng 3.8 Thành phần phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp 22 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc glucan Hình 2.2 Mơ hình plasmid sử dụng cho cloning 10 Hinh 3.1 Tổng quan vector pQE-16 17 Hình 3.2 Biến tính protein SDS β-mercaptethanol 26 Hình 4.1 Gen signal-glu khuếch đại phản ứng PCR 29 Hình 4.2 Kiểm tra E coli JM109-pQE-EC-signal-glu kỹ thuật PCR 30 Hình 4.3 Kết vector pQE_Ec-signal-glu cắt BamHI 30 Hinh 4.4 Phân tích trình tự gen signal-glu ngân hàng gen 31 Hinh 4.5 Phân tích trình amino acid mã hóa gen signal-glu 32 Hình 4.6 Phân tích chuỗi peptide tín hiệu (signal peptide) 32 Hình 4.7 Kết sau gen glu khuếch đại phản ứng PCR 33 Hình 4.8 Kết kiểm tra dòng E coli JM109-pQE-Ec-glu 34 Hình 4.9 Kết vector pQE-Ec-glu cắt với enzym BamHI 34 Hình 4.10 Phân tích trình tự gen glu nghiên cứu 35 Hình 4.11 Kiểm tra dòng dòng biểu phản ứng PCR 36 Hình 4.12 Khảo sát cảm ứng biểu theo thời gian 37 Hình 4.13 Khảo sát cảm ứng biểu hiên theo nồng độ IPTG 37 Hình 4.14 Kết tinh enzyme tái tổ hợp 39 Biểu đồ 4.1 Sự phát triển E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu 38 Biểu đồ 4.2 Sự phát triển E coli WK6-pQE-Ec-glu 38 viii Sau gen glu chuyển vào vector pQE-Ec nhân dòng, kiểm tra phân tích giống trường hợp gen mã hóa phân tử tiền enzyme β-1,3-glucanase (signal-glu) đề cập Như vậy, vector tái tổ hợp pQE-Ec-glu cho phép tổng hợp enzyme tái tổ hợp β-1,3-glucanase (r-Glucanase) có trọng lượng phân tử khoảng 27,2 KDa có chiều là 241 amino acid Hình 4.8 Kết kiểm tra dòng E coli JM109-pQE-Ec-glu với cặp mồi kiểm chiều (Glu-F pQE-Ec-R) Giếng số chứng âm với mồi kiểm chiều, giếng số kết kiểm chiều khuẩn lạc E coli JM109-pQE-Ec-glu Hình 4.9 Kết kiểm tra vector pQE-Ec-glu phản ứng cắt với enzym BamHI.Giếng số thang DNA 100 bp (Promega, Mỹ) Giếng số sảm phẩm điện di sau cắt pQE-Ec-glu BamHI cho kết gảu vector pQE-Ec có trọng lượng 3,8 Kbp gen gu có trọng lượng 642 bp Sau vector pQE-Ec mang giải trình tự cơng ty Nam Khoa với cặp mồi giải trình tự pQE-Ec-F pQE-Ec-R Kết giải trình tự cho thấy giống dự đốn, trình tự gen glu gắn chiều, vị trí tương đồng với gen signal-glul tao trước khơng mang chuỗi trình tự mã hòa cho chuỗi peptide tín hiệu (hình 4.10) 34 Hình 4.10 So sánh trình tự gen glu nghiên cứu với gen mã hóa β-1,3glucanase chủng Bacillus amyloliquefaciens ngân hàn gen Trong đó: Query trinh tự glu, Sbjct trình tự mã hóa β-1,3-glucanase chủng Bacillus amyloliquefaciens Kết cho thấy có hai vị trí sai khác kết so sánh gen signal-glu 4.1.2 Biểu tinh chế protein tái tổ hợp 4.1.2.1 Tạo dòng vi khuẩn mang vector biểu Trong q trình nhân dòng vector biểu pQE-Ec-signal-glu vector pQEEc-glu, sử dụng chủng E coli JM109 Chủng E coli JM109 có hiệu suất biến nạp cao cho vector tái tổ hợp diện với số lượng lớn tế bào Tuy nhiên, chủng E coli JM109 không phù hợp cho mục đích biểu protein Vì vậy, bước liên quan tới biểu protein tái tổ hợp tiến hành chủng E coli WK6 Để có chủng E coli WK6 mang vector tái tổ hợp pQE-Ec-signal-glu (E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu) chủng E coli WK6 mang vector tái tổ hợp pQE-Ecglu (E coli WK6-pQE-Ec-glu) Chúng tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp pQEEc-signal-glu vector tái tổ hợp pQE-Ec-glu vào tế bào E coli WK6 phương pháp sốc điện Các dòng vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu dòng vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-glu sau sàng lọc mơi trường LB agar/ampicilline 100μg/ml kiểm tra lại