Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá

Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cúm gà (avian influenza) bệnh truyền nhiễm cấp tính lồi chim, kể gia cầm thuỷ cầm, subtype khác thuộc nhóm virus cúm A gây nên Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên số lồi chim mang virus gây bệnh, khơng có biểu bệnh Đây mối nguy hiểm lan truyền bệnh cho loài gia cầm khác Ngoài ra, chúng nơi cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên subtype Các subtype virus cúm A gây bệnh người có nguồn gốc tiến hoá biến thể biến chủng từ động vật sau thích ứng người gây bệnh, trước tạo nên vụ dịch thảm khốc, biến sau thời gian lại tái gây nên đại dịch Năm 2004 đại dịch cúm gia cầm nước châu Á (bao gồm dịch H5N1 gây Trung Quốc, Nhật, Nam Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia Lào; H7N3 (Pakistan); H5N2 ( Đài Loan) gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm chết hàng chục người Việt Nam Thái Lan Chủng H5N1 điển hình châu Á có tính kháng nguyên di truyền giống với chủng A/Vietnam/1203/04 Để phòng chống lây lan mạnh mẽ đại dịch cúm gia cầm, hàng năm Việt Nam cần lượng vaccine lớn để tiêm chủng cho hàng trăm triệu gà vịt Ngồi cơng nghệ sẵn có Việt Nam tìm kiếm cơng nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an tồn hiệu cao Vaccine ăn có nguồn gốc từ thực vật nguồn vaccine đáp ứng tiêu điểm đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y xem hướng phù hợp với nước phát triển mục đích chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Việt Nam Chuyển gen mã hóa vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể vào trồng nguồn thức ăn cho người, động vật ni hướng Tuy nhiên bên cạnh đó, xu hướng bắt đầu quan tâm nghiên cứu ứng dụng sử dụng hệ thống nuôi cấy sinh khối tế bào để sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp Do tế bào thực vật có ưu ni cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất lượng sinh khối lớn khoảng thời gian ngắn quan trọng tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang mầm bệnh cho người Với mục đích tạo sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1, vào điều kiện phịng thí nghiệm cho phép với phương pháp khả thi, lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt virus H5N1 bước đầu chuyển gen HA1 tạo dòng rễ tơ chuyển gen thuốc lá” Mục tiêu đề tài - Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ virus H5N1 - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào thuốc tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens Nội dung nghiên cứu - Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp - Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ virus H5N1 - Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ virus H5N1 biến nạp vào vi khuẩn A rhizogens - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào thuốc tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cúm A/H5N1 1.1.1 Cấu tạo Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) bệnh truyền nhiễm cấp tính gia cầm, nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây Đây nhóm virus có biên độ chủ rộng, phân chia thành nhiều phân type khác dựa kháng nguyên HA NA có bề mặt vỏ hạt virus Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đơi có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dal Phân tích thành phần hóa học virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% protein; 20 - 24% lipid - 8% carbonhydrate Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc (envelope) lõi RNA sợi đơn âm - negative single strand (Hình 1) Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mơ hình (B), phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) virus cúm A Ghi chú: A: Các dạng hình thái khác virus cúm A kính hiển vi điện tử; B: Mơ hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba đơn vị phức hợp enzyme polymerase virus) C: Cấu trúc phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge) Vỏ virus có chức bao bọc bảo vệ vật chất di truyền RNA virus, chất cấu tạo màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đặc hiệu hóa gắn protein màng virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô phân bố dày đặc, gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính - nm, kháng nguyên bề mặt vỏ virus, chất cấu tạo glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) dấu ấn khác virus , Có phân bố khơng đồng phân tử NA HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), hai loại protein kháng nguyên có vai trị quan trọng q trình xâm nhiễm virus tế bào cảm nhiễm , Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) phân type NA (từ N1 đến N9), tái tổ hợp (reassortment) phân type HA NA, mặt lý thuyết, tạo nhiều phân type khác độc tính khả gây bệnh Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng dễ dàng đột biến gen/hệ gen (đặc biệt gen NA HA), trao đổi gen kháng nguyên với nhau, trình xâm nhiễm tồn lây truyền loài vật chủ Các subtype gây nhiễm cho phần lớn lồi sinh vật bao gồm lồi lơng vũ (gà, chim thuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi loài người Trên sở trình tự gen xếp gen hệ gen, virus cúm A có phân đoạn (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 PB2) nối với thành sợi bên vỏ virus, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide, mã 11 protein tương ứng virus (hình 2) hóa cho Hình 1.2 Cấu trúc gen (hình trái) gồm gen đoạn RNA sợi đơn âm (-ssRNA) mơ hình (hình phải) thể virus cúm H5N1 gồm protein đoạn –ssRNA (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge) 1.1.2 Độc lực tính thích ứng vật chủ Độc lực gây bệnh virus cúm A Tính gây bệnh hay độc lực virus cúm A chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), hai loại tồn tự nhiên - HPAI: loại virus cúm A có khả gây tổn thương nhiều quan nội tạng thể nhiễm, gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm vòng 48h sau nhiễm Loại nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng Virus loại HPAI phát triển tốt tế bào phôi gà tế bào thận chó mơi trường ni cấy khơng có trypsin , - LPAI: loại virus phát triển thể nhiễm, gây bệnh cúm nhẹ khơng có triệu chứng lâm sàng điển hình không làm chết vật chủ Đây loại virus lây truyền rộng rãi tạo nên ổ bệnh tự nhiên virus cúm A, loại trao đổi gen với chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm tế bào, trở thành loại virus HPAI nguy hiểm , Tính thích ứng đa vật chủ virus cúm A/H5N1 Vật chủ tự nhiên tất chủng virus cúm A/H5N1 chim hoang dã (chủ yếu vịt trời), nguyên nhân lan truyền virus tự nhiên khó kiểm sốt Virus cúm A có khả gia tăng biên độ vật chủ chúng trình lây truyền tự nhiên Hình 1.3 Mối quan hệ lây nhiễm thích ứng lồi vật chủ virus cúm A (Nguồn: http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194) Nhờ đặc tính ln thay đổi kháng ngun tự nhiên, virus cúm A có khả xâm nhiễm nhiều lồi vật chủ trung gian khác gia cầm, số lồi động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” gà - gà, hay “ngoại loài” gà - lợn; gà - lợn - người Vịt (vịt trời) số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm , , Đặc điểm thích ứng vật chủ điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp phân đoạn gen, đặc biệt phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA NA) chủng, tạo chủng virus cúm có khả thích ứng xâm nhiễm loài vật chủ chúng đặc biệt chúng vượt qua “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người người với người , , 1.1.3 Khả gây bệnh virus cúm A/H5N1 Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu đường hơ hấp, tác động gây tổn thương nhiều quan khác thể động vật cảm nhiễm, cịn gọi virus hướng đa phủ tạng Khả gây bệnh virus cúm A phụ thuộc vào độc lực tính thích nghi vật chủ chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh gây bệnh nhẹ giới hạn đường hô hấp chim hoang dã gia cầm nhiễm, số chủng cường độc (H5, H7, H1, H2, H3) gây bệnh nặng hầu hết quan thể, gây nên dịch cúm gia cầm người, có lẽ tính thích ứng thụ thể sialic chúng , Hầu hết chủng virus cúm A nhân lên tốt phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, nhiên chủng cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà sau vài giờ, hàm lượng virus thấp chưa nhân lên nhiều, gây bệnh cúm thực nghiệm chuột lang, chuột Hamster, chồn đất , Sau bị nhiễm virus cúm A, thể vật chủ sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus bảo vệ thể, đáp ứng miễn dịch khơng có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho lần nhiễm sau, virus cúm A ln có biến đổi kháng ngun q trình lưu hành tự nhiên, khơng có đáp ứng miễn dịch chéo chủng virus cúm A Do đó, xuất biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng ngun khác với chủng virus trước đó, thể nhiễm khơng có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm Đây nguyên nhân làm cho gia cầm người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần năm, đợt dịch cúm xảy sau thường nặng nề gây nên đại dịch cúm Khả gây bệnh biến chủng virus cúm giảm biến mất, thể có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với biến chủng chúng trở nên thích nghi lây nhiễm lồi vật chủ , ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 nguyên nhân đại dịch cúm người trước thích nghi lây nhiễm người Tuy nhiên, chủng thường gây vụ dịch cúm tản phát hàng năm người, khả biến đổi kháng nguyên chúng Đây nguồn virus trao đổi gen với chủng virus cúm lưu hành gia cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều lồi khác người , , , 1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, trình xâm nhiễm nhân lên virus xảy chủ yếu tế bào biểu mơ đường hơ hấp, đường tiêu hóa thể nhiễm [49], Quá trình xâm nhiễm virus cúm A mở đầu kết hợp HA thụ thể thích ứng bề mặt tế bào này, cuối giải phóng hệ gen virus vào bào tương tế bào nhiễm Quá trình nhân lên RNA virus cúm A xảy nhân tế bào, đặc điểm khác biệt so với virus khác (quá trình xảy nguyên sinh chất), cuối giải phóng hạt virus khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò enzyme neuraminidase Thời gian chu trình xâm nhiễm giải phóng hạt virus virus cúm khoảng vài Sự tạo thành hạt virus không phá tan tế bào nhiễm, tế bào bị rối loạn hệ thống tổng hợp đại phân tử, rơi vào trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô thể vật chủ , Sau giải phóng vào bào tương tế bào nhiễm, hệ gen virus sử dụng máy sinh học tế bào tổng hợp protein virus RNA vận chuyển Phức hợp protein – RNA virus vận chuyển vào nhân tế bào Trong nhân tế bào RNA hệ gen virus tổng hợp nên sợi dương từ khuôn sợi âm hệ gen virus, từ sợi dương chúng tổng hợp nên RNA hệ gen virus nhờ RNA-polymerase Các sợi không Adenine hóa (gắn thêm Adenine - gắn mũ) đầu 5’và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh vận chuyển bào tương tế bào Đồng thời, RNA thông tin virus chép nhờ hệ thống enzyme phân đoạn gen virus, enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin đầu 5’, sau vận chuyển bào tương dịch mã lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên protein virus Các phân tử NA HA virus sau tổng hợp vận chuyển gắn lên mặt màng tế bào nhiễm nhờ máy Golgi, gọi tượng “nảy chồi” virus NP sau tổng hợp vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP virus Sau RNP virus hợp với vùng “nảy chồi”, tạo thành “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ liên kết HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt liên kết giải phóng hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm tế bào khác , Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A/H5N1 tế bào chủ (Nguồn: http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194) 1.2 Kháng nguyên HA Hemagglutinin hay Haemagglutinin glycoprotein kháng nguyên tìm thấy bề mặt virus cúm nhiều vi khuẩn virus khác Nó có tác dụng gắn virus vào tế bào bị nhiễm Tên gọi HA bắt nguồn từ việc protein HA có khả ngưng kết hồng cầu (hem: bao vây) 16 loại kháng nguyên HA khác đánh dấu từ đến 16 H16 phát virus phân lập từ mòng biển đầu đen Thuỵ Điển Na Uy năm 2005 [15] Ba loại protein HA (H1, H2 H3) tìm thấy phổ biến virus cúm người Cấu trúc: 10 38 Hulse-Post, D., K Sturm-Ramirez, J Humberd, P Seiler, E Govorkova, S Krauss, C Scholtissek, P Puthavathana, C Buranathai, T Nguyen, H Long, T Naipospos, H Chen, T Ellis, Y Guan, J Peiris (2005), Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia Proc Natl Acad Sci USA, 102(30): p 10682-10687 39 Jin, U.H., J.A Chun, J.W Lee, Y Young Byung, S.W Lee, and C.H Chung (2004), Expression and characterization of extracellular fungal phytase in transformed sesame hairy root cultures Protein Expr Purif, 37(2): p 486-92 40 Keawcharoen, J., A Amonsin, K Oraveerakul, S Wattanodorn, T Papravasit, S Karnda, K Lekakul, R Pattanarangsan, S Noppornpanth, R Fouchier, A Osterhaus, S Payungporn, A Theamboonlers, and Y Poovorawan (2005), Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand Acta Virol, 49(4): p 277-280 41 Kelly, T.R., M.G Hawkins, C.E Sandrock, and W.M Boyce (2008), A review of highly pathogenic avian influenza in birds, with an emphasis on Asian H5N1 and recommendations for prevention and control J Avian Med Surg, 22(1): p 1-16 42 Kodihalli, S., H Goto, D Kobasa, S Krauss, Y Kawaoka, and R Webster (1999), DNA vaccine encoding hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice J Virol, 73: p 2094-2098 61 43 Krug, R M, W Yuan, D.L Noah, and A.G Latham (2003), Intracellular warfare between human influenza viruses and human cells: the roles of the viral NS1 protein Virology, 309: p 181 – 189 44 Le, Q., M Kiso, K Someya, Y Sakai, T Nguyen, K Nguyen, N Pham, H Nguyen, S Yamada, Y Muramoto, T Horimoto, A Takada, H Goto, T Suzuki, Y Suzuki, and Y Kawaoka (2005), Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus Nature, 437(7062): p 1108 45 Li, K., Y Guan, J Wang, G Smith, K Xu, and L Duan (2004), Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia Nature, 430: p 209-213 46 Luong, G and P Palese (1992), Genetic analysis of influenza virus Curr Opinion Gen Develop, 2: p 77-81 47 Medina-Bolivar, F., R Wright, V Funk, D Sentz, L Barroso, T.D Wilkins, W Petri, Jr., and C.L Cramer (2003), A non-toxic lectin for antigen delivery of plant-based mucosal vaccines Vaccine, 21(9-10): p 997-1005 48 Munster, V.J., C Baas, P Lexmond, T.M Bestebroer, J Guldemeester, W.E Beyer, E de Wit, M Schutten, G.F Rimmelzwaan, A.D Osterhaus, and R.A Fouchier (2009), Practical considerations for highthroughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests J Clin Microbiol, 47(3): p 666-73 49 Murphy, B and R Webster (1996), Orthomyxoviruses LippincottRaven Publishers, p 1397-1445 50 Nayak, D., E Hui, and S Barman (2004), Assembly and budding of influenza virus Virus Res, 106(2): p 147-165 62 51 Neumann, G, M.A Whitt, and Y Kawaoka (2002), A decade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA – What have we learned Journal of General Virology, 83: p 2635 – 62 52 Neumann, G and Y Kawaoka (1999), Genetic engineering of influenza and other negative-strand RNA viruses containing segmented genomes Advances in Virus Research, 53: p 265 – 300 53 Nicholson, K., J Wood, and M Zambon (2003), Influenza Lancet, 362: p 1733-1745 54 Palazón, J., and e al (1997), Effect of rol genes from Agrobacterium rhizogenes TL-DNA on nicotine production in tobacco