Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose

 Dung dịch đệm TAE 1X: pha từ dung dịch mẹ 50X (Tris base 242 g; acid acetic băng 55,1 ml; Na2EDTA 37,2 g; nước cất vừa đủ 1 lít).  Agarose tinh khiết dùng cho điện di (Invitrogen).

 Dung dịch ethidium bromide 5 mg/ml (Sigma).

 Dung dịch đệm nạp mẫu (loading buffer) 10X (glycerol 50% trong TE 1X, có 0,015% bromophenol blue, trộn và bảo quản ở -20oC trong từng phần nhỏ).

Hình 2.1. Kích thước của thang MassRuler ladder Mix 2.1.9. Môi trường, hóa chất dùng cho biến nạp và biểu hiện

 Môi trường SOC: Bacto tryptone 2 g, yeast extract 0,5 g, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl 10 mM, MgSO4 10 mM, D-Glucose 20 mM bổ sung nước vừa đủ 100 g.

 Môi trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy E.coli: Bacto-tryptone 10 g; Bacto yeast extract 5 g; NaCl 10 g; nước cất vừa đủ 1 lít; pH 7,4  Để chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid có tính đề kháng kháng sinh,

môi trường LB được bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin (Amp) 100 µg/ml.

 Chất cảm ứng IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside).

 Dung dịch CaCl2

2.1.10. Hóa chất dùng cho điện di trên gel polyacrylamide

 Dung dịch acrylamide 30%

 Dung dịch đệm cho gel tách (Tris-HCl 1,5M pH 8,8)  Dung dịch đệm cho gel gom (Tris-HCl 0,5M, pH 6,8)  SDS 10%

 TEMED

 Dung dịch đệm nạp mẫu SDS-PAGE 4X (Tris-HCl 0,25M; SDS 8%; glycerol 40%V/V; DTT 0,4M; bromophenol blue 0,04%; pH 6,8).  Dung dịch đệm chạy gel (Tris-HCl 0,025M; glycine 0,192M; SDS

0,1% pH 8,3).

 Dung dịch xanh Coomassie G250; dung dịch 10% acetic acid có chứa 0,06 g/l coomassie G250.

 Thang protein chuẩn: thang Multicolor Broad Range Protein Ladder

Hình 2.2. Kích thước thang Multicolor Broad Range Protein Ladder 2.1.11. Hóa chất dùng cho tinh chế DNA từ thạch agarose

Bộ kit Wizard SV Gel và PCR Clean-up system (Promega)

2.1.12. Hóa chất dùng cho tinh chế plasmid

Bộ kit DNA-spinTM Plasmid (Intronbio, mã số 17093)

2.1.13. Hóa chất dùng cho phương pháp Western blot

 Giấy thấm dày, màng nitrocellulose.

 Dung dịch đệm chuyển màng (Tris 25 mM; glycine 192 mM, MeOH 20%, SDS 0,1%).

 Dung dịch khóa màng: 20 ml dung dịch đệm PBS 1X, 1 g sữa gầy (5%) và 100 ml Tween-20 (0,5%).

 Dung dịch rửa: dung dịch đệm PBS 1X có 0,1% Tween-20.  Kháng thể sơ cấp:kháng thể kháng his.

 Kháng thể thứ cấp:protein A gắn peroxidase (GE).  TMB dùng để hiện màu trên màng.

2.2. PHƯƠNG PHÁP

2.2.1. Phương pháp thu mẫu

Tiến hành thu mẫu từ 3-5 mẫu khác nhau trong khu vực suối nước nóng, việc tiến hành thu mẫu được tiến hành lặp lại tại các điểm. Thu mẫu nước ở độ sâu 10 cm bằng các lọ thủy tinh (có dung tích 50 –100 ml), nút đậy bằng cao su đã khử trùng. Mẫu nước không giữ nhiệt và được xử lý trong vòng 24 giờ.

2.2.2 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn Meiothermus ruber

Nuôi tích lũy: chuyển 1 ml mẫu nước vào các bình tam giác 250 ml chứa môi trường dịch thể CS–TYE với pH 7,6. Ủở nhiệt độ 55°C, không lắc.

Phân lập và làm thuần: huyền phù sinh khối vi khuẩn chịu nhiệt từ môi trường nuôi tích lũy được pha loãng và ria trên môi trường thạch CS–TYE có pH tương ứng. Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 55°C. Sau 2, 3 ngày chọn các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, huyền phù hóa từng khuẩn lạc trong nước muối sinh lý vô trùng và ria trên môi trường CS–TYE thạch để làm thuần vi khuẩn ưa nhiệt.

