Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 49 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
49
Dung lượng
1,39 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG ĐOẠN GEN 3D VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TRẦN VIẾT HỌC Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG ĐOẠN GEN 3D VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI TRẦN VIẾT HỌC KS VÕ KHÁNH HƢNG Tháng năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên xin bày tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM, ban chủ nhiệm môn Công nghệ sinh học tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trƣờng PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải KS Võ Khánh Hƣng tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt trình thực khóa luận Các thầy anh chị Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trƣờng – trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thực tập tốt nghiệp Tập thể lớp Cơng nghệ sinh học khóa 2008-2012 bạn bè động viên giúp đỡ suốt q trình học tập thực khóa luận Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Trần Viết Học i TĨM TẮT Đề tài : “Tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng” Lở mồm long móng (LMLM) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, đƣợc OIE (Oficina Internacional de Epizootias) xếp đầu bảng A, bảng danh mục bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm động vật Ở Việt Nam, vào năm 2009 - 2010 dịch LMLM tái xuất nhiều tỉnh nƣớc Hiện nay, virus LMLM lƣu hành Việt Nam thuộc týp A, O Asia Phát nhanh virus lở mồm long móng điều thiết yếu việc chẩn đoán chữa trị bệnh Vì chúng tơi thực tạo dòng đoạn gen 3D virus LMLM vào vector pGEM T-easy, làm đối chứng dƣơng cho phản ứng chẩn đoán virus lở mồm long móng Tổng cộng 32 gen virus đƣợc thu thập từ Genbank thực alignment với cặp mồi 3DF, 3DR phẩn mềm Bioedit version 3.3.19.0 Cặp mồi có độ tƣơng đồng cao so với genome virus LMLM vùng gen 3D Nhƣ vậy, cặp mồi đặc hiệu với virus LMLM sử dụng để chẩn đoán virus LMLM kỹ thuật RTPCR Đoạn gen 3D đƣợc khuếch đại giải trình tự để xác định týp, sau chèn vào vector pGEM T-Easy (Promega) chuyển vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Các khuẩn lạc nhận plasmid đƣợc chọn lọc kiểm tra phƣơng pháp PCR giải trình tự Kết cho thấy thu đƣợc tế bào E coli DH5α chứa plasmid pGEM T-3D ii SUMMARY Research title : “ Cloning the 3D gene of Foot and Mouth Disease Virus” Foot and mouth disease (FMD) is a dangerously infectious disease, classified in group A, the list of particularly dangerously infectious disease in animals In Viet Nam, between 2009 and 2010, FMD reemerged in many provinces Currently, FMD virus type A, O and Asia are circulating in Vietnamese Rapid detecting FMD is essential for diagnosis and treatment Thus, we cloned the 3D gene of FMDV into pGEM T-Easy vector as the positive control for diagnosis of FMDV 32 genome was obtained from Genbank and was aligned to determine the similariry of the primers 3DF, 3DR by Bioedit software version 3.3.19.0 These primers have higher similarity with 3D gene region on FMDV genome Thus, these primers are specific for FMDV detection Amplification of 3D gene was performed by RT-PCR and then sequencing of the RTPCR product was done to determine the type virus The amplified 3D gene was inserted into pGEM T-Easy vector (Promega) and transferred into E coli DH5α The colonies that received plasmids were selected and tested by PCR and sequencing