Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chuẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện đang lưu hành ở Việt Nam

Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chuẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện đang lưu hành ở Việt Nam

u ch to b kit RT- chun  mi di Vit Nam Kiu M i hc  Lu ThS.   Nano sinh hc m) ng dn: n o v: 2012 Abstract.  nh l m Vi giu v Bnh l mc v bnh l m  c ca virut l m n ti ca mm bnh u kin t  lan;        u c   gen ca virus l m c gen ca virus l m t qu  c Acide ng  thut RT-n virus l mm  gen VP1; Kt qu  chng loi. Keywords.  Nano; B KIT; Virut; Bnh l m; ng vt c;  sinh hc Content M U Bnh l m     t loi bnh truyn nhim c  c k nguy hi            ng v  guc chn, bt nhanh qua nhi c tip ging vt v d ch gii (OIE) xp bnh truyn nhim nguy him hnh truyn nhim  ng vt.                                                    Hin nay vic ch nh phm thu ph kit mua ct hn ch trong vic ch chng bnh dt t a ch Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại hiện đang lưu hành ở Việt Nam  c thc hin tnghim Vi sinh vt h, Vi sinh hc, Vin Khoa h Vit Nam.  1.  QUAN   1.1 nh l m gii Vit Nam 1.1.1  gii Bt hin  nhic thu  -1985, dch xut hin  n tht ln cho nn kinh t ca nhch xy ra  l  t hi nng n v kinh t  li hu qu x  n trong nhi  c Nht B     c t  t hin b 2001 dy ra  Anh, sang vn chuy khi ngng vic s dng vaccine  c thu ng  dch nh xy ra  Italia 1993[20]; Hy Lp 1994-1996; Nga 1995.  Ngn mt  dch ti m Vi trong s 965 con ln c mc bnh, 111 con b ch Nga tip t c t  n xut vaccine. Vic c ti ca Nga. T nhng bng chng v kh  ch b dch n ra lp li, mt s c khnh t s vng cha vi d di chuyn bt hng t a Th  K  ca Th    Ti Nam My bnh LMLM trong thp k  trong kho lng tin b  v hiu qu c ng ch bnh LMLM [18]. Mng cht ph t s  t c gng trong ving bnh LMLM vi kt qu m thiu s ng  d. Tt  hu h i s p cArabia.   vic khng ch bi s t lu c tring c gng ca ng ch bnh m i kt qu             nhim nhiu chng loi virus LMLM ca h cho  [31]. Trung Qui ri Vin nh LMLM, via Vic, nh vin chuyng vn phng v dch bnh gic [62].  khu v    t s         u nhng thit hi rt ln do d [23].   d  khng ch dp Qu tr  n  nh chu dch t n xu  ch b n xut khng vt, sn phng vt c vi s ng ln. Indc b     c T ch    gi         Nhi gic bnh d c thuc quc thuc thuc c Trung Mu phi thc hin mc gia v  m dnh ca T ch gii [58]. 1.1.2 n bnh LMLM  Vit Nam 1.1.2.1 Lch s bnh n l nh lan rng ra c 3 min Bnh xut hin  c  Trong gn trn mt th k, bn t tng s 229 huyn thuc 26 t dc v n b bnh. T -2011, by ra ti 2.873 (26% trong tng s  ng s ch thuc 463 (66,7% trong tng s 694) huyn th ph ca tt c 63 t. Tng s n b bnh trong giai  1.2 Bnh L m 1.2.1 c v bnh L m Bnh L mm t tnh truyn nhim nguy him cng vc ch nguy him ca b t nhanh, rt mnh. S  do ting vt khe vng vt mc bng k c y b i dt hi v n kinh t i nhic thuc nhi l gii. Do bng dch bc s ng c ca cng. Bt hi l tht, lng nc bng ging, gim sng sa v ng v n rc t hit loi bnh nh l t vong thp ngoi tr nhng con vt non, t 2- i v-50%  n con.   sinh sn, by thai khong va, sng sa gim 50% ng sc phi tri qua nhi c tp mi s dng y s thit hi v kinh t do bnh LMLM t trm trng [32]. Khi dch bnh xu qu ng cho nn kinh t v ng  khu