2.2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn Meiothermus ruber

2.2.3.1. Khảo sát hình thái tế bào

Tế bào được nuôi trong môi trường dịch thể CS-TYE ởđiều kiện nhiệt độ tối ưu từ 3 đến 4 ngày. Quan sát hình dạng tế bào ở trạng thái sống bằng kính hiển vi quang học. Sau đó tiến hành nhuộm gram tế bào và quan sát với vật kính dầu

2.2.3.2. Giải trình tự gen

Tiến hành tách chiết DNA bộ gen của các chủng khảo sát, thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu thuộc vùng 16S rRNA. Sau đó giải trình tự các đoạn này và dùng phần mềm để so sánh với dữ liệu trên Gen Bank

2.2.4. Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn

 Ly tâm 1,5 ml dịch vi khuẩn trong 2 phút. Bỏ dịch nổi

 Hoà cắn trong 567 µl đệm TE. Thêm 30 µl SDS 10% và 3 µl proteinase K 20 mg/ml. Trộn đều, ủ trong 1 giờ ở 37oC.

 Thêm 100 µl NaCl 5M, trộn đều .Thêm 80 µl dung dịch CTAB/NaCl, trộn và ủ trong 10 phút ở 65oC.

 Thêm một luợng cân bằng chloroform/ isoamyl alcohol, trộn đều và ly tâm từ 4 đến 5 phút. Chuyển dịch nổi sang 1 tube sạch.

 Thêm một lượng cân bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol trộn đều và ly tâm trong 5 phút. Chuyển dịch nổi sang 1 tube sạch.

 Thêm 0,6 thể tích isopropanol ly tâm, bỏ dịch nổi. Hòa cắn trong 1ml ethanol 70%.

 Ly tâm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và làm khô nhanh trong máy ủ nhiệt khô. Hoà trong 100 µl đệm TE.

2.2.5. Phương pháp PCR

Thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 25 µl): Trong một eppendorf 0.2ml sạch đã tiệt trùng:

 dH2O 14,5 µl  Buffer 5X green goTaq 5 µl

 MgCl2 25mM 2,5 µl  dNTP 10mM 0,5 µl  mồi pMtreSF 100pM 0,5 µl  mồi pMtreSR 100pM 0,5 µl  Taq polymerase 0,5 µl  DNA khuôn 15 µg/ml 1 µl

Chương trình PCR  94oC 4 phút  35 chu kỳ gồm 94oC 30 giây 67oC 20 giây 72oC 1phút 30 giây  72oC trong 10 phút.

2.2.6. Phương pháp điện di trên gel agarose

 Đổ gel: cân 0,4-0,5 g agarose (gel 0,8-1%) cho vào 50 ml đệm TAE 1X, đun đến khi tan hoàn toàn, lắc đều và làm nguội đến 50oC, thêm ethidium bromide đến nồng độ 1 µg/ml, trộn đều và đổ vào khuôn, gắn lược, để gel đông trong khoảng 30 phút.

 Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa dung dịch đệm TAE 1X sao cho dung dịch đệm ngập trên gel khoảng 1 mm, giếng lược của miếng gel đặt về phía cực âm.

 Pha các mẫu DNA với lượng thích hợp dung dịch đệm tải 10X và dùng pipet cho các mẫu này vào giếng, chạy song song với thang DNA chuẩn.

 Gắn điện để DNA chạy đến cực dương, chạy ở dòng điện 100 Vol, 25 phút

 Quan sát băng DNA qua máy đọc gel hoặc trên hộp đèn cực tím.

2.2.7. Phương pháp tinh chế DNA từ thạch agarose

Quan sát các băng dưới tia cực tím, dùng dao lam cắt phần gel chứa vạch DNA mong muốn và tiến hành tinh chế bằng bộ kít Wizard SV Gel và PCR Clean- up system của hãng Promega. 2.2.8.Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn Trong một eppendorf 0,5ml đã tiệt trùng:  Nước khử ion tiệt trùng 16,3 µl  RE 10X buffer 2,0 µl  Acetylated BSA 10 µl/ml 0,2 µl

 DNA, 1μg/ml 1,0 µl  RE 10u/ µl 0,5 µl Thể tích cuối cùng 20 µl

Trộn nhẹ nhàng bằng micropipet, spin eppendorf và ủở 37oC trong 1-4 giờ

2.2.9. Phản ứng ghép nối đoạn DNA vào vector pJet1.2 blunt

Sản phẩm PCR sau khi tinh chếđược nối vào vector pJet 1.2 theo qui trình của bộ kit pJet clone kit của hãng Fermentas.