to obtain the E coli DH5α carrying plasmid pGEM T-3D Key words : cloning, 3D gene, foot and mouth disease iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh lở mồm long móng 2.2 Virus gây bệnh lở mồm long móng 2.2.1 Virus lở mồm long móng 2.2.2 Cấu trúc phân tử virus lở mồm long móng 2.2.3 Các chủng virus lở mồm long móng tình hình phân bố giới 2.2.4 Phƣơng pháp chẩn đoán virus lở mồm long móng 2.3 Tổng quan phƣơng pháp RT-PCR 2.3.1 Phƣơng pháp RT-PCR 2.3.2 Nguyên tắc phản ứng RT-PCR 2.3.3 Thành phần phản ứng RT-PCR 2.3.4 Các bƣớc phản ứng PCR iv 2.4 Phƣơng pháp tạo dòng đoạn gen 2.4.1 Phƣơng pháp tạo dòng đoạn gen có đầu 2.4.2 Phƣơng pháp tạo dòng đoạn gen có đầu dính 10 2.3.4 Phƣơng pháp TA cloning 11 2.4.4 Hệ thống vector pGEM T-Easy 11 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Thời gian địa điểm 13 3.2 Hóa chất thiết bị 13 3.3 Nội dung nghiên cứu 14 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 3.4.1 Thu nhận mẫu 15 3.4.2 Thu nhận định týp đoạn gen 3D virus lở mồm long móng 15 3.4.2.1 Ly trích RNA virus lở mồm long móng 15 3.4.2.2 Thực phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen 3D 16 3.4.3 Tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng 17 3.4.3.1 Tinh sản phẩm RT-PCR 17 3.4.3.2 Thực phản ứng nối gen 3D vào vector pGEM T-Easy 18 3.4.3.3 Biến nạp plasmid pGEM-T Easy chèn DNA đích vào tế bào khả nạp 19 3.4.3.3.1 Chuẩn bị tế bào E coli khả nạp phƣơng pháp calcium chloride 19 3.4.3.3.2 Biến nạp plasmid pGEM-T Easy chèn DNA vào tế bào khả nạp 19 3.4.4 Sàng lọc dòng vi khuẩn E coli DH5α mang plasmid pGEM T-3D 20 3.4.4.1 Chọn lọc tế bào biến nạp plasmid DNA 20 3.4.4.2 Phản ứng PCR kiểm tra plasmid 21 3.4.4.2.1 Quy trình ly trích plasmid 21 v 3.4.4.2.2 Phản ứng PCR kiểm tra plasmid 22 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Độ đặc hiệu cặp mồi 3DF, 3DR 23 4.1.1 Alignment mồi 3DF, 3DR với genome virus PRRS, PCV2, Aphthovirus 23 4.1.2 Alignment mồi 3DF, 3DR với genome virus lở mồm long móng 24 4.2 Thu nhận định týp đoạn gen 3D 25 4.2.1 Sản phẩm RT-PCR 25 4.2.2 Kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR 25 3.4 Kết tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng 27 3.4.1 Tinh sản phẩm RT-PCR 27 3.4.2 Khuẩn lạc E coli DH5α môi trƣờng LB 27 4.4 Kết sàng lọc dòng vi khuẩn E coli DH5α 28 4.4.1 Kết phản ứng PCR khuẩn lạc 28 4.4.2 Kết phản ứng PCR kiểm tra plasmid 28 4.4.2.1 Kết ly trích plasmid 29 4.4.2.2 Kết PCR plasmid 29 4.3.4.3 Kết giải trình tự sản phẩm PCR plasmid 30 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified fragment length polymorphism BHK-21 Baby Hamster Kidney 21 Bp Base pair cDNA Complementary Deoxynucleic Acid DNA Deoxynucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate dCMP Deoxyribo Cytosine Monophosphate dGMP Deoxyribo Guanine Monophosphate dTTP Deoxyribo Thymidine Triphosphate FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB Luria bertani LMLM Lở mồm long móng MCS Multi Cloning Site ORF Open reading frames OIE Oficina Internacional de Epizootias PCR Polymerase Chain Reaction RNA RiboNucleic Acid RAPD Random amplified polymorphic DNA RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SAT South African Territories TBE Tris/Borate/EDTA UTR Unstranlated Region vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Cặp mồi phản ứng khuếch đại đoạn gen 3D 16 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen 3D 16 Bảng 3.3 Quy trình nhiệt phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen 3D 17 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất phản ứng ligation 18 Bảng 3.5 Quy trình nhiệt phản ứng PCR phát đoạn gen 3D 20 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất phản ứng PCR khuẩn lạc phát đoan gen 3D 21 Bảng 3.7 Thành phần hóa chất PCR kiểm tra plasmid 22 viii Kết alignment hình 4.1 cho thấy, trình tự mồi 3DF 3DR khơng có tƣơng đồng với trình tự genome Điều chứng tỏ khả bắt cặp, khuếch đại tạo sản phẩm cặp mồi khơng có 4.1.2 Alignment mồi 3DF, 3DR với genome virus lở mồm long móng Để kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi 3DF, 3DR (bảng 2.1) với genome virus LMLM, trình tự týp A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 SAT3 đƣợc thu thập từ Genbank (Phụ lục 3) Mồi trình tự đƣợc alignment với trình tự để kiểm tra độ tƣơng đồng phần mềm Bioedit Hình 4.2 Alignment mồi 3DF, 3DR với trình tự virus lở mồm long móng Đoạn gen 3D virus LMLM có bảo tồn cao chủng Theo hình 4.2, cặp mồi 3DF, 3DR có khả khuếch đại đoạn gen 3D tất týp virus LMLM, cho sản phẩm 204 bp Vậy, cặp mồi 3DF, 3DR sử dụng để phát virus LMLM, phục vụ chẩn đoán bệnh LMLM 24 4.2 Thu nhận định týp đoạn gen 3D 4.2.1 Sản phẩm RT-PCR Phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen 3D đƣợc thực đƣợc thực với cặp mồi 3DF 3DR (bảng 3.1) theo quy trình nhiệt (bảng 3.3) thành phần hóa chất (bảng 3.2), cho sản phẩm có kích thƣớc 204 bp, kết điện di sản phẩm RT-PCR nhƣ hình 4.3 Hình 4.3 Sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn 3D Lad : ladder 100bp plus; (-) : đối chứng âm RNA: sản phẩm RT-PCR với RNA virus LMLM Điện di sản phẩm RT-PCR với mẫu RNA virus LMLM cho băng kích thƣớc khoảng 204 bp gel agarose 1,5%, phù hợp với kết dự tính mục 3.4.2.2 Đối chứng âm cho kết âm tính, chứng tỏ q trình thực phản ứng RT-PCR không bị tạp nhiễm Sản phẩm RT-PCR đƣợc sử dụng để giải trình tự địnhtýp virus LMLM 4.2.2 Kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR Sản phẩm RT-PCR cho kết điện di nhƣ mục 4.1.1 đƣợc giải trình tự cơng ty Nam Khoa với mồi 3DF Kết giải trình tự đƣợc chuyển từ dạng peak (phụ lục 1) sang dạng chữ phần mềm Bioedit (hình 4.4) Kết đƣợc sử dụng để blast so sánh độ tƣơng đồng với trình tự gen 3D virus LMLM Genbank 25 Hình 4.4 Kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR Hình 4.5 Kết Blast vùng giải trình tự NCBI Query: trình tự vùng gen 3D giải trình từ sản phẩm RT-PCR, Sbjct: trình tự virus LMLM týp O ( GU125648.1) Genbank Kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR giống 91-99% (phụ lục 4) so đoạn gen 3D virus LMLM Hình 4.5 cho thấy, trình tự đoạn 3D đƣợc giải trình tự có độ tƣơng đồng 99% so với trình tự đoạn 3D virus LMLM týp O Vị trí đoạn gen mồi 3DF, 3DR (bảng 3.1) alignment mồi với trình tự virus LMLM 7940-8144 Tuy nhiên, kết blast cho thấy đoạn gen đƣợc giải trình nằm vị trí khác (phụ lục 4), cụ thể 7512-7682 (hình 4.5) Điều lý giải : - Kết giải trình tự khơng bao gồm trình tự mồi 3DF, sản phẩm RT-PCR đƣợc giải trình tự chiều với mồi 3DF - Việc alignment trình tự cặp mồi 3DF, 3DR (bảng 3.1) với genome virus LMLM nhằm xác định trình tự mồi có nằm genome hay khơng Vị trí mồi genome alignment nhiều trình tự tƣơng đối cho trình tự Ngun nhân : trình tự có chiều dài khác Đột biến đoạn thêm đoạn týp virus, tạo nên vị trí miss match alignment, dẫn đến vị trí đoạn gen genome có sai khác 26 Theo nhƣ kết mục 4.1 kết giải trình, blast Genbank đoạn gen đƣợc giải trình tự đoạn gen 3D virus LMLM Sản phẩm RT-PCR