Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và chuyển gen HA1 tạo dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá

Vật liệu, hóa chất và thiết bị 1. Vật liệu

K326 đang nuôi cấy trong điều kiện in vitro do Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp. - Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (Viện Sinh học phân tử và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức). - HA của virus H5N1 đã được tối ưu hóa mã để biểu hiện ở thực vật do Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

- Vector pENTRTM221/calnhận từ Viện Sinh học phân tử và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức. Vector này được thiết kế mang đoạn signal peptide calreticulin nằm giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín hiệu dẫn (phụ lục 2). - Vector chuyển gen pPTN289 mang gen gus được sử dụng để kiểm tra qui trình chuyển gen sử dụng trong nghiên cứu (phụ lục 2). a) Các môi trường nuôi cấy:. - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB, YMP. - Môi trường nuôi cấy thực vật: WPM, MS. Thành phần của các loại môi trường được trình bày trong phụ lục 1. b) Các loại kháng sinh: Kanamycin, Cefotaxim, Carbecillin, Spectinomycine. c) Một số hóa chất khác: Kit tinh sạch DNA -AccuPrep® Gel Purification Kit, Gateway® LR ClonaseTM II, thang DNA 1kb và các loại enzyme giới hạn SacI, HindIII.

Các hóa chất được cung cấp bởi các hãng: New England Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Invitrogen (Mỹ). Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cây, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy quang phổ…. Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gel Pluser, máy hút chân không ., cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen, Viện Công nghệ sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA quan tâm lên hàng triệu lần. - Vector pENTR/cal: là vector tiếp nhận, trên vector này có tín hiệu dẫn calreticulin nằm giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín hiệu dẫn. Cấu trúc attL1_Cal/SacI&HindIII/attL2 nằm trong vector pENTR/Cal - Phản ứng cắt enzyme giới hạn: Đoạn gen HA1 và pENTR/cal được cắt bằng enzyme giới hạn SacI và Hind III theo bảng 2.3.

Dưới tác dụng của muối CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột. Để chắc chắn rằng plasmid pENTR/cal/HA1 có mặt trong các dòng khuẩn lạc và đoạn gen HA1 ghép nối chính xác, chúng tôi tiến hành đọc trình tự các pENTR/cal/HA1 sử dụng cặp mồi đặc hiệu M13F/R. Kỹ thuật Gateway cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng khác nhau trong khi vẫn duy trì định hướng chính và cấu trúc đọc, thay thế việc sử dụng enzym cắt giới hạn và enzym nối hiệu quả.

Chuyển đoạn gen quan tâm vào vector đích (ví dụ, pK7WG2D (1)), vector này chứa tất cả trình tự cần biểu hiện và cũng chứa hai điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2) ở giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB. Trộn hai plasmid, att1 và att2 là hai điểm định hướng và đặc hiệu để tái tổ hợp, mỗi một điểm trên vector này chỉ tái tổ hợp với một điểm tương ứng trên vector kia mà không kết hợp với vị trí khác, nhưng nó sẽ kết hợp với những điểm xác định theo thứ tự phân tử., vì vậy, attL1 phản ứng với attR1, còn attL2 phản ứng với attR2. Tuy nhiên, để xác định chính xác các plasmid tái tổ hợp mới được tạo thành đúng như mong đợi, các phản ứng cắt bằng enzym giới hạn và PCR cũng sẽ được thực hiện.

- Làm tan hỗn hợp enzyme LR Clonase và bổ sung vào ống 1 àl enzyme LR Clonase để phản ứng xảy ra và đảo nhẹ nhàng vài lần bằng tay rồi ly tâm để hỗn hợp bám trên thành ống xuống hoàn toàn. Chọn các khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR để tiến hành nuôi lỏng trong môi trường YMP qua đêm ở 280C (50 ml YMP lỏng có bổ sung 100 àl cefotaxim 500 ml/L). Sự có mặt của vector chuyển gen được kiểm tra bằng phản ứng colony- PCR (mục 2.2.3. c) với cặp mồi đặc hiệu hoặc bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn SacI và HindIII (mục 2.2.2.

Gen chọn lọc điển hình là các gen mã hóa cho các loại enzyme có khả năng khử độc đối với kháng sinh như kanamycin (nptII), hygromycine (hyg), gentamycine (gent),… hoặc chất diệt cỏ glyphosate hay basta (bar),… Chỉ những tế bào mang gen biến nạp có thể sống sót trên môi trường chứa chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thông qua một loại gen chỉ thị được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là gen gus hay gen uidA. Đây là một enzyme hydrolase có khả năng phân hủy các hợp chất có gốc β- glucuronide tạo thành chất trung gian, khi chất này bị oxi hóa sẽ có màu xanh đậm đặc trưng.

Rễ dương tính (chuyển xanh do gen Gus)

Để chuẩn bị cho thí nghiệm này, chúng tôi cũng tiến hành cảm ứng mảnh lá cây thuốc lá trong môi trường WPM trước 2 ngày. Các mảnh lá được nuôi cộng sinh từ 2-3 ngày và được cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường WPM có bổ sung kháng sinh Cefotaxim 500 mg/L và kanamycin 100 mg/L để chọn lọc. Tỷ lệ chọn lọc và hình ảnh của các mảnh lá trên môi trường chọn lọc được thể hiện qua bảng 3.3 và hình 3.10.

Tỷ lệ mô lá chuyển gen pK7WG2D/cal/HA1 trên môi trường chọn lọc. Qua bảng 3.3, tương tự như kết quả chuyển gen chỉ thị Gus, số lượng mô lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, và hiện nay (sau 3 tuần) một vài mô lá sống sót bắt đầu cảm ứng tạo rễ tơ (hình 3.11). Các dòng rễ tơ này sẽ tiếp tục được kiểm tra bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và lai miễn dịch.

Các dòng rễ tơ chuyển gen sẽ được chuyển sang nuôi cấy lỏng tạo sinh khối để tách chiết protein HA1 tái tổ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng trình tự nucleotide tín hiệu Calreticulin ở đầu 5’ của gen HA1, đoạn tín hiệu này có chức năng dẫn protein tái tổ hợp biểu hiện ra môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các protein tái tổ hợp ở các bước tiếp theo.