Hình 2.3. Vector Pjet1.2 blunt

2.2.10. Phản ứng nối đoạn DNA chèn vào vector pET-22b

Trước hết đoạn DNA chèn và vector đã thủy giải bởi các RE được đo nồng độ bằng máy đo nồng độ (nanodrop), từđó tính tỉ lệ DNA chèn và vector theo công thức sau:

Vector ng của vector × kb của đoạn DNA chèn

Đoạn chèn kb của vector × ng của đoạn DNA chèn

Lượng DNA trong phản ứng lai không được quá 200 ng và thể tích tổng cộng thường là 10-20 μl.

Sau khi đã tính tỉ lệ, tiến hành phản ứng lai trong một eppendorf 0.5ml;

Vector x μl

Đoạn DNA chèn y μl

Ligation buffer 10X 1,0 μl T4 DNA ligase ( 3u/ μl) 0,5 μl Nước khử ion tiệt trùng vừa đủ thểtích 10 μl

2.2.11. Chuyển DNA vào E.coli bằng phương pháp hóa biến nạp

Hóa biến nạp là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao. Cơ chế biến nạp chủ yếu bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể tiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp nhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả biến.

2.2.11.1. Nguyên tắc

Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA. Tạo hỗn hợp vi khuẩn với DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao (42oC). Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và cố định trong tế bào vi khuẩn. Bổ sung thêm môi trường SOC. Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứa môi trường có bổ sung kháng sinh.

2.2.11.2. Cách tiến hành Chuẩn bị tế bào khả biến: Chuẩn bị tế bào khả biến:

 Cấy 1 khuẩn lạc E.coli vào 10ml môi trường LB, lắc ở 37oC qua đêm.  Cấy chuyền 100 μl dịch nuôi cấy E.coli qua đêm vào 100 ml môi

trường LB. Lắc 250 rpm ở 37oC. Đo OD600 mỗi giờ.

 Khi OD đạt đến 0,35-0,4, đặt tế bào lên đá. Để lạnh trong 20-30 phút, thỉnh thoảng khuyấy đều để chắc chắn rằng các tế bào đều lạnh.

 Tiếp đó chuyển dịch nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50 ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000 rpm trong 5 phút.

 Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12,5 ml) dung dịch 50 mM CaCl2. Lắc nhẹđể làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phút trên đá. Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên và cho vào 1/10 thể tích (2,5ml) dung dịch 100 mM CaCl2

và làm tan hoàn toàn cặn. Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerol bảo quản ở -70oC.

Biến nạp:

Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µl DNA. Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt trong 30 giây ở 42oC. Sau sốc nhiệt bổ sung thêm 250 µl môi trường SOC và lắc ở 37oC trong 1h. Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biến nạp trên trải trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (Amp 100 µg/ml) và để phát triển qua đêm ở 37oC. Sàng lọc các dòng mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR khuẩn lạc.

Tất cả các thao tác và dụng cụđều thực hiện ởđiều kiện vô trùng.

2.2.12.Ly trích DNA plasmid của E.coli theo phương pháp DNA-spin

Các khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid được tiến hành tách chiết theo hướng dẫn của bộ kít DNA-spin của hãng Intron Biotechnology.

2.2.13. Kiểm tra sản phẩm tạo dòng

Mẫu plasmid tái tổ hợp pET-TreS sau khi được tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng phương pháp PCR, cắt với RE. Sau đó, mẫu plasmid cùng với các mồi

pMtreSF, pMtreSR, A, B, C,D được gửi giải trình tự tại Công ty Biotek Nam Khoa – thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả giải trình tự đoạn chèn TreS được so sánh với trình tự trên ngân hàng dữ liệu thuộc trung tâm Quốc gia về Thông tin Công Nghệ Sinh học của Mỹ (NCBI)

2.2.14. Biểu hiện protein tái tổ hợp

Cấy chuyển từ khuẩn lạc đơn, dòng tế bào E. coli BL21(DE3) mang vectơ biểu hiện pET-Tres sang 5 ml môi trường lỏng LB có chứa ampicilin 100 μg/ml, nuôi lắc 370C qua đêm đến pha ổn định. Từ dịch nuôi cấy qua đêm cấy chuyển 1 ml sang bình 500 ml chứa 100 ml LB lỏng và kháng sinh ampicilin100 μg/ml, nuôi lắc 370C, sau 2 giờ (OD600nm = 0,6), môi trường được bổ sung chất cảm ứng IPTG (nồng độ cuối cùng 1 mM) và tiếp tục nuôi lắc 200 v/phút. Tế bào được thu sau 4 giờ cảm ứng và kiểm tra mức độ biểu hiện bằng điện di SDS-PAGE.

2.2.15.Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE) 2.2.15.1 Nguyên tắc 2.2.15.1 Nguyên tắc

Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽđược nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Vì vậy, những protein chênh lệch về khối lượng có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE.

2.2.15.2. Cách tiến hành

 Gắn khung đổ gel theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 Pha gel tách 12%: trong một ống falcon 15 ml hoặc 50 ml cho vào các thành phần theo bảng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần gel tách polyacrylamide 12% (10 ml)

Thành phần Nước cất Resolving gel Acrylamide 30% APS 10% TEMED Thể tích 3,5 ml 2,5 ml 4,0 ml 50 µl 5 µl  Dùng pipet cho dung dịch gel vào khuôn, phủ trên lớp gel một lớp nước cất.

Để yên khoảng 30 phút cho polyme hóa hoàn toàn.

 Sau khi phần gel tách polyme hóa hoàn toàn, đổ bỏ và thấm bằng giấy thấm cho hết lớp nước phủ trên gel tách.

 Pha gel gom 4,5%: Trong một ống falcon 15 ml hoặc 50 ml cho vào các thành phần theo bảng 2.2

Bảng 2.2. Thành phần gel gom polyacrylamide 4.5% ( 5ml)

Thành phần

Nước cất

Stacking gel buffer 4X Acrylamide 30% APS 10% TEMED Thể tích 3 ml 1,25 ml 0,75 ml 25 µl 10 µl  Dùng pipet cho dung dịch vào khuôn, cài lược vào. Để yên khoảng 30 phút

cho polyme hóa hoàn toàn.

 Pha mẫu: trộn mẫu protetin với dung dịch đệm nạp mẫu 4X theo tỉ lệ 3:1 trong ống 1,5 ml. Đun sôi 3-5 phút, để ngay vào đá sẵn sàng cho chạy gel. Các mẫu này có thể bảo quản ở -20oC trong 6 tháng.

 Lấy lược ra từ từđể tránh làm vỡ gel.

 Rửa gel với dung dịch đệm chạy gel, lật ngược giá gel để cho ráo giếng, rồi cho gel vào bình chạy.

 Dùng micropipet cho 10-15 μl mẫu pha vào giếng. các giếng phải được cho cùng một thể tích dung dịch đệm loading. Ở các giếng không cần cũng được cho cùng một thể tích dung dịch đệm loading 1X.

 Chạy điện di với hiệu điện thế không đổi là 100V cho đến khi vạch màu xanh của bromophenol trong dung dịch đệm nạp mẫu chạy đến mép dưới của gel.  Nhuộm gel bằng dung dịch xanh Coomassie G250 trong 1 giờ. Các băng

protein xuất hiện trong khi nhuộm.

 Giải nhuộm gel bằng dung dịch acid acetic 10% cho đến khi xuất hiện các băng. Đọc kết quả.

2.2.16. Phân tích protein bằng phương pháp Western blot 2.1.16.1. Nguyên tắc

Kỹ thuật Western blot gồm hai bước: Điện di protein trên gel polyacrylamide và chuyển (blot) protein từ gel vào màng nitrocellulose và phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu.

2.1.16.2. Cách tiến hành

 Điện chuyển thẩm protein từ gel lên màng nitrocellulose.

 Gel SDS-PAGE sau khi chạy điện di xong, lấy ra khỏi hệ thống chạy gel và ngâm trong dung dịch đệm chuyển màng trong 15 phút.

 Ngâm màng và giấy thấm trong dung dịch đệm chuyển trong 5 phút.

 Sắp xếp hệ thống chuyển màng theo thứ tự : một miếng giấy thấm dày (có cùng kích thước với gel và màng), màng nitrocellulose, gel, một miếng giấy thấm dày khác. Sau mỗi lớp đặt, dùng pipet lăn trên bề mặt để đuổi bọt khí