đƣợc tinh làm nguyên liệu cho nghiên cứu 3.4 Kết tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng 3.4.1 Tinh sản phẩm RT-PCR Sản phẩm RT-PCR đƣợc thực tinh (mục 3.4.3.1), loại bỏ thành phần dƣ phản ứng RT-PCR có khả gây ức chế phản ứng nối Hình 4.6 Tinh sản phẩm RT-PCR Lad: ladder 100bp plus; 1: sản phẩm RT-PCR 2: sản phẩm RT-PCR sau tinh 3.4.2 Khuẩn lạc E coli DH5α môi trƣờng LB Tế bào vi khuẩn E coli sau biến nạp đƣợc cấy trang đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin, IPTG X-gal, ủ qua đêm 370C Kết ghi nhận hình 4.7 A B Hình 4.7 Khuẩn lạc thu đƣợc mơi trƣờng LB A: đĩa cấy dịch biến nạp, B: đĩa đối chứng 1: khuẩn lạc xanh, 2: khuẩn lạc trắng 27 4.4 Kết sàng lọc dòng vi khuẩn E coli DH5α Đoạn gen đích kích thƣớc khuếch đại đoạn 3D virus LMLM đƣợc chèn thành công vào plasmid theo mục 3.3.3 Thu đƣợc khuẩn lạc trắng mơi trƣờng thạch LB có bổ sung ampicillin, IPTG X-gal Để chứng minh kết thu đƣợc, thực phản ứng PCR khuẩn lạc, phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 3D plasmid giải trình tự công ty Nam Khoa ( mục 3.3.4 ) 4.4.1 Kết phản ứng PCR khuẩn lạc Các khuẩn lạc trắng đƣợc chọn lọc để thực phản ứng PCR khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi 3DF 3DR (bảng 3.1), với thành phần hóa chất theo bảng 3.6 chu trình nhiệt theo bảng 3.5 (mục 3.4.4.1), khuếch đại đoạn trình tự dài 204 bp Hình 4.8 Kết PCR khuẩn lạc (-):đối chứng âm, LAD: ladder 1,2,3: khuẩn lạc trắng Hình 4.8 cho thấy, điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc băng sản phẩm có kích thƣớc khoảng 204 bp, phù hợp với kết dự đoán mục 3.4.2.2 Đối chứng âm cho kết âm tính, chứng tỏ q trình thực PCR khuẩn lạc khơng có tƣợng tạp nhiễm Nhƣ vậy, DNA từ khuẩn lạc trắng có chứa đoạn trình tự 3D, đƣợc tăng sinh giữ dòng làm nguyên liệu cho nghiên cứu sau 4.4.2 Kết phản ứng PCR kiểm tra plasmid Các khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dƣơng tính theo mục 4.4.1 đƣợc tăng sinh giữ dòng, ly trích plasmid thực PCR theo mục 3.3.4.2.1 3.3.4.2.2 28 4.4.2.1 Kết ly trích plasmid Các dòng khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dƣơng tính (mục 3.4.1) đƣợc tăng sinh ly trích plasmid (mục 3.3.4.2.1) Kết điện di plasmid gel agarose 1,5%, 100V 30 phút nhƣ hình 4.9 Hình 4.9 Kết điện di plasmid Lad : ladder 100bp plus Plas : mẫu plasmid ly trích Kết điện di cho thấy, plasmid thu đƣợc có gia tăng kích thƣớc so với kích thƣớc 3015 bp vector pGEM T-Easy Điều chứng tỏ plasmid mang đoạn gen cần chèn Plasmid đƣợc sử dụng nhƣ khuôn mẫu cho phản ứng PCR giải trình tự (mục 3.3.4.2.2) 4.4.2.2 Kết PCR plasmid Nhằm khẳng định plasmid đƣợc ly trích mục 3.4.2.1 mang xác đoạn gen 3D cần chèn, plasmid đƣợc sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi 3DF 3DR (bảng 3.1) theo mục 3.3.4.2.2 Phản ứng khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc 204 bp (mục 3.3.3.3) Sản phẩm PCR đƣợc điện di đọc kết gel agarose 1,5% điện 100V 30 phút Kết điện di nhƣ hình 4.10 29 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid LAD: ladder; Plas: plasmid ly trích (+) : sản phẩm PCR plasmid; (-): đối chứng âm Kết PCR plasmid cho sản phẩm khoảng 204 bp, với dự đoán mục 3.4.4.2.2 Đối chứng âm cho kết âm tính, nhƣ phản ứng PCR plasmid khơng có tƣợng tạp nhiễm Kết PCR plasmid chứng minh đƣợc phản ứng chèn đoạn gen 3D virus LMLM vào vector pGEM T-Easy thành công 4.3.4.3 Kết giải trình tự sản phẩm PCR plasmid Sản phẩm PCR plasmid cho kết dƣơng tính theo mục 3.4.3.2 đƣợc giải