Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ 2. GS. TS. CHU HOÀNG MẬU THÁI NGUYÊN - 2013 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất ở gia cm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi. nước ta, dịch cúm gia cm H5N1 xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Việt Nam và Indonesia là hai quốc gia có số người nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và khống chế bệnh là yêu cu thực tiễn đặt ra. Dịch cúm gia cm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và thủy cm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống dịch như tiêu độc, xử lý gia cm bị bệnh, thanh lý gia cm nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người. Hiện nay, ngoài vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, các loại vaccine này có nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp. Do vậy, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn. Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính 2 tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phn ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ổn định, an toàn cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế. Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con người. Sự biểu hiện thành công gen gus trên cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để sản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương. Với ưu điểm nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển. Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1. Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1. 3 3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào vi khuẩn A. tumefaciens. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1; 3.3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương; 3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương. Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84; 3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương và phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương của thế hệ T0; 3.6. Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và lai Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tương. 4. Những đóng góp mới của luận án 4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1. 4.2. Giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được thử nghiệm chuyển gen gus. Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt là 7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3 % với giống DT84. 4.3. Chuyển cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T 0 mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1. 4.4. thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11. 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công gen gus ở hạt. Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương. Với việc lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương, tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của virus H5N1 trong hạt đậu tương. Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt đậu tương ở thế hệ T 1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng miễn dịch của gia cm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine ăn được ở thực vật. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 Cúm gia cm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38]. Đây là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42]. Virus cúm A/H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên người vào những năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện ln đu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cm mà còn thích ứng trên người và gây chết người bệnh [142]. Năm 2003, virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực , loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên- miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt đu lan sang một số nước vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nước vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, trong đó Ai Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất [25]. 6 Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đến tháng 3/2013, đã có tới 622 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 371 trường hợp đã tử vong, chiếm 59,65%. Trong đó quốc gia có số người mắc bệnh và số tử vong cao là các nước Ai cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học cho thấy, hu hết những ca nhiễm cúm gia cm H5N1 trên người đều có liên quan đến tiếp xúc với gia cm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế biến từ gia cm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như giết mổ, vận chuyển, mua bán gia cm. Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm A/H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người. Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, đã tái phát qua bốn đợt dịch. Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tư gn đây nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cm các loại, thiệt hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9]. Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cm. Mặc dù số ca nhiễm ít nhưng tỷ lệ tử vong rất cao (59%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7]. 1.1.2. Virus cúm A/H5N1 1.1.2.1. Đặc tính của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các tia phóng xạ. Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến 7,9. Trong điều kiện quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm. Virus A/H5N1 bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus bị phá hủy hoàn toàn ở 100 o C hoặc 30 7 phút ở 60 o C, tồn tại 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cm), và hàng năm ở -70 o C. Trong phủ tạng gia cm (40 o C) tồn tại được 25-30 ngày, nhưng trong cơ thể người (37 o C) chỉ sống được 7-8 ngày, còn ở nước 30 o C tồn tại được 4 ngày [24] [26] [75]. Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau. Các phân type (subtype) là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1-H15) và 9 NA (N1-N9). Hemagglutinin mới, dạng thứ 16 (H16), được tìm thấy năm 2005 từ con mòng biển đu đen. Trình tự H16 có độ tương đồng cao với H13 [25] [32]. Các phân type gây nhiễm cho hu hết các loài sinh vật bao gồm loài người, các loài lông vũ (gà, thủy cm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá voi Chúng thích ứng hu hết với mọi loại vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm kinh hoàng trong lịch sử ở động vật và người [140]. Do đặc tính biến đổi gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lan truyền trong qun thể sinh vật, cúm A là nhóm virus nguy hiểm truyền bệnh từ động vật sang người .Virus A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất đối với các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học cho thấy chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc và trao đổi gen thông qua H9N2 trên lợn [77]. Về danh pháp, để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đy đủ, các chủng virus cúm sau khi phân lập phải được ký hiệu theo danh pháp quy định với trật tự như sau: tên serotype/loài bị nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình subtype (HA (H) và NA (N)) [35] [25]. Ví dụ: virus cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/HG4/ 2005(H5N1) có thông tin về danh pháp là cúm nhóm A, loài nhiễm là gà (chicken), nơi phân lập là Việt Nam, số hiệu chủng là HG4 – Hậu Giang 4, thời gian phân lập là năm 2005, phân type là H5N1. 8 Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: (1) loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza) và (2) loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza). Cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [30]. HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cm chúng thường gây chết 100% số gia cm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29]. LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [68] [155]. 1.1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A/H5N1 Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân đoạn gen mã hoá cho 8 phân tử protein [34]. Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, cụ thể là: Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hóa tổng hợp enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phn trong phức hợp polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đu phiên mã RNA virus. PB2 có khối lượng phân tử 87.10 3 Da [38]. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cm vị trí này là Glu - thích ứng với nhiệt độ cơ thể gia cm khoảng 40 o C, còn ở virus thích nghi trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37 o C) [63]. Phân đoạn 2 (gen PB1) mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu [...]... tạo cây chuyển gen, mở ra những ứng dụng mới theo hướng nghiên cứu tạo cây chuyển gen phục vụ cho hướng nghiên cứu vaccine thực vật 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT 1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, ... nghiên cứu cây trồng chuyển gen [71] Vaccine thực vật (vaccine ăn được ở thực vật) là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn Chúng tác động vào dịch thể, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Vaccine thực vật bền vững trong dịch tiêu hóa, đi qua đường tiêu hóa mà không bị phân hủy [4] Sản xuất vaccine thực. .. chất của vaccine thực vật là loại vaccine dưới đơn vị do gen mã hoá cho một phần của protein virus gây bệnh, nó không phải là chính tác nhân gây bệnh đã bất hoạt hoặc chết Hơn nữa vaccine thực vật được sản xuất từ thực vật, do đó không bị tạp nhiễm các nhân tố gây bệnh ở động vật trong quá trình sản xuất v) Hạt cây trồng dễ dàng cung cấp dạng thức ăn cho vật nuôi và thú hoang dã Hiện nay cây chuyển gen. .. dịch của vaccine sản xuất từ thực vật; (6) Sử dụng vaccine đã được thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi hoặc dưới dạng thức ăn đã chế biến [135] Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật trong định hướng nghiên cứu vaccine thực vật đã thu được một số thành tựu như nghiên cứu vaccine virus viêm gan B biểu hiện trong chuối, vaccine chống bệnh đường ruột [69], vaccine chống bệnh SARS-CoA ở nhiều loài thực vật. .. “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural protein) , có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein) , có vai trò bảo vệ hệ gen của virus [42] Độc tính của virus có sự liên quan với gen không... quan tâm; (2) Phân lập gen; (3) Thiết kế vector chuyển gen; (4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5) Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thể biến nạp; (7) Tái sinh cây biến nạp; (8) Phân tích cây chuyển gen Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen thông qua loài vi... nhất đã chuyển gen có thể tạo ra sự biệt hóa Vì vậy phôi soma đã được sử dụng để đánh giá đặc tính của hạt chuyển gen trước khi tạo cây hoàn chỉnh, và sau đó là quá trình chọn lọc các dòng cây chuyển gen tái sinh được thực hiện 79 51 29 Cây đậu tương đầu tiên được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen sử dụng súng bắn gen vào thân mầm hạt đậu tương từ năm 1988 , đến nay phương pháp chuyển gen này đã được... phương pháp chuyển gen cho hiệu quả cao Bằng phương pháp này đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ Theo phương pháp này, gen được chuyển trực tiếp và tế bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý Các phương pháp chuyển gen trực tiếp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật có thể kể đến là (i) Phương pháp chuyển gen nhờ... Sản xuất vaccine thực vật có thể thực hiện theo quy trình sau đây: 22 (1) Lựa chọn gen cần biểu hiện và đưa vào vector thích hợp; (2) Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen; (3) Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau; (4) Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật; (5) Thử nghiệm khả... động vật có vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào… Trong các hệ thống trên, thực vật có nhiều lợi thế trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp, bởi vì: (1) Khả năng glycosit hoá các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch; (2) Protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao; (3) Thực . Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật . 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen. NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 . –––––––––––––––––– NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC