TẠO DÒNG GEN ORF2 MÃ HÓA PROTEIN CAPSID CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE II (PCV2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG GEN ORF2 MÃ HÓA PROTEIN CAPSID CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE II (PCV2) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHẠM THANH HỒNG Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG GEN ORF2 MÃ HĨA PROTEIN CAPSID CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE II (PCV2) Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM THANH HỒNG KS VÕ KHÁNH HƢNG Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ, ủng hộ tinh thần luôn bên Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em học tập trường Ban chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học tất quý thầy tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học tập trường PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải KS Võ Khánh Hưng tận tình dạy bảo, hướng dẫn động viên em suốt q trình nghiên cứu thực khóa luận Các thầy cô anh chị Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thực tập tốt nghiệp Gửi lời cảm ơn đến tất bạn lớp DH08SH động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập trường thực khóa luận tốt nghiệp TP.Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Phạm Thanh Hồng i TÓM TẮT Porcine circovirus type II (PCV2) ngun nhân gây nên hội chứng còi cọc heo sau cai sữa (PMWS) Bộ gen PCV2 có khung đọc mở lớn ORF1 ORF2 Trình tự gen ORF2 chủng giới có tính tương đồng cao (96 – 100 %), đồng thời gen ORF2 mã hóa protein capsid – protein cấu trúc PCV2 Do đề tài “Tạo dòng gen mã hóa protein capsid Porcine circovirus type II (PCV2)” thực nhằm tạo sở cho nghiên cứu việc kiểm soát PCV2 cách hiệu Gen ORF2 khuếch đại kỹ thuật PCR chèn vào vector pGEM-T Easy Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α Sàng lọc thu nhận dòng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp Một số kết đạt sau: khuếch đại gen ORF2 virus PCV2, thu nhận dòng vi khuẩn E coli DH5α chứa plasmid có trình tự gen ORF2 mã hóa protein capsid PCV2 Xác định trình tự gen ORF2 PCV2 Việt Nam ii SUMMARY Thesis tilte: “Molecular cloning of ORF2 gene encoding capsid protein of Porcine circovirus type II (PCV2)” Porcine circovirus type II (PCV2) plays a crucial role in the pathogenesis of Post weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in swine The genome of PCV2 consists of two major open reading frames: ORF1 and ORF2 Sequence comparison of ORF2 gene among PCV2 isolates in the world shows a high identity (96 – 100 %), while ORF2 gene encodes capsid protein, the only structural protein of PCV2 This study was done to create the basis for further researches to control this virus effectively The ORF2 gene was amplified by PCR and inserted into pGEM-T Easy vector Then, recombinant vectors were transformed into E coli DH5α by chemical transformation Finally, the isolation of E coli DH5α clone containing the recombinant vectors was performed by using antibiotic and X-Gal selections Some achievements: the ORF2 gene of PCV2 was amplified and sequenced The E coli DH5α clone containing the recombinant vectors was obtained The sequence of ORF2 gene in Vietnam was also determined Keywords: Porcine circovirus, E coli, ORF2 gene, clone iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x Chƣơng MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hội chứng còi cọc heo sau cai sữa 2.2 Dịch tễ học hội chứng còi cọc heo sau cai sữa 2.3 Triệu chứng bệnh tích PMWS .3 2.3.1 Triệu chứng PMWS 2.3.2 Bệnh tích PMWS 2.4 Virus gây hội chứng còi cọc heo sau cai sữa PMWS 2.5 Cấu trúc gen Porcine circovirus type II 2.6 Protein vỏ capsid PCV2 .7 2.7 Một số nghiên cứu gen ORF2 PCV2 2.8 Kỹ thuật vật liệu sử dụng tạo dòng 10 2.8.1 Kỹ thuật tạo dòng 10 2.8.2 Các enzyme chủ yếu dùng kỹ thuật tạo dòng 10 2.8.2.1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction Enzyme – RE) .11 2.8.2.2 Enzyme nối .11 2.8.3 Enzyme DNA polymerase 12 2.8.4 Vector plasmid sử dụng kỹ thuật tạo dòng 12 iv 2.8.5 Vi khuẩn E coli sử dụng tạo dòng .13 2.8.6 Phương pháp biến nạp 14 2.8.6.1 Biến nạp tự nhiên 14 2.8.6.2 Phương pháp hóa biến nạp .14 2.8.6.3 Biến nạp phương pháp xung điện 15 2.8.7 Kỹ thuật PCR .15 2.8.8 Giải trình tự DNA tự động 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 16 3.2 Vật liệu hóa chất 16 3.2.1 Dụng cụ thiết bị 16 3.2.2 Hóa chất mơi trường .16 3.2.2.1 Hóa chất 16 3.2.2.3 Vật liệu sinh học .18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Khuếch đại gen ORF2 từ PCV2 chủng thực địa 19 3.3.1.1 Tách chiết DNA PCV2 chủng thực địa 19 3.3.1.2 Khuếch đại gen ORF2 phản ứng PCR .20 3.3.1.3 Phân tích giải trình tự gen ORF2 21 3.3.2 Tạo dòng gen ORF2 vào vi khuẩn E coli DH5α 21 3.3.2.1 Tinh sản phẩm PCR 21 3.3.2.2 Nối sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy 21 3.3.2.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α .22 3.3.2.4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli DH5α khả nạp 22 3.3.2.5 Chọn lọc dòng tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp 23 3.3.3 Thu nhận gen biểu đoạn 301 đến 450 ORF2 24 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết 26 4.1.1 Khuếch đại gen ORF2 từ PCV2 chủng thực địa 26 4.1.2 Phân tích kết giải trình tự .26 4.1.3 Tạo dòng gen ORF2 vào vi khuẩn E coli DH5α 28 v 4.1.4 Thu nhận gen biểu đoạn 301 đến 450 ORF2 30 4.2 Thảo luận 31 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .33 5.1 Kết luận 33 5.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .34 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ampr Gen kháng ampicilline ctv cộng tác viên dATP 3’-deoxyadenine-5’-triphosphate dCTP 3’-deoxycytosine-5’-triphosphate ddNTP Dideoxy nucleoside triphosphate dGTP 3’-deoxyguanine-5’-triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’-deoxynucleotide-5’-triphosphate dTTP 3’-deoxythyamine-5’-triphosphate E coli Escherichia coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay IFA Indirect immunofluorescence assay IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside IPMA Immunoperoxidase Monolayer Assay kb Kilobase pair kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani MCS Multiple cloning site NLS Nuclear localization signal OD Optical density ORF Open reading frame PCR Polymerase chain reaction PCV Porcine circovirus PCV1 Porcine circovirus type I PCV2 Porcine circovirus type II PDNS Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome PPV Porcine parvovirus PRV Pseudorabies virus PK-15 Pig kidney-15 vii PMWS Post-weaning-multisystemic-wasting-syndrome PRDC Porcine respiratory disease complex PRRS Porcine respiratory and reproductive syndrome RE Restriction Enzyme SOC Super Optimal broth with Catabolite repression Taq Thermus aquaticus TBE Tris borate EDTA Tm Melting temperature UV Ultraviolet viii trình tự gen ORF2 nghiên cứu hoàn toàn trùng khớp với gen ORF2 PCV2 công bố Genbank (NCBI) Gen ORF2 chủng thực địa có kích thước 702 bp Hình 4.2 Kết BLAST vùng giải trình tự NCBI Query : trình tự gen ORF2 chủng thực địa sau giải trình tự Sbjct: trình tự chủng porcine circovirus type II (EU340257.1) Genbank 27 4.1.3 Tạo dòng gen ORF2 vào vi khuẩn E coli DH5α  Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp Gen ORF2 khuếch đại kỹ thuật PCR nhờ enzyme Taq polymerase Enzyme thường gắn adenine (A) vào đầu 3’ Vector pGEM-T Easy thiết kế vector dạng thẳng gắn thêm thymine (T) hai đầu 3’ Do gen ORF2 gắn vào vector để tạo vector dạng vòng nhờ enzyme nối T4 ligase Khi gen ORF2 chèn vào vector làm gián đoạn gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase Enzyme phân giải lactose hay X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) Trên mơi trường có IPTG, chất cảm ứng operon lactose X-Gal, chất enzyme β-galactosidase, X-Gal bị