phương pháp PCR phân tích dòng dòng E coli JM109 mang vector tái tổ hợp 35 Kết PCR phân tích dòng thể hình 4.11.a hình 4.11.b cho thấy chúng tơi tạo dòng vi khuẩn biểu E cloi WK6-pQE-Ec-signal-glu dòng vi khuẩn biểu E coli Wk6-pQE-Ec-glu Các dòng vi khuẩn sau sử dụng cho nghiên cứu biểu enzyme tái tổ hợp Hình 4.11 Kiểm tra dòng dòng biểu phản ứng PCR phân tích dòng (a) Kiểm tra dòng biểu E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu PCR kiểm tra dòng với mồi kiểm chiều (signal-glu-F mồi pQE-Ec-R) Giếng số chứng âm với mẫu thử nước Giếng số kết PCR kiểm tra dòng E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu cho kích thước 847 bp Giếng số thang DNA 100 bp (Promega, Mỹ) (b) Kiểm tra dòng biểu E coli WK6-pQE-Ec-glu PCR kiểm tra dòng với mồi kiểm chiều (glu-F mồi pQE-Ec-R) Giếng số chứng âm với mẫu thử nước Giếng số kết sau PCR kiểm tra dòng E coli WK6-pQE-Ec-glu cho kích thước 760 bp Giếng số thang DNA 100 bp (Promega, Mỹ) 4.1.2.2 Khảo sát cảm ứng biểu enzyme tái tổ hợp Nhằm mục đích kiểm tra biểu enzyme tái tổ hợp từ dòng vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu dòng vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-glu Chúng tơi tiến hành số khảo sát biểu enzyme tái tổ hợp phát triển dòng biểu nghiên cứu với chất cảm ứng biểu IPTG Kết khảo sát cảm ứng biểu theo thời gian với IPTG 0,1 mM Với chủng E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu, kết khảo sát cho thấy biểu enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase (hình 4.12.a) với lượng nhỏ ngừng tăng sinh vi khuẩn nhận thấy qua kết đo OD600 (biểu đồ 4.1) Trong đó, thí nghiệm tương tự chủng E coli WK6-pQE-Ec-glu cho thấy biểu enzyme tái tổ hợp r-Glucanase với lượng lớn (hình 4.12.b) vi khuẩn phát triển bình thường (biểu đồ 4.2) 36 (a) (b) Hình: 4.12 Khảo sát cảm ứng biểu theo thời gian với nồng độ IPTG 0,1 mM (a): Khảo sát chủng E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu Với giếng số tới giếng số tương ứng với thời gian cảm ứng IPTG 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 20 giờ, cho thấy diện enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase có trọng lượng 30,3 KDa Giếng số thang protein (b): Khảo sát chủng E coli WK6-pQE-Ecl-glu Với giếng số tới giếng số tương ứng với thời gian cảm ứng IPTG 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6,7; 20 giờ, cho thấy diện enzyme tái tổ hợp r-Glucanase có trọng lượng 27,2 KDa Giếng số 10 thang protein Kết sát cảm ứng biểu theo nồng độ IPTG cảm ứng vòng Ở chủng E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu, kết khảo sát cho thấy biểu enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase (hình 4.13.a) với ngừng tăng sinh vi khuẩn (biểu đồ 4.1) Trong đó, thí nghiệm tương tự chủng E coli WK6-pQE-Ec-glu cho thấy biểu enzymer tái tổ hợp r-Glucanase với lượng lớn (hình 4.13.b) vi khuẩn phát triển bình thường (biểu đồ 4.2) (a) (b) Hình.4.13 Khảo sát cảm ứng biểu theo nồng độ IPTG (a): Khảo sát với chủng E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu: giếng số tới giếng số tương ứng với nồng độ IPTG cảm ứng mM; 0,01 mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,5 mM; mM; 1,5 mM; mM cho thấy diện enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase có lượng khoảng 30,3 KDa Giếng số thang protein (b): Khảo sát với chủng E coli WK6-pQE-Ec-glu: giếng số tới giếng số tương ứng với nồng độ IPTG cảm ứng mM; 0,01 mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,5 mM; mM; 1,5 mM; cho thấy diện enzyme tái tổ hợp r-Glucanase có trọng lượng 27,2 KDa Giếng số thang protein 37 Kết khảo sát phát triển dòng E coli WK6 mang vector tái tổ hợp Kết khảo sát phát triển chủng E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu Trong trường hợp ni cấy lắc mơi trường LB-ampicilline có bổ sung chất cảm ứng kích thích IPTG nồng độ 0,1 mM cho thấy ngừng phát triển vi khuẩn Trong ni mơi trường LB-ampicilline khơng bổ sung chất cảm ứng kích thích IPTG vi khuẩn tăng sinh cách bình thường (biểu đồ 4.1) Biểu đồ 4.1 Sự phát triển E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu Kết khảo sát phát triển chủng E coli WK6-pQE-Ec-glu Kết cho thấy dù vi khuẩn ni trường hợp LB-ampicilline có bổ sung chất cảm ứng kích thích IPTG hay mơi trường LB-ampicilline khơng bổ sung IPTG vi khuẩn phát triển tăng sinh bình thường (biểu đồ 4.2) Biểu đồ 4.2 Sự phát triển E coli WK6-pQE-Ec-glu 38 4.1.2.3 Tinh chế enzyme tái tổ hợp Theo thiết kế vector tái tổ hợp pQE-Ec-signal-glu vector tái tổ hợp pQEEc-glu, vector tái tổ hợp cho phép tổng hợp enzyme tái tổ hợp mang trình tự amino acid đặc trưng Etag Histag Để khẳng định biểu với khả tinh chế enzyme tái tổ hợp Chúng tiến hành nuôi cấy, cảm ứng biểu enzyme tái tổ hợp tinh enzyme tái tổ hợp từ dòng vi khuẩn E coli WK6-pQEEc-signal-glu dòng vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-glu kít MagneHis™ Protein Purification System (Promega, Mỹ) Hình 4.14 Kết tinh enyme tái tổ hợp giếng số protein tổng số E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu trước kích thích với IPTG Giếng số protein tổng số E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu sau kích thích với IPTG nồng độ 0,1 mM Giếng enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase tinh Giếng số thang protein Giếng số enzyme tái tổ hợp r-Glucanase tinh Giếng số protein tổng số E coli WK6-pQE-Ec-glu sau kích thích với IPTG nồng độ 0,1 mM Giếng số protein tổng số WK6-pQE-Ec-glu trước kích thích với IPTG Kết tinh enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase với kết tinh enzyme tái tổ hợp r-Glucanase (hình 4.14) Kết cho thấy enzyme tái tổ hợp tinh mức cao có trọng lượng phân tử giống lượng dự đoán enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase, r-Glucanase 4.2 Thảo luận Nghiên cứu Montarop Yamabhai (2007) Zhiwei Xu (2005) cho thấy chuỗi peptide tín hiệu (signal peptide) Bacillus spp có khả hoạt động tế bào vi khuẩn E coli Những kết nghiên cứu cho thấy: việc biểu bất thường chủng E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu biểu 39 enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase có chứa chuỗi peptide tín hiệu Chuỗi peptide tín hiệu hoạt động giúp r-preGlucanase chuyển qua màng tế bào, đồng thời enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase hoạt động phân giải lớp màng tế bào làm cho tế bào bị tổn thương nên tế bào ngừng tăng sinh (bảng 4.1) dẫn tới tổng hợp enzyme r-preGlucanase mức độ thấp (hình 4.12.a hình 4.13.a) 40 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đã tổng hợp thành cơng tồn trình tự gen (signal-glu) dài 729 bp chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens mã hóa cho phân tử tiền enzyme β-1,3-glucanase có chứa đoạn petide tín hiệu (signal-peptide) trình tự gen (glu) mã hóa cho enzyme β-1,3-glucanase khơng có chứa đoạn petide tín hiệu chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens phản ứng PCR Tạo dòng thành cơng đoạn gen signal-glu mã hóa cho tền enzyme β-1,3glucanase vào vector pQE-Ec (pQE-Ec-signal-glu) tạo dòng thành cơng đoạn gen glu mã hóa cho enzyme β-1,3-glucanase vào vector pQE-Ec (pQE-Ec-glu) Và dòng vector tái tổ hợp pQE-Ec-signal-glu pQE-Ec-glu chuyển thành công vào tế bào nhân dòng E coli JM109 (E coli JM109-pQE-Ec-signal-glu E coli JM109pQE-Ec-glu) giúp cho việc nhân dòng vector với số lượng lớn Vector tái tổ hợp sau biểu thành cơng tế bào E coli WK6 (E coli WK6- pQE-Ec-signal-glu E coli WK6-pQE-Ec-glu) Tinh enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase từ dòng E coli WK6-pQEEc-signal-glu enzyme tái tổ hợp r-Glucanse từ dòng E coli WK6-pQE-Ec-glu mức độ cao sau đuợc cảm ứng với chất cảm ứng biểu IPTG Chuỗi peptide tín hiệu (signal peptide) chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens có khả hoạt động tế bào E coli 5.2 ĐỀ NGHỊ Để việc sản xuất thu nhận enzyme tái tổ hợp r-preGlucanase r-Glucanase cách hiệu đạt giá trị cao cần có thêm khảo sát hồn thện quy trình biểu tinh chế enzyme tái tổ hợp như: khảo sát thời gian, nhiệt độ, nồng độ cảm ứng IPTG, thực nghiên cứu kiểm tra hoạt tính enzyme tái tổ hợp Đối với vector tái tổ hợp pQE-Ec-signal-glu cần tiếp tục nghiên cứu biểu tế bào thích hợp khác tế bào Bacillus sp Đặc biệt hoạt động chuỗi peptide tin hiệu (signal peptide) có ý nghĩa quan trọng Như giúp việc thu nhận enzyme cách dễ dàng, giúp hiểu thêm trình vận chuyển protein qua màng sinh vật… Bởi vậy, cần có 41 nghiên cứu hoạt động chuỗi petide tín hiệu như: Tạo protein tái tổ hợp có chưa chuỗi peptide tín hiệu, chuỗi peptide tín hiệu hoạt động giúp cho protein có khả vận chuyển qua màng từ thu nhận tinh chế protein tái hợp cách dễ dàng 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 2006 Danh mục thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi nhập vào Việt Nam Số 01/2006/QĐ-BNN Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phân tử-Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm 2004, Công nghệ enzyme Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đỗ Hữu Phương 2004 Thức ăn chăn nuôi Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi Số 1/2004 Nhà xuất Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn Hồ Huỳnh Thùy Dương 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục Hồ Sỹ Tráng 2006 Cơ sở hóa gỗ cellolose tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc 1999 Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt nông nghiệp Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551 Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh 1999 Khả sinh tổng hợp cellulase Actinomyces griseus Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 804-809 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Huy Phúc 1996 Công nghệ vi sinh Trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tập 3, nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 11 Nguyễn Thị Lang 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp 13 Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa 2006 Enzyme ứng dụng Nhà xuất Giáo Dục 14 Trịnh Đình Khá 2006 Tuyển chọn, ni cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase đánh giá tính chất lý hóa cellulase Luận văn Thạc sỹ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 15 Adeney,W S., Baker, J O., Vinzant, Vinzant, T B., Thomas,S.R., and Himmel, M E 1995 Kinetic comparison of beta-D-glucosidases of industrial Importance Abstracts of Papaers of the American Chemical Society, 209, 119-BTEC 16 Åman, P., Rimsten, L., Andersson, R (2004) Molecular weight distribution of βglucan in oat-based foods Cereal Chem 81, pp 356-360 43 17 Bagnara C, Gaudin C, Bélaïch JP 1987 Physiological properties of Cellulomonas fermentans, a mesophilic cellulolytic bacterium Appl Microbiol Biotechnol, 26: 170176 18 Bamforth, C.W and Martin, H.L 1981 β-Glucan and glucan solubilase in malting and mashing J Inst Brew 87: 365-371 19 Bergquist PL, Gibbs MD, Morris DD, Teo VSJ, Saul DJ, Morgan HW 1999 Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria, FEMS Microbiol E coli, 28: 99-1102 20 Borriss, R., Zemek, J, Augusts, J and Kuniak, L 1980 β-1,3-1,4-Glucanase in sporeforming microorganisms, II Production of and glucan-hydrolases by various Bacillus species Zbl Bakt II Abt 135: 435-442 21 Campillo ED 1999 Multiple endo-1,4-β-D-glucanase (cellulase) genes in Arabidopsis, Curr Top Dev Biol, 46: 39-61 22 Cantwell B.A and McConnell D.J 1983 Molecular cloning and expression of a Bacillus subtilis β-glucanase gene in Escherichia coli Gene, 23: 211-219 23 Cheryan MS, Shah PM, Witjitra K 1997 Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum Adv Appl Microbiol, 43: 1-33 24 Coral G, Arikan B, Unaldi M, Guvenmes H 2002 Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type Strain, Turk J Biol, 26: 209-213 25 Cornelis, P, Digneffe, C and Willemot, K 1982 Cloning and expression of a Bacillus coagulans amylase gene in Escherichia coli Mol Gen Genet 186: 507-511 26 Das M, Prasad J, Ahmad S 1997, Endoglucanase production by paper-degrading mycoflora, Appl Microbiol, 25: 313-315 27 Dürre P 1998 New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation Appl Microbiol Biotechnol, 49: 639-648 28 Fincher GB, Stone BA 2004 Chemistry of nonstarch polysaccharides In: Wrigley C, Corke H, Walker CE, editors Encyclopedia of Grain Science Oxford: Elsevier, pp 206-223 29 Fouet, A., Klier, A and Rapoport, G 1982 Cloning and expression in Escherichia coli of the sucrase gene from Bacillw subtilis Mol Gen Genet: 186: 399-404 30 Gao J, Weng H, Xi Y, Zhu D, Han S 2008 Purification and characterization of a novel endo-β-1,4-glucanase from thermoacidophilic Aspergillus terreus, Biotechnol Lett, 30: 323-327 31 Gielkens M, Dekker E, Visser J, Graaff L 1999 Two cellubiohydrolase-encoding genes from Aspergillus niger require D-Xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their expression Appl Environ Microbiol, 65(10): 4340-4345 32 Gordon R, Haynes W, Pang C 1973 The genus Bacillus, Agriculture handbook, Washington DC 33 Henning J, Morkeberg A, Krogh KBR, Olsson L 2005 Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis, Enzyme Microb Technol, 36: 42-48 34 Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G 1999., Endoglucanase 28 (Cel12A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase, Eur J Biochem, 259: 88-95 44 35 Howard RL, Abotsi E, Rensburg ELJ, Howard S 2003 Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production Afr J Biotechnol, 2: 602-619 36 Hsu CK, Liao JW, Chung YC, Hsieh CP, Chan YC 2004 Xylooligosaccharides and fructooligosaccharides affect the intestinal micro biota and precancerous colonic lesion development in rats J Nutr, 134: 1523-1528 37 Jiong Hong, Hisanori Tamaki, shunichi Akiba, Kenji Yamamoto Hidehiko Kumaga 2001 Cloning of a Gene Encoding a Highly Stable Endo-β-1,4-Glucanase from Aspergillus niger and Its Expression in Yeast Journal of bioscience and bioengineering, 5: 434-441 38 Kim BH 1987, Carbohydrate catabolism in