trình tự chiều với mồi 3DF công ty TNHH Nam Khoa Kết giải trình tự nhƣ hình 4.11 phụ lục Trình tự đƣợc sử dụng để so sánh với trình tự đƣợc giải lúc trƣớc chèn vào vector pGEM T-Easy chƣơng trình xếp gióng hàng cột phần mềm Bioedit Hình 4.11 Kết giải trình sản phẩm PCR plasmid 30 Hình 4.12 Kết alignment xếp gióng hàng cột so sánh lần giải trình tự 3DHANH: trình tự sản phẩm RT-PCR định týp virus LMLM P130F: trình tự sản phẩm PCR mẫu plasmid So sánh kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR PCR plasmid chƣơng trình xếp gióng hàng cột Sự tƣơng đồng hai trình tự cao, khác vị trí đầu tiên, hình 4.12 Có sai khác hoạt động ghi nhận kết chƣa ổn định hệ thống giải trình tự Điều chứng tỏ đoạn gen đích đƣợc chèn thành cơng vào vector pGEM T-Easy 31 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Cặp mồi 3DF, 3DR khuếch đại đặc hiệu đoạn gen 3D virus lở mồm long móng Đoạn gen 3D virus lở mồm long móng chèn vào vector pGEM T-Easy, biến nạp vào tế bào E coli Các khuẩn lạc trắng đƣợc chọn lọc để thực PCR giải trình tự Kết quả, tạo dòng thành cơng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng có kích thƣớc 204 bp vào vector pGEM T-Easy 5.2 Đề nghị Thực nghiệm nghiên cứu độ đặc hiệu cặp mồi 3DF, 3DR Tiếp tục thực nghiên cứu khác đoạn gen 3D virus lở mồm long móng, sử dụng plasmid pGEM T-3D làm nguyên liệu nghiên cứu, nhƣ chẩn đốn virus lở mồm long móng kỹ thuật Realtime PCR, RT-PCR, nghiên cứu tạo dòng biểu protein RNA polymerase 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Dũng 2000 Bệnh lở mồm long móng Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y Tập VII, số 3, trang 8-16 Nguyễn Văn Hƣng, Nguyễn Viết Không, Trƣơng Văn Dung, Trần Văn Châu ctv 2009 Nghiên cứu phân bố lƣu hành vi-rút lở mồm long móng dun hải miền Trung Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y Tập XVI, số 3, trang 9-11 Văn Đăng Kỳ 2010 Tình hình bệnh lở mồm long móng gia súc, cơng tác phòng chống dịch thời gian qua biện pháp chủ yếu thời gian tới Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y Tập XVII, số Võ Tấn Lực 2010 Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR sử dụng evagreen định tính định lượng Porcine Circovirus type (PCV2) Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Hồng Văn Năm 2002 Tình hình dịch lở mồm long móng năm 2001 Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y Tập IX, số 4, trang 74-77 Tô Long Thành ctv 2006 Kết chẩn đoán bệnh, giám sát lƣu hành virut lựa chọn vacxin phòng chống bệnh lở mồm long móng cục thú y (19852006) Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y Tập XIII, số 3, trang 70-74 Phạm Hùng Vân 2002 PCR real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh Aslanidis, C and Jong, P.J 1990 Ligation independent cloning of PCR products (LIC-PCR) Nucleic Acid Research 18, 6069–6074 Borovkov, A Y and Rivkin, M I 1997 XcmI- containing vector for direct cloning of PCR products BioTechniques 22, 812-813 Carrillo, C 2005 Comparative Genomics of Foot-and-Mouth Disease Virus Journal of Virology 79, 6487-6504 33 Chen, X., 2003 RNA-dependent RNA polymerase gene sequence from foot-and-mouth disease virus in Hong Kong Biochemical and Biophysical Research Communications 308, 899–905 Doel, T.R 2003 FMD vaccines Virus Research 91 81-99 Guo, B and Bi, Y 2002 Cloning PCR products In PCR cloning protocol Chen, B.Y and Janes, H.W Humana Press, Totowa, New Jersey, the United State of American Grubman, M and Baxt, B 2004 Foot and Mouth