root cultures Plant Physiol Biochem, 35: p 155-62 55 Pham NB (2009), Production and secretion of recombinant sweettasting thaumatin from suspension cells and hairy roots of Nicotiana tabacum University of Heidelberg, PhD Thesis 56 Sevon, N and K.M Oksman-Caldentey (2002), Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids Planta Med, 68(10): p 859-68 57 Subbarao, K and C Luke (2007), H5N1 viruses and vaccines PLoS Pathog, 3(3): p e40 58 Suzuki, Y (2005)., Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses Biol Pharm Bull, 28(3): p 399-408 59 Tian, G., S Zhang, Y Li, Z Bu, P Liu, J Zhou, C Li, J Shi, K Yu, and H Chen (2005), Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics Virology, 341(1)(153-162) 63 60 Uiprasertkul, M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N Vanprapar, and P Auewarakul (2007), Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans Emerg Infect Dis, 13(5): p 708-712 61 Urnovitz, H.B and W.H Murphy (1996), Human endogenous retroviruses: nature, occurrence, and clinical implications in human disease Clin Microbiol Rev, 9(1): p 72-99 62 Wagner, R., M Matrosovich, and H Klenk (2002), Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections Med Virol, 12(3): p 159-166 63 Wagner, R., M Matrosovich, and H.D Klenk (2002), Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections Rev Med Virol, 12(3): p 159-66 64 Weber, T and N Stilianakis (2007), Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds Emerg Infect Dis, 13(8): p 11391143 65 Webster, R.G (1998), Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis, 4(3): p 436-41 66 Webster, R.G., Y Guan, M Peiris, D Walker, S Krauss, N.N Zhou, E.A Govorkova, T.M Ellis, K.C Dyrting, T Sit, D.R Perez, and K.F Shortridge (2002), Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China J Virol, 76: p 118126 67 Weiss, R.A (2003), Cross-species infections Curr Top Microbiol Immunol, 278: p 47-71 64 68 Wongsamuth, R., and P.M Doran (1997), Production of monoclonal antibodies by tobacco hairy roots Biotechnol Bioeng, 54(5): p 401415 69 Wongsamuth, R and P Doran (1997), Production of monoclonal antibodies by tobacco hairy roots Biotechnol Bioeng, 54(5): p 401415 70 Wu, W., Y Chen, P Wang, W Song, S Lau, J Rayner, G Smith, R Webster, J Peiris, T Lin, N Xia, Y Guan, and H Chen (2008), Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007 J Virol, 282(4): p 1798-17807 71 Yamada, S., Y Suzuki, T Suzuki, M Le, C Nidom, Y Sakai-Tagawa, Y Muramoto, M Ito, M Kiso, T Horimoto, KShinya, T Sawada, M Kiso, T Usui, T Murata, Y Lin, A Hay, L Haire, D Stevens, R Russell, S Gamblin, J Skehel, and Y Kawaoka (2006), Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors Nature, 444(7117): p 378-382 72 Zhao, Z., K Shortridge, M.G M, Y Guan, and X Wan (2008), Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses J Gen Virol, 89(9): p 2182-2193 73 Zhou, H., M Jin, Z Yu, X Xu, Y Peng, H Wu, J Liu, H Liu, S Cao, and H Chen (2007), Effective small interfering RNAs targeting matrix and nucleocapsid protein gene inhibit influenza A virus replication in cells and mice Antiviral Res, 76(2): p 186-93 65 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần loại môi trường Môi trường YMP đặc YMP lỏng LB đặc LB lỏng WPM đặc WPM lỏng MS đặc MS lỏng ½ MS Thành phần 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl, pH = g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl, pH = WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường + g thạch, pH = 5,8 WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường + g thạch, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường, pH = 5,8 10 ml/L MS I + ml/L MS II + ml/L MS III + ml/L MS IV + ml/L MS V, pH = 5,8 Phụ lục 2: Sơ đồ vector chuyển gen dùng thí nghiệm - Cấu trúc vector