cellulolytic strains of Cellulomonas, Pseudomonas, and Nocardia, Korean J Microbiol, 25: 28-33 39 Moran, Jr C.P Lang, N., LeGrice, S.F.J., Lee, G and Stephens, M 1982 Nucleotide sequences that signal the initiation of transcription and translation in Bacillw subtilis Mol Gen Genet 186: 339-346 40 Mullis K et al Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symn Quant Biol.51: 263-273 41 M.J McPherson, and S.G Moller Springer-Verlag, NY, NY 2000 ISBN 1859960170 Applied Molecular Genetics Course: ENTO 5133–Spring 2006 42 M Simsek and U L Raj Bhandary 1973 Biochem Biophys Res Comm., 49,508 43 Nakakuki T 2003 Development of functional oligosaccharides in Japan Trends Glycosci Glycotechnol, 15: 57-64 44 Naohito Ohno, Michiharu Uchiyama, Aiko Tsuzuki, Kazuhiro Tokunaka, Noriko N Miura, Yoshiyuki Adachi, Maki W.Aizawa, Hiroshi Tamura, Shigenori Tanaka, Toshiro Yadomae 1999 Solubilization of yeast cell-wall β-(1-3)-D-glucan by sodium hypochlorite oxidation and dimethyl sulfoxide extraction Carbohydrate Research, 316: 167–172, 45 Nelda López, Gerard Cuzon, Gabriela Gaxiola, Gabriel Toaboada, Manuel Valanzuela, Cristina Pascual, Ariadna Sanchez and Carlos Rosas 2003 Physical, nutritional, and immunological role of dietary β-1,3-glucan and ascorbic acid 2monophosphate in Litopenaeus vannamei juveniles Aquculture, 234: 223–243, 46 Palonen H, Tenkanen M, Linder M 1999 Dynamic interaction of Trichoderma reesei cellobiohydrolases Cel6A and Cel7A and cellulose at equilibrium and during hydrolysis, Appl Environ Microbiol, 65:5229 - 5233 47 Priest, F.G 1977 Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus Bacterial Rev 41: 711 - 753 48 Omogbenigun OF, Nyachoti CM, Slominski BA 2004 Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs J Anim Sci, 82: 1053 - 1061 49 R.S Chambers, M.J Broughton, R.D Cannon, A Carne, G.W.Emerson, P.A Sullivan 1993 An exo-β-1,3-glucanase of Candida albicans:purification of the enzyme and molecular cloning of the gene, J Gen Microbiol 139: 325–334 50 Sharma VK, Hagen JC 1995 Isolation and characterization of Clostridium hobsonii comb nov, Biores Technol, 51: 61-74 51 T.A Brown 1997 Gene cloning an introduction (third edition) Chapman and Hall 45 52 Wachinger G, Bronnenmeier K, Staudenbauer WL, Schrempf H 1989 Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli, Appl Environ Microbiol, 55: 2653-2657 53 Watanabe H, Tokuda G 2001 Animal cellulases, Cell Mol Life Sci, 58: 11671178 54 WOOD, P J., WEISZ, FEDEC, P, and BURROWS, V D 1989 Large-scale preparation and properties of oat fractions enriched in (1-3)(1-4)-β-D-glucan Cereal Chem 66: 97-103 55 WOODWARD,J R., and FINCHER,G,B 1983 Water soluble barley β-glucan, Brew Dig May, pp 28-32 56 Xu B, Janson JC, Sellos D 2001 Cloning and sequencing of a molluscan endo-β1,4-glucanase gene from the blue mussel, Mytilus edulis, Eur J Biochem, 268: 37183727 57 Zheng G.H., Rossnagel B.G., Tyler R.T and Bhatty, R S 2000 Distribution of βglucan in the grain ofhull-less barley Cereal Chem 77: 140-144 58 Zhiwei Xu, Ming-Che Shih, Jonathan E Poulton 2006 An extracellular exo-β(1,3)-glucanase from Pichia pastoris :Purification, characterization, molecular cloning,and functional expression Protein Expression and Purification 47: 118–127 TÀI LIỆU TỪ INTERNET http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP http://wwww.sinhhocvietnam.com http://www.fao.org http://www.agroviet.gov.vn http://www.cucchannuoi.gov.vn 46 PHỤ LỤC Kết giải tình