β-galactosidase phân giải chuyển thành màu xanh Hình 4.3 Đĩa đối chứng E coli DH5α không mọc môi trường LB/Amp/IPTG/X-Gal Hình 4.4 Kết biến nạp vector pGEM-ORF2 vào E coli DH5α (1) E coli DH5α chứa vector tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng), (2) E coli DH5α chứa vector tự đóng vòng (khuẩn lạc màu xanh) Kết thu nhận đĩa nuôi cấy sau: Một số khuẩn lạc E coli sau biến nạp nuôi cấy môi trường chọn lọc LB/Amp/IPTG/X-Gal xuất hai loại khuẩn lạc xanh trắng Khuẩn lạc màu xanh chứa vector pGEM-T Easy tự đóng vòng, khuẩn lạc màu trắng chứa vector có mang gen chèn Điều cho thấy trình chèn biến nạp vector tái tổ hợp thành công 28 Sàng lọc tế bào mang vector tái tổ hợp pGEM T-Easy-ORF2 kỹ thuật PCR khuẩn lạc Để khẳng định dòng khuẩn lạc màu trắng có chứa vector tái tổ hợp, kiểm tra kỹ thuật PCR khuẩn lạc với cặp mồi ORF2 CF ORF2 CR, thực đồng thời với đối chứng âm nước Sản phẩm PCR khuẩn lạc cho kích thước khoảng 702 bp Kết có dòng vi khuẩn cho kết dương tính dòng vi khuẩn kiểm tra Điều cho thấy có diện gen ORF2 2/5 dòng vi khuẩn sàng lọc Hình 4.5 Kết qủa điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc Giếng 1: thang DNA 100 bp, giếng – 6: mẫu, giếng 7: đối chứng (-) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy kỹ thuật PCR Do kỹ thuật PCR phương pháp nhạy, nhằm khẳng định chắn đoạn gen ORF2 khuếch đại nằm vector, khơng phải sản phẩm sót lại q trình chèn gen Tiến hành ly trích plasmid, kiểm tra kỹ thuật PCR với cặp mồi khuếch đại ORF2 CF ORF2 CR Kết điện di cho thấy có băng sản phẩm PCR kích thước khoảng 702 bp Như vậy, quy trình biến nạp tạo dòng gen ORF2 vào tế bào E coli DH5α thành cơng 29 Hình 4.6 Kết sản phẩm PCR khuếch đại gen ORF2 pGEM-T Easy–ORF2 Giếng 1: DNA ladder 1kb, giếng 2: mẫu 4.1.4 Thu nhận gen biểu đoạn 301 đến 450 ORF2 Protein capsid protein cấu trúc virus PCV2, có tính kháng nguyên mạnh protein kích thích hình thành kháng thể trung hòa có huyết Gen ORF2 mã hóa cho tồn protein capsid Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, protein capsid biểu thấp tế bào prokaryote khác biệt codon dùng (Kong ctv, 2011), đồng thời vùng N-terminal gen ORF2 chứa nhiều codon (Liu ctv, 2001) Do nhiều nghiên cứu biểu protein capsid tế bào prokaryote, nhằm tăng biểu protein dung hợp biểu đoạn polypeptide ngắn Những đoạn polypeptide chứng minh có tính kháng ngun mạnh, thử nghiệm xét nghiệm miễn dịch ELISA Theo nghiên cứu Huang ctv, 2007 biểu nhiều chuỗi polypeptide khác bao gồm chuỗi amino acid – 50, 51 – 100, 101 – 150, 151 – 200, 185 – 233, 51 – 233 Trong chuỗi polypeptide 101 – 150 chứng minh có độ nhạy độ đặc hiệu cao chứng minh thí nghiệm ELISA gián tiếp Cặp mồi Cap F101 Cap R150 đề tài thiết kế nhằm khuếch đại gen từ 301 đến 450 với trình tự enzyme cắt hai đầu BamHI XhoI Mục đích tạo trình tự enzyme cắt giới hạn hai đầu sản phẩm khuếch đại thuận tiện cho việc nối 30 vào vector biểu Tuy nhiên, sản phẩm PCR thu lại có kích thước 400 bp, khơng kích thước mong đợi (166 bp) 1000 bp 500 bp 400 bp Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR dùng biểu Giếng 1: DNA ladder 100bp, giếng 2: mẫu, giếng 3: đối chứng (-) 4.2 Thảo luận Nghiên cứu thành công việc tạo dòng gen ORF2 PCV2 chủng thực địa vào tế bào E coli Từ mẫu hạch heo nghi ngờ mắc hội chứng PMWS thực địa, tiến hành phản ứng PCR khuếch đại toàn gen ORF2 Kết giải trình tự sản phẩm PCR cho thấy, kích thước gen ORF2 chủng thực địa 702 bp, BLAST kết giải trình tự với trình tự gen ORF2 PCV2 chủng phân lập giới có GenBank (NCBI) cho độ tương đồng 99 – 100 % Điều trùng khớp với nghiên cứu trước Larochelle ctv, 2002; Kamstrup ctv, 2004: trình tự ORF2 có tính bảo tồn cao chủng phân lập nhiều nơi giới Phương pháp cloning TA vào vector pGEM-T Easy sử dụng, phương pháp có ưu điểm nhanh, hiệu quả, dễ dàng chọn lọc (có hai marker chọn lọc: gen kháng kháng sinh ampicilline, gen lac Z) Kết biến nạp hình 4.4 cho thấy xuất hai