v bt  v  2 bng A trong danh mnh truyn nhim   1.2.2 c c ca virus LMLM 1.2.2.1 u to      i virus nh nht thuc h Picornavirideae  Aphthovirus,c 20-n 30 mu, ht virus cha 30% n RNA. V  g long nht trong vi b chng lnh LMLM.  bc, lc cu to bi m i v       i rt mn cm v   t tri, acid,  1.2.2.2 i  khoa hp l  hin ra s tn ti cnh LMLM  c gp c t c t  p t  lc thy rc ng v  ging nht gy  Pakistan,  bnh ph bin  l Lan, Trung Qu y  nh ti vinh ph miB y       bin nh  y type SAT1 t Bi chng virus thuc h Picornaviridae Aphthovirus.  c l nhau. Nhng bing chng ph m bit v n ti bn v vy phnh chm t nghii chc lo ng thi k. ng triu chng nhn dch bo h  k thun v kinh t trong vic sn xup cho tng khu vc dch. i virus ch yu d hic  bii tu bng s  1 , A 32 i ta thng nh 1 , A 32  1.2.3 Kh n ti ca mm bu kin t   bc, lt lp lipid do v  LMLM l  n cm v   mt tri, formol, acid, ki  i dung dch NaOH 0,5-t virus m  c ting ch c b tn ti t 5-m  18 0 C. Nhi l bo tn virus LMLM mt t. Trong t lt lnh xong sy  gi virus tn t i bnh tr c bing con mang t d dch mi   nh ca T ch gi d thc hich t, ni bnh LMLM phi git hy hon chuyn. 1.2.4 nh Bt bnh truyn nhim c nh vi phm vi rt ri vng vc ch ng vt mnga, la, la, gia cm c b b mm, chut lang, chut nht trng, chung, chut Hamster d cm nhia chut lang rnh ph- 24 gi quan i mn nh -72 gi thy ni mc trung, nhit hin nhiu mn  mii, li ng thn kinh vi triu cht, co git [1,2]. 1.2.5  1.2.5.1  c tip: mm bp do tic tip gi mm bm nhim qua t da p: mm bnh theo thc u  ng tip. Trong  dch, mm bnh ch y truyp, tip theo c ung, cht thi, dng c   mang mm bnh truy   th, vn chuyt sn phng vc kim dch cht ch. T   dc kh , mm bn tng s  b 1.2.5.2 Ngun bnh Ngun bnh t    n chuy ng vn phng vm bnh. Do s ting c  t  i Do vic vn chuyng vn phng vt t  Do mm bnh LMLM tn ti    d ng vm bnh truy 1.2.6 nh 1.2.6.1 Ch 1.2.6.2 Chm 1.2.6.3 c 1.2.6.4 t thanh hc 1.2.6.5 Phn ng kt hp b th 1.2.6.6 Phn  1.2.6.7 Phn ng ELISA 1.2.6.8 -PCR ng chu hi khnh li bp virus trong t   c g i th  cho kt qu ch      n chn dch b       nhy ln ch  ng cho tt c i mu bnh ph-PCR hi nh i m c  n vt liu di truyn ca virus d n ng RT- PCR s dp mc hiu. 1.2.6.9   i d    ng loi (phylogentic trees) i virus LMLM dng loi (phylogentic n thay th n thng dn huyt thanh h       ng lo         c khui bng RT-PCR t RNA cp.   i ta s d        c bi   , nh c quan h di truyn gia ngun gc t  t dch LMLM  t dy s  a virus LMLM t i lo ngi v i du [55,57]. 1.3 C gen ca virus LMLM 1.3.1  c gen ca virus LMLM t virus nh  bo bc vi gi lp v capsid T=3 icosahedral ta 1 trong 4 protein c 1D (VP1) [50]. Lp v capsid bao quanh 8.4kb, cm  gen RNA s k tt vng nh protein virus 3B (hou   gen cc dch sang mt polyprotein mng tht bi proteinases   u ph  t, ch           n. T chc h gen c vm mt c m ln duy nht (ORF) gic c ng) (m, mu cu mn ng n 380 nt (nucleotide), mt     100 nt-          n gen k     p x m 3 hoc 4 c lp l, m c cis- h    hn (cre  t type II internal a FMDV thc hi trng trong vic khi to s dc lp c gen ca virus  n hong cis- cn thit cho ving h gen mu qu [6].   hin v c d c 2 ca UTRs.     n S-  n pseudoknot, c    i mn poly A. Bc bi VPi nu N ci tr c loi tr khi b mt vi mt tp con ca RGD ph thu  th  mt t m khong 2 phn 3 c m L pro, c thc hin trung gian bt enzyme thu  vic ct b   khi dch t t qu trong vic dt ch [40]. 