Disease Clinal Microbiology Reviews 17, 465-493 Howe, C 2007 Simple cloning In Gene cloning and manipulation Cambridge University Press, New York, the United State of American Hsiao, K.C 1993 Exonuclease III induced ligase-free directional subcloning of PCR products Nucleic Acids Research 21, 5528–5529 10 Kitching, R.P., 2005 Global epidemiology and prospects for control of foot-andmouth disease Current Topics in Microbiology and Immunology 288, 133–148 11 Knowles, N.J., Samuel, A.R., Davies, P.R., Midgley, R.J., Valarcher, J.F., 2005 Pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O Emerging Infectious Diseases 11, 1887–1893 12 Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A and Collins, F.S 1990 Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products Nucleic Acids Research 19, 1154 13 Mohapatra et al, 2011 Phylogenetic structure of serotype A foot and mouth disease virus: global diversity and the Indian perspective Journal of General Virology 92, 873 – 879 14 Rashtchian, A.et al, 1992 Uracil DNA glycosylase mediated cloning of polymerase chain reaction amplified DNA: application to genomic and cDNA cloning Analyt Biochem 206, 91– 97 15 Sobrino, F., Saiz, M., et al 2001 Foot and disease virus : a long known virus, but a current threat Veterinary Research 32, 1-30 16 Zhou, M.Y., and Gomez-Sanchez, C.E 2000 Universal TA cloning Curr Issues Mol Biol 2, 1-7 Internet http://www.cfsph.iastate.edu/Products/resources/oie_list_AB_diseases_1.pdf 34 PHỤ LỤC Phụ lục : Kết giải trình tự chiều sản phẩm RT-PCR với primer 3DF Phụ lục : Kết giải trình tự chiều sản phẩm PCR plasmid với primer 3DF Phụ lục : Chủng virus LMLM đƣợc sử dụng để alignment với kết giải trình tự Mã số Genbank GQ406251.1 GQ406247.1 GQ406252.1 GQ406249.1 GU125646.1 GU125645.1 JN006719.1 HQ632774.1 AY593810.1 AY593806.1 AY593804.1 AY593809.1 GU125648.1 HM055510.1 GU125650.1 GU582115.1 GU582116.1 AY593846.1 AY593844.1 AY593842.1 HM067705.1 AY593849.1 HM067704.1 AY593850.1 AY593853.1 AY593851.1 JN936206.1 NC_010354.1 NC_003982.1 EF536003.1 AY588319.1 FJ667585.1 Virus FMDV type A FMDV type A FMDV type A FMDV type A FMDV type Asia FMDV type Asia FMDV type Asia FMDV type Asia FMDV type C FMDV type C FMDV type C FMDV type C FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type SAT1 FMDV type SAT1 FMDV type SAT1 FMDV type SAT2 FMDV type SAT2 FMDV type SAT2 FMDV type SAT3 FMDV type SAT3 FMDV type SAT3 Bovine rhinitis A virus Bovine rhinitis B virus Equine rhinitis A virus PRRSV NA PRRSV EU PCV2 – RP3 Mơ tả Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Phân lập Việt Nam, trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Phân lập PRRSV Lelystad,trình tự đầy đủ Trình tự đầy đủ Phụ lục : Kết blast kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR Độ tƣơng đồng trình tự đốivới đoạn 3D virus LMLM khoảng từ 92-99% ... infectious disease in animals In Viet Nam, between 2009 and 2010, FMD reemerged in many provinces Currently, FMD virus type A, O and Asia are circulating in Vietnamese Rapid detecting FMD is... Random amplified polymorphic DNA RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SAT South African Territories TBE Tris/Borate/EDTA UTR Unstranlated Region vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1... vector pGEM T-Easy : T7 RNA polymerase transcription initiation site Multiple cloning region 10–128 SP6 RNA polymerase promoter 139–158 SP6 RNA polymerase transcription initiation site 141 pUC/M13