loại khuẩn lạc xanh trắng, quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli thành công Khi kiểm tra năm khuẩn lạc trắng kỹ thuật PCR với cặp mồi ORF2 CF ORF2 CR, có 2/5 khuẩn lạc cho kết dương tính Điều lý giải sau: dòng vi khuẩn E coli nhận vector, nhiên vector pGEM, lý dó vector khơng tự đóng vòng, gen lacZ mã 31 hóa enzyme β-galactosidase bị gián đoạn nên enzyme khơng tổng hợp, khuẩn lạc có màu trắng Khi nghiên cứu khuếch đại gen ORF2 đoạn 301 đến 450 mã hóa protein capsid PCV2, sản phẩm PCR thu nhận khoảng 400 bp, theo kết dự kiến, độ dài sản phẩm primer khuếch đại phải 166 bp Đề tài thực thí nghiệm để khắc phục số nguyên nhân dẫn đến kết sản phẩm PCR khơng kích thước Tuy nhiên kết thu nhận qua thí nghiệm khơng thay đổi: kích thước sản phẩm PCR ln vào khoảng 400 bp Các thí nghiệm thực nhằm loại trừ số nguyên nhân hay gặp phải sau: - Nhầm khn mẫu: lặp lại thí nghiệm phản ứng PCR với cặp mồi biểu Kiểm tra lại khuôn mẫu plasmid tái tổ hợp sử dụng - Tạp nhiễm DNA ngoại lai: thực phản ứng PCR với đối chứng âm nước Đối chứng âm cho kết âm tính - Kiểm tra độ đặc hiệu primer: thay đổi quy trình nhiệt (tăng nhiệt độ bắt cặp, giảm thời gian kéo dài) - Trình tự primer thiết kế kiểm tra chương trình BLAST NCBI, primer bắt cặp đặc hiệu vị trí ORF2 (301 – 316, 436 – 450), không bắt cặp pGEM-T Easy Qua kết thí nghiệm, nguyên nhân loại trừ Do đó, nguyên nhân nghi ngờ chuỗi dNTPs primer bị sai, trình tổng hợp primer cơng ty bị lỗi (tổng hợp primer sai, nhầm primer) Vì vậy, thí nghiệm q trình tạo dòng biểu khơng thực tiếp Để tiếp tục nghiên cứu tạo dòng biểu hiện, nên đặt lại primer khuếch đại đoạn gen biểu 32 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Thu nhận thành công gen ORF2 PCV2 phân lập thực địa kỹ thuật PCR với cặp mồi ORF2 CF ORF2 CR Kết phân tích trình tự cho thấy đoạn ORF2 chủng thực địa có độ tương đồng cao (99 %) so với chủng phân lập giới Tạo dòng vi khuẩn E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM-T Easy ORF2 5.2 Đề nghị Kiểm tra lại primer khuếch đại gen mã hóa chuỗi polypeptide (từ amino acid 101 đến 150) Tiếp tục thí nghiệm tạo vector biểu gen mã hóa protein capsid PCV2 tế bào E coli BL21 Cảm ứng biểu hiện, tinh protein capsid thu nhận từ tế bào E coli BL21 Kiểm tra tính kháng nguyên protein capsid thu nhận kỹ thuật ELISA gián tiếp 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dương 1997 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục, Thành phố Hồ Chí Minh Trịnh Đình Đạt 2007 Công nghệ sinh học - Tập bốn - Công nghệ di truyền Nhà xuất giáo dục Glick B.R Pasternak J.J 2007 Công nghệ sinh học phân tử - nguyên lý ứng dụng AND tái tổ hợp NXB Khoa học Kỹ thuật Lê Đình Lương Quyền Đình Thi 2004 Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y, NXB Nơng Nghiệp, TP Hồ Chí Minh Phạm Thị Huyền Trang, 2010, Khảo sát nhiễm PCV2 loại mẫu: huyết thanh, hạch phân từ heo còi kỹ thuật PCR, khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học trường Đại học Nơng Lâm, TPHCM  Tiếng nƣớc ngồi Allan G.M., McNeilly F., Cassidy J.P., Reilly G.A.C., Adair B., and Ellis W.A 1995 Pathogenesis of porcine circovirus: experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material Veterinary Microbiology 44: 49–64 Allan G.M., McNeilly F., Kennedy S., Daft B., Clarke E.G., Ellis J.A., Haines D.M., Meehan B.M., and Adair B.M 1998 Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 10: 3–10 10 Allan G.M., Meehan B., Todd D., Kennedy S., McNeilly F., Ellis J., Clark E.G., Harding J., Espuna E., Botner A., and Charreyre C 1998 Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes Veterinary Record 142: 467–468 11 Benjamin R Trible, and Raymond R.R 2011 Genetic variation of porcine circovirus type (PCV2) and its relevance to vaccination, pathogenesis and diagnosis Virus Research 164: 68 – 77 34 12 Blanchard P., Mahe D., Cariolet R., Truong C., Le Dimna M., Arnauld C., Rose N., Eveno E., Albina E., Madec F., and Jestin A 2003 An ORF2 protein-based ELISA for porcine circovirus type antibodies in post-weaning multisystemic wasting syndrome Veterinary Microbiology 94: 183–194 13 Blanchard P., Mahe D., Cariolet R., Keranflec’h A., Baudouard M.A., and Cordioli P 2003 Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by porcine circovirus type (PCV2) proteins Vaccine 21: 4565–4575 14 Cao S., Chen H., Zhao J., Lu J., Xiao S., Jin M., Guo A.,Wu B., and He Q 2005 Detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus and porcine pseudorabies virus from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome by multiplex PCR Veterinary Research Communications 29: 263–269 15 Chae C 2004 Postweaning multisystemic wasting syndrome: A review of aetiology, diagnosis and pathology Veterinary Journal 168: 41–49 16 Christopher Howe 2007 Gene cloning and Manipulation University of Cambridge 17 Clark E.G Post-weaning multisystemic wasting syndrome 1997 Proc Am Assoc Swine Pract 28: 499-501 18 Ellis J., Hassard L., Clark E., Harding J., Allan G., Willson P., Strokappe J., Martin K., McNeilly F., Meehan B., Todd D and Haines D 1998 Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Canadian Veterinary Journal 39: 44 – 51 19 Ellis J., Clark E., Haines D., West K., Krakowka S., Kennedy S., and Allan G.M 2004 Porcine circovirus-2 and concurrent infections in the field Veterinary Microbiology 98: 159–163 20 Guo Long J., Lu Yue H., Wei Yan W., Huang Li P., and Liu C.M 2010 Porcine circovirus type 2: genetic variation and newly emerging genotypes in China Journal Virology 7: 273 21 Gresham A., Giles N., and Weaver J PMWS and porcine dermatitis nephropathy syndrome in Great Britain Veterinary Record 147: 115, 2000 22 Hamel A.L., Lin L.L., and Nayar G.P 1998 Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs Journal of Virology 72: 5262–5267 23 Harding J.C., and Clark E.G 1997 Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) Journal of Swine Health and Production 5: 201-203 35 24 Jin M., Song Y., Zhang S., Xu X., Xiao S., Cao S., and Chen H 2007 Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine circovirus type Veterinary Microbiology 119: 97 – 104 25 Kamstrup S., Barfoed A.M., Frimann T.H., Ladekjar-Mikkelsen A.S., and Botner A 2004 Immunization against PCV2structural protein byDNAvaccination of mice Vaccine 22: 1358–1361 26 Khayat R., Nicholas Brunn, Jeffrey A Speir, John M Hardham, Robert G Ankenbauer, Anette Schneemann, and Johnson J.E 2011 The 2.3-Angstrom Structure of Porcine Circovirus Journal of Virology 85: 7856 – 7862 27 Larochelle R., Magar R., and D’Allaire S 2002 Genetic characterization and phylogenetic analysis of porcine circovirus type (PCV2) strains from cases presenting various clinical conditions Virus Research 90: 101–112 28 Liu C., Ihara T., Nunoya T., and Ueda S 2004 Development of an ELISA based on the baculovirus-expressed capsid protein of porcine circovirus type as antigen Journal of Veterinary Medical Science 66: 237–242 29 Liu J., Chen I., and Kwang J 2005 Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus Type 2-Infected cells and Its role in virusinduced apoptosis Journal of Virology 79: 8262-8274 30 Lukert P., de Boer G.F., Dale J.L., Keese P., McNulty M.S., Randles J.W., and Tischer I 1995 The Circoviridae Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses Virus Taxonomy: 166 – 168 31 Mahe D., Blanchard P., Truong C., Arnauld C., Le Cann P., Cariolet R., Madec F., Albina E., and Jestin A 2000 Differential recognition of ORF2 protein from type and type porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes Journal of General Virology 81: 1815–1824 32 Mankertz A., Mankertz J., Wolff H., and Buhk K 1998 Identification of protein essential for replication of porcine circovirus Journal of General Virology 79: 381-384 33 Meehan