3Cpro, ma h trypsin ca enzyme t peptide trong protein, thc hin tt c  trong s   [59]. Trung gian 2A t  u C cm m thay th ribosomal ng hp polyprotein. M c bi c cho thy r c b i ni cht (ER)-ngun gc ci ch  gen ca  ng tng h RNA ca virus b t ca ti ng nht ca b t bi 3B, 3B mt protein cn thi ng RNA virus.  thuc vi gene 3A xut hin vng phc h 1.3.2  H gen cng 8.2kb bao g ( 3A, 3B, 3C, 3D). Nhi cu ch ra rng m  bi i c                gi   u nht (80.5- --91.7%).              VP1rc virus LMLM t vt ch thng min dch sn  bo v. S    l     2.   2.1 u 2.2 Vt liu 2.2.1 Sinh Phm 2.2.2 t 2.2.3 Trang thit b  2.3 u 2.3.1 t RNA tng s 2.3.2 t k mc hiu gen VP1 ca virus LMLM 2.3.3 i gen VP1 bng RT-PCR 2.3.4  2.3.4.1 n sn phm RT-  2.3.4.2 n np 2.3.4.3 t DNA plasmid t vi khun E. coli 2.3.4.4 . Kim tra DNA plasmid bng enzym gii hn 2.3.5 Tng h 2.3.6 ng lom di truyn  3.      3.1 c RNA tng s ca virus LMLM t mu bnh phm t nhic s d t RNA c c d t RNA ca virus LMLM t mu bnh phm.  cp   n, d b  bn cht  kh  ,  y vi chii nhiu bin tr  nhi ng u kii dng cc x  b ng nhit vt cao, kh Do mch t hu c, c bt hot virus bng  ng RNA tng s t thp.     ph cu. Mu bnh phm gm 10 mu nhn t   th t t n 10.              (3.1ng s bic n  tinh sch cu RNA,  k  hp ph   Kt qu c th hin trong (Bng 3.1): 3.1.                     /          A260/A280 N  1 / ,  1,70 36.29 2 / ,  1,79 28.17 3  1,73 17.08 4  1,71 12.33 5  1,72 16,54 6  1,75 8,24 M 1 2 3 7   1,75 11,14 8  1,70 20,10 9  1,77 9,57 10 /,    1,84 15,72 Kt qu  (Bng 3.1) cho thy,  ng s     tinh s s dng cho c  p theo. 3.2         -     3.2.1               (universal)     1    1   1           1. Theo ,                1   821bp (Ph lc 3).  -     VP1F, VP1R             -PCR (Bioneer, )            .                                       :  , taq DNA polymerase, dNTPs, buffer.   20,   1F-VP1  103 gen VP1 3 type (O, A, Asia1)   (3       )         25 .  NA                   .        : 30 42 o C,     35   (94 o C   o C - 1 , 72 o C  1 ) 1    72 o C  10 .                1% (3.1). 3.1.               1F,VP1R. M: DNA marker; 1,2,3 ng vi virus LMLM type A; virus LMLM type O; virus LMLM type Asia1. Kt qu () cho thy, sn ph  t vi c kho1       .             1  1       1 3 type virus LMLM O,   1,              . 3.2.2                       -PCR                     ,       . ,  M 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 M 1 2 3 4 5 6                             .   ,      .             (/H1N1; /H5N1, Bovine Viral Diarrhea Virus - BVDV) .                LMLM (H3.2)            . 3.2.                     -PCR M: thang DNA;   1, 2, 3:     ,   1; c   4: /H5N1; 5: /H1N1; 6: BVDV.  -                     ,   101 108 /       10      2%.             (           bromide)         100 (H3.3). 3.3.                   -PCR. : M: thang DNA; 1-10:                      . 3.2.3     ,                     .   ,                      LMLM    ,     .        LMLM                 , ELISA,  , Real-time RT-PCR,       LMLM        -         VP1         .               -                    LMLM,