tự gen signal-glu >Signal-Glucanase ATGTTTTATCGTATGAAACGAGTGCTGCTCATTCTTGTCACTGGATTGTTTT TGAGTTTGTGTGCGATCACTTCTGCTGCATCAGCTCAAACAGGCGGATCGT TTTTTGAACCTTTTAACAGCTATAACTCCGGTTTCTGGCAAAAAGCAAATG GTTACTCCAATGGAGATATGTTCAACTGCACTTGGCGGGCAAATAATGTAT CCGTGACGTCATCAGGTGAAATGCGTTTGGCGCTGACAAGCCCGTCTTATA ACAAGTTTGACTGCGGGGAGAACCGCTCCGCTCAAACCTATGGCTATGGA CTTTATGAAGTCAGAATGAAACCGGCTAAAAACACGGGGATCGTTTCATC GTTCTTCACTTATACAGGTCCAACGGATGGTACCCCTTGGGATGAGATTGA TATCGAATTTTTAGGAAAAGACACGACAAAGGTTCAATTTAATTATTATAC AAATGGCGCGGGAAACCATGAGAAGGTTGCGGATCTCGGATTTGACGCGG CCAATGCCTATCATACGTATGCGTTCGATTGGCAGCCGAACTCTATTAAAT GGTATGTCGATGGGCAATTAAAACATACTGCGACAAGCCAAATCCCGACA ACACCGGGAAAGATCATGATGAACTTGTGGAATGGGATAGGTGTCGATGA CTGGCTCGGTTCCTACAATGGTGTAAATCCGCTATACGCTCATTATGACTG GGTGCGCTATACAAAAAAA Kết giải trình tự gen glu >Glucanase CAAACAGGCGGATCGTTTTTTGAACCTTTTAACAGCTATAACTCCGGTTTC TGGCAAAAAGCAAATGGTTACTCCAATGGAGATATGTTCAACTGCACTTG GCGGGCAAATAATGTATCCGTGACGTCATCAGGTGAAATGCGTTTGGCGCT GACAAGCCCGTCTTATAACAAGTTTGACTGCGGGGAGAACCGCTCCGCTC AAACCTATGGCTATGGACTTTATGAAGTCAGAATGAAACCGGCTAAAAAC ACGGGGATCGTTTCATCGTTCTTCACTTATACAGGTCCAACGGATGGTACC CCTTGGGATGAGATTGATATCGAATTTTTAGGAAAAGACACGACAAAGGT TCAATTTAATTATTATACAAATGGCGCGGGAAACCATGAGAAGGTTGCGG ATCTCGGATTTGACGCGGCCAATGCCTATCATACGTATGCGTTCGATTGGC AGCCGAACTCTATTAAATGGTATGTCGATGGGCAATTAAAACATACTGCG ACAAGCCAAATCCCGACAACACCGGGAAAGATCATGATGAACTTGTGGAA TGGGATAGGTGTCGATGACTGGCTCGGTTCCTACAATGGTGTAAATCCGCT ATACGCTCATTATGACTGGGTGCGCTATACAAAAAAA Bảng Tốc độ phát triển vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu theo thời gian ni mơi trường LB-ampicilline có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 0,1 mM Thời gian (giờ) 20 0,5 0,52 0,51 0,52 0,52 0,51 0,52 0,52 0,56 OD600 0,52 0,51 0,52 0,53 0,51 0,52 0,52 0,52 0,53 0,56 0,51 0,51 0,54 0,51 0,53 0,54 0,52 0,56 0,55 0,54 0,56 0,57 0,56 0,56 0,54 0,56 0,6 Bảng Tốc độ phát triển vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-signal-glu sau nuôi cấy môi trường LB-ampicilline có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ Nồng độ chất cảm ứng IPTG (mM) 0,01 0,05 0,1 0,5 1,5 1,72 0,53 0,51 0,52 0,52 0,53 0,52 0,51 OD600 1,80 0,54 0,51 0,51 0,53 0,52 0,51 0,53 1,66 0,54 0,52 0,55 0,52 0,51 0,54 0,52 Bảng Tốc độ phát triển vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-glu theo thời gian nuôi mơi trường LB-ampicilline có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 0,1mM Thời gian (giờ) 20 0,53 1,05 1,3 1,64 1,94 2,5 2,74 2,91 3,30 OD600 0,55 1,20 1,42 1,68 1,99 2,62 2,78 3,01 3,29 0,56 1,21 1,41 1,59 1,92 2,46 2,69 3,04 3,19 Bảng Tốc độ phát triển vi khuẩn E coli WK6-pQE-Ec-glu sau nuôi cấy mơi trường LB-ampicilline có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ Nồng độ cảm ứng với IPTG (mM) OD600 0,01 0,05 0,1 0,5 1,5 1,98 1,99 1,86 1,95 1,86 1,89 1,93 1,93 1,98 1,94 1,98 1,89 1,87 1,89 1,92 1,89 1,96 1,95 1,94 1,92 1,94 1,9 1,93 1,94 ... Bacillus amyloliquefaciens vi khuẩn Garm dương có khả tiết enzyme β1 ,3-glucanase ngoại bào giúp thủy phân β- glucan Từ đó, chúng tơi tiến hành tạo dòng biểu enzyme tái tổ hợp β- 1,3-glucanase từ. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME β -1,3-GLUCANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS. .. vậy, vi c nghiên sản xuất enzyme β- 1,3-glucanase tái tổ hợp để đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày quan tâm 1.2 Mục tiêu đề tài Tạo dòng vi khuẩn biểu gen mã hóa enzyme β- 1,3-glucanase từ Bacillus amyloliquefaciens