B.M., McNeilly F., Todd D., Kennedy S., Jewhurst V.A., Ellis J.A., Hassard L.E., Clark E.G., Haines D.M and Allan G.M 1998 Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs Journal of General Virology 79: 2171 – 2179 34 Morozov I., Sirinarumitr T., Sorden S.D., Halbur P.G., Morgan M.K., Yoon K., and Paul P S 1998 Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Journal of Clinical Microbiology 36: 2535–2541 36 35 Nawagitgul P., Morozov I., Bolin S.R., Harms P.A., Sorden S.D., and Paul P.S 2000 Open reading frame of porcine circovirus type encodes a major capsid protein Journal of General Virology 81: 2281–2287 36 Nawagitgul P., Harms P.A., Morozov I., Thacker B.J., Sorden S.D., Lekcharoensuk C., and Paul P.S 2002 Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based enzymelinked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9: 33–40 37 Wu P.C., Chien M.S., Tseng Y.Y., Jiarong Lin, Lin W.L., Yang C.Y., and Chienjin H 2008 Expression of the porcine circovirus type capsid protein subunits and application to an indirect ELISA Journal of Biotechnology 133: 58 – 64 38 Lekcharoensuk P., Morozov I., Paul P.S., Thangthumniyom N., Wajjawalku W., and Meng X J 2004 Epitope Mapping of the Major Capsid Protein of Type Porcine Circovirus (PCV2) by Using Chimeric PCV1 and PCV2 Journal of Virology 78: 8135 – 8145 39 Shang S.B., Li Y.F., Guo J.Q., Wang Z.T., Chen Q.X., Shen H.G., and Zhou J.Y 2008 Development and validation of a recombinant capsid protein-based ELISA for detection of antibody to porcine circovirus type Research in Veterinary Science 84: 150 – 157 40 Tischer I., Gelderblom H., Vettermann W., and Koch M.A 1982 A very small porcine virus with circular single-stranded DNA Nature 295: 64 – 66 41 Tischer I., Mields W., Wolff D., Vagt M., and Griem W 1986 Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus Archives of Virology 91: 271–276 42 Lin W.L., Chien M.S., Wu P.C., Lai C.L., and Chienjin H 2011 The Porcine Circovirus Type Nonstructural Protein ORF3 Induces Apoptosis in Porcine Peripheral Blood Mononuclear Cells The Open Virology Journal 5: 148 – 153 Tài liệu từ Internet 43 http://www.sciencedirect.com 44 http://www Octagon-services.co.uk/articles/PMWSvaccine (05/07/2012) 45 http://www.viralzone.expasy.org/all_by_species/118 (25/06/2012) 46 http://www.virology.com/content/6/1/60 (25/06/2012) 37 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết giải trình tự gen ORF2 >ORF2 ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTGCCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCC GCCACCGTTACCGGTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTA TCCCGCACCTTGGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCC TGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGA GGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAA GGTTAAGGTCGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGG AGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAC AGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAAC CCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGAT TCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAACCAGCTG-TGGCTGAG-ACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAG GCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCGGGAATACAATATC CGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCA CTTAAACCCTAA Phụ lục Hình ảnh so sánh kết giải trình tự NCBI Phụ lục Hình ảnh so sánh với trình tự EF371259.1 NCBI Phụ lục 4: Hình ảnh so sánh với trình tự DQ629135.1 NCBI ... PORCINE CIRCOVIRUS TYPE II (PCV2) Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM THANH HỒNG KS VÕ KHÁNH HƢNG Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cha... đỡ suốt thời gian học tập trường thực khóa luận tốt nghiệp TP.Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Phạm Thanh Hồng i TÓM TẮT Porcine circovirus type II (PCV2) nguyên nhân gây nên hội chứng còi cọc heo