pENTR 221/cal 66 - Cấu trúc vector pK7WG2D(1) - Cấu trúc vector pPTN289, nằm chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA101 67 Phụ lục Trình tự gen HAop HA1 a Trình tự gen HAop (pCU18/HA1) BssHII AscI BamHI BclI GGCGCGCCGGATCCGAAAAGATTGTGCTTTTGCTTGCTATTGTGTCTCTTGTGAAGTCTG -+ -+ -+ -+ -+ -+ CCGCGCGGCCTAGGCTTTTCTAACACGAAAACGAACGATAACACAGAGAACACTTCAGAC E K I V L L L A I V S L V K S D BglII ATCAGATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGG 61 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TAGTCTAGACGTAACCTATGGTGCGATTGTTGAGATGACTCGTTCACCTATGTTAATACC Q I C I G Y H A N N S T E Q V D T I M E AAAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGT 121 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TTTTCTTGCACTGACAATGAGTGCGAGTCCTATAAGAACTTTTCTGAGTGTTGCCTTTCA K N V T V T H A Q D I L E K T H N G K L TGTGCGCTCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGC 181 -+ -+ -+ -+ -+ -+ ACACGCGAGAACTACCACAATTCGGTGAATAAGAATCCCTAACGAGACAACGACCTACCG C A L D G V K P L I L R D C S V A G W L TTCTTGGAAACCCAATGTGTGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGG 241 -+ -+ -+ -+ -+ -+ AAGAACCTTTGGGTTACACACTACTCAAGTAATTGCACGGTCTCACCAGAATATAACACC L G N P M C D E F I N V P E W S Y I V E AflII AGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGCTACCCTGGTGATTTCAACGATTACGAAGAGC 301 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TCTTCCGATTGGGTCACTTGCTAGAAACGATGGGACCACTAAAGTTGCTAATGCTTCTCG K A N P V N D L C Y P G D F N D Y E E L TTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCAT 361 -+ -+ -+ -+ -+ -+ AATTCGTGGAAGAAAGATCCTAATTGGTGAAGCTCTTCTAAGTCTAATAAGGTTTCAGTA K H L L S R I N H F E K I Q I I P K S S CTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGT 421 -+ -+ -+ -+ -+ -+ GAACCAGTAGAGTGCTCCGAAGAGAACCTCAAAGAAGACGAACGGGTATGGTCCCTTTCA W S S H E A S L G V S S A C P Y Q G K S 68 CATCTTTCTTCAGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTA 481 -+ -+ -+ -+ -+ -+ GTAGAAAGAAGTCCTTGCAACAAACCGAATAATTCTTCTTGAGATGAATGGGTTGATAAT S F F R N V V W L I K K N S T Y P T I K BglII EcoRI AGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAGATCTTTTGGTTCTTTGGGGAATTCACCACC 541 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TCTCCAGAATGTTGTTGTGATTGGTCCTTCTAGAAAACCAAGAAACCCCTTAAGTGGTGG R S Y N N T N Q E D L L V L W G I H H P CAAATGATGCTGCTGAACAGATTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGG 601 -+ -+ -+ -+ -+ -+ GTTTACTACGACGACTTGTCTAATTCAACATGGTCTTGGGTTGATGAATGTAAAGACACC N D A A E Q I K L Y Q N P T T Y I S V G GAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACG 661 -+ -+ -+ -+ -+ -+ CTTGAAGATGAGAATTGGTCTCCGAACACGGTTCTTAACGATGATCCAGATTCCACTTGC T S T L N Q R L V P R I A T R S K V N G EcoRI AflII GACAATCTGGAAGGATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACT 721 -+ -+ -+ -+ -+ -+ CTGTTAGACCTTCCTACCTTAAGAAGACCTGATAAGAATTCGGTTTGCTACGATAATTGA Q S G R M E F F W T I L K P N D A I N F TCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGTTGGTGAAGAAGGGTG 781 -+ -+ -+ -+ -+ -+ AGCTCAGATTGCCTTTGAAGTAACGAGGTCTCATGCGAATGTTCAACCACTTCTTCCCAC E S N G N F I A P E Y A Y K L V K K G D ScaI ATAGTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAACTC 841 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TATCATGATAATACTTCAGACTCGAACTCATGCCTTTGACGTTGTGATTCACGGTTTGAG S T I M K S E L E Y G N C N T K C Q T P CAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAG 901 -+ -+ -+ -+ -+ -+ GTTACCCTCGATAATTGAGAAGATACGGTAAGGTGTTGTAAGTGGGTGAATGATAACCTC M G A I N S S M P F H N I H P L T I G E AGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAACTCTC 961 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TCACGGGTTTCATGCACTTCAGATTGTCCGAACACGAACGATGACCTGAATCCTTGAGAG C P K Y V K S N R L V L A T G L R N S P 69 CACAGAGAGAAAGAAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGC 1021 -+ -+ -+ -+ -+ -+ GTGTCTCTCTTTCTTCCCCTGAAAAGCCTCGATAACGACCTAAGTAACTCCCTCCTACCG Q R E R R G L F G A I A G F I E G G W Q AGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAACGAGCAAGGATCTGGATATG 1081 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TCCCTTACCAACTACCTACCATGCCTATGGTAGTGAGATTGCTCGTTCCTAGACCTATAC G M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y A CTGCTGATAAGGAATCTACTCAGAAAGCTATTGATGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTA 1141 -+ -+ -+ -+ -+ -+ GACGACTATTCCTTAGATGAGTCTTTCGATAACTACCACAATGATTGTTCCACTTGAGAT A D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I BstBI TTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGA 1201 -+ -+ -+ -+ -+ -+ AATAACTATTCTACTTGTGAGTCAAGCTTCGACAACCTTCTCTCAAGTTGTTGGAACTCT I D K M N T Q F E A V G R E F N N L E R GAAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAAGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACA 1261 -+ -+ -+ -+ -+ -+ CTTCCTAACTCTTGGAATTGTTCTTTTACCTTCTACCTAAGGAACTACACACCTGAATGT R I E N L N K K M E D G F L D V W T Y N ACGCTGAGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACG 1321 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TGCGACTCAACGAACACGAATACCTTTTGCTCTCCTGAGAACTAAAGGTGCTAAGATTGC A E L L V L M E N E R T L D F H D S N V TGAAGAACCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAAGAGCTTGGAA 1381 -+ -+ -+ -+ -+ -+ ACTTCTTGGAAATGCTATTTCACTCCGAAGTCGAATCCCTATTGCGATTTCTCGAACCTT K N L Y D K V R L Q L R D N A K E L G N BglII ACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCATGGAATCTGTGAGATCTG 1441 -+ -+ -+ -+ -+ -+ TGCCAACGAAGCTCAAGATGGTGTTCACGCTATTGCTCACGTACCTTAGACACTCTAGAC G C F E F Y H K C D N E C M E S V R S G ScaI AflII GAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAGAGGGAAGAGATTTCTG 1501 -+ -+ -+ -+ -+ -+ CTTGAATGCTAATGGGTGTCATGAGACTTCTTCGATCCGAATTCTCCCTTCTCTAAAGAC T Y D Y P Q Y S E E A R L K R E E I S G 70 GTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTATTTACCAGATTCTTTCTATTTACTCTACTGTGGCTT 1561 -+ -+ -+ -+ -+ -+ CACAATTCAACCTCAGATAACCATAAATGGTCTAAGAAAGATAAATGAGATGACACCGAA V K L E S I G I Y Q I L S I Y S T V A S CTTCTCTTGCTCTTGCTATTATGGTGGCTGGACTTTCTCTTTGGATGTGCTCTAACGGAT 1621 -+ -+ -+ -+ -+ -+ GAAGAGAACGAGAACGATAATACCACCGACCTGAAAGAGAAACCTACACGAGATTGCCTA S L A L A I M V A G L S L W M C S N G S BamHI PacI CTCTTCAGTGCAGGATCTGCATTGGATCCTTAATTAA 1681 -+ -+ -+ GAGAAGTCACGTCCTAGACGTAACCTAGGAATTAATT L Q C R I C I b Trình tự gen HA1 10 20 30 40 50 60 GATCAGATCT GCATTGGATA CCACGCTAAC AACTCTACTG AGCAAGTGGA TACAATTATG 70 80 90 100 110 120 GAAAAGAACG TGACTGTTAC TCACGCTCAG GATATTCTTG AAAAGACTCA CAACGGAAAG 130 140 150 160 170 180 TTGTGCGCTC TTGATGGTGT TAAGCCACTT ATTCTTAGGG ATTGCTCTGT TGCTGGATGG 190 200 210 220 230 240 CTTCTTGGAA ACCCAATGTG TGATGAGTTC ATTAACGTGC CAGAGTGGTC TTATATTGTG 250 260 270 280 290 300 GAGAAGGCTA ACCCAGTGAA CGATCTTTGC TACCCTGGTG ATTTCAACGA TTACGAAGAG 310 320 330 340 350 360 CTTAAGCACC TTCTTTCTAG GATTAACCAC TTCGAGAAGA TTCAGATTAT TCCAAAGTCA 370 380 390 400 410 420 TCTTGGTCAT CTCACGAGGC TTCTCTTGGA GTTTCTTCTG CTTGCCCATA CCAGGGAAAG 430 440 450 460 470 480 TCATCTTTCT TCAGGAACGT TGTTTGGCTT ATTAAGAAGA ACTCTACTTA CCCAACTATT 490 500 510 520 530 540 AAGAGGTCTT ACAACAACAC TAACCAGGAA GATCTTTTGG TTCTTTGGGG AATTCACCAC 550 560 570 580 590 600 CCAAATGATG CTGCTGAACA GATTAAGTTG TACCAGAACC CAACTACTTA CATTTCTGTG 71 610 620 630 640 650 660 GGAACTTCTA CTCTTAACCA GAGGCTTGTG CCAAGAATTG CTACTAGGTC TAAGGTGAAC 670 680 690 700 710 720 GGACAATCTG GAAGGATGGA ATTCTTCTGG ACTATTCTTA AGCCAAACGA TGCTATTAAC 730 740 750 760 770 780 TTCGAGTCTA ACGGAAACTT CATTGCTCCA GAGTACGCTT ACAAGTTGGT GAAGAAGGGT 790 800 810 820 830 840 GATAGTACTA TTATGAAGTC TGAGCTTGAG TACGGAAACT GCAACACTAA GTGCCAAACT 850 860 870 880 890 900 CCAATGGGAG CTATTAACTC TTCTATGCCA TTCCACAACA TTCACCCACT TACTATTGGA 910 920 930 940 950 960 GAGTGCCCAA AGTACGTGAA GTCTAACAGG CTTGTGCTTG CTACTGGACT TAGGAACTCT 970 CCACAGAGAG AAAGAAGG 72 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………ii MỤC LỤC …………………………………………………………………iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ……………………………………………vi DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH ……………………………………………… viii MỞ ĐẦU Error: Reference source not found CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cúm A/H5N1 1.1.1 Cấu tạo 1.1.2 Độc lực tính thích ứng vật chủ 1.1.3 Khả gây bệnh virus cúm A/H5N1 1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ 1.2 Kháng nguyên HA 10 1.3 Tình hình nghiên cứu cúm A vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 Việt Nam giới 12 1.3.1 Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 Việt Nam giới 1Error: Reference source not found 1.3.2 Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 Việt Nam giới 16 1.4 Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens ứng dụng 19 1.4.1 Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens 19 1.4.2 Hệ vector nhị thể Error: Reference source not found1 1.4.3 Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp Error: Reference source not found3 73 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error: Reference source not found5 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị Error: Reference source not found 2.1.1 Vật liệu Error: Reference source not found5 2.1.2 Hóa chất Error: Reference source not found5 2.1.3 Thiết bị .Error: Reference source not found6 2.2 Phương pháp nghiên cứu .Error: Reference source not found 2.2.1 Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR .Error: Reference source not found6 2.2.2 Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal .Error: Reference source not found8 2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E coli DH-5α phương pháp sốc nhiệt 30 2.2.4 Tạo vector chuyển gen kỹ thuật Gateway 3Error: Reference source not found 2.2.5 Biến nạp vector chuyển gen vào A rhizogenes ATCC15834 35 2.2.6 Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc thơng qua vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 36 2.2.7 Phương pháp đánh giá trồng chuyển gen 37 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu ……………………………………… 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết tách dòng gen HA1 40 3.1.1 Kết PCR nhân đoạn gen HA1 40 3.1.2 Kết tinh sản phẩm PCR 41 3.1.3 Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal 4Error: Reference source not found 74 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 kỹ thuật Gateway ® 47 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR 47 3.2.2 Kết kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng colony-PCR .48 3.2.3 Kết kiểm tra vector tái tổ hợp enzyme giới hạn .48 3.3 Kết biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes 49 3.4 Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes sử dụng gen thị Gus 51 3.5 Kết chuyển gen HA1 vào mảnh thông qua A rhizogens để tạo dòng rễ tơ chuyển gen HA1 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC ………………………………………………………………… 66 75 ... ? ?Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt virus H5N1 bước đầu chuyển gen HA1 tạo dòng rễ tơ chuyển gen thuốc lá? ?? Mục tiêu đề tài - Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa. .. hóa protein vỏ virus H5N1 - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào thuốc tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens Nội dung nghiên cứu - Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein. .. protein vỏ virus H5N1 vào vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp - Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ virus H5N1 - Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu