2.2.15.1 Nguyên tắc
Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽđược nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Vì vậy, những protein chênh lệch về khối lượng có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE.
2.2.15.2. Cách tiến hành
Gắn khung đổ gel theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Pha gel tách 12%: trong một ống falcon 15 ml hoặc 50 ml cho vào các thành phần theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần gel tách polyacrylamide 12% (10 ml)
Thành phần Nước cất Resolving gel Acrylamide 30% APS 10% TEMED Thể tích 3,5 ml 2,5 ml 4,0 ml 50 µl 5 µl Dùng pipet cho dung dịch gel vào khuôn, phủ trên lớp gel một lớp nước cất.
Để yên khoảng 30 phút cho polyme hóa hoàn toàn.
Sau khi phần gel tách polyme hóa hoàn toàn, đổ bỏ và thấm bằng giấy thấm cho hết lớp nước phủ trên gel tách.
Pha gel gom 4,5%: Trong một ống falcon 15 ml hoặc 50 ml cho vào các thành phần theo bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần gel gom polyacrylamide 4.5% ( 5ml)
Thành phần
Nước cất
Stacking gel buffer 4X Acrylamide 30% APS 10% TEMED Thể tích 3 ml 1,25 ml 0,75 ml 25 µl 10 µl Dùng pipet cho dung dịch vào khuôn, cài lược vào. Để yên khoảng 30 phút
cho polyme hóa hoàn toàn.
Pha mẫu: trộn mẫu protetin với dung dịch đệm nạp mẫu 4X theo tỉ lệ 3:1 trong ống 1,5 ml. Đun sôi 3-5 phút, để ngay vào đá sẵn sàng cho chạy gel. Các mẫu này có thể bảo quản ở -20oC trong 6 tháng.
Lấy lược ra từ từđể tránh làm vỡ gel.
Rửa gel với dung dịch đệm chạy gel, lật ngược giá gel để cho ráo giếng, rồi cho gel vào bình chạy.
Dùng micropipet cho 10-15 μl mẫu pha vào giếng. các giếng phải được cho cùng một thể tích dung dịch đệm loading. Ở các giếng không cần cũng được cho cùng một thể tích dung dịch đệm loading 1X.
Chạy điện di với hiệu điện thế không đổi là 100V cho đến khi vạch màu xanh của bromophenol trong dung dịch đệm nạp mẫu chạy đến mép dưới của gel. Nhuộm gel bằng dung dịch xanh Coomassie G250 trong 1 giờ. Các băng
protein xuất hiện trong khi nhuộm.
Giải nhuộm gel bằng dung dịch acid acetic 10% cho đến khi xuất hiện các băng. Đọc kết quả.
2.2.16. Phân tích protein bằng phương pháp Western blot 2.1.16.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật Western blot gồm hai bước: Điện di protein trên gel polyacrylamide và chuyển (blot) protein từ gel vào màng nitrocellulose và phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu.
2.1.16.2. Cách tiến hành
Điện chuyển thẩm protein từ gel lên màng nitrocellulose.
Gel SDS-PAGE sau khi chạy điện di xong, lấy ra khỏi hệ thống chạy gel và ngâm trong dung dịch đệm chuyển màng trong 15 phút.
Ngâm màng và giấy thấm trong dung dịch đệm chuyển trong 5 phút.
Sắp xếp hệ thống chuyển màng theo thứ tự : một miếng giấy thấm dày (có cùng kích thước với gel và màng), màng nitrocellulose, gel, một miếng giấy thấm dày khác. Sau mỗi lớp đặt, dùng pipet lăn trên bề mặt để đuổi bọt khí có thể có.
Đậy nắp của hệ thống chuyển màng.
Điều chỉnh dòng điện nguồn để có dòng điện 400 mA và chạy trong thời gian 60 phút.
Tắt nguồn điện và lấy màng ra.
Ủ màng trong 20 ml dung dịch khóa màng (3% sữa gầy) trên máy lắc nhẹ trong 1-2 giờ. Rửa màng bằng dung dịch rửa.
Ủ màng với 20 ml dung dịch kháng thể thứ 1.
Đổ bỏ dung dịch ủ. Rửa màng 3 lần với dung dịch rửa, lắc nhẹ 10 phút/lần. Ủ màng trong 20 ml dung dịch protein A, lắc trong 1-2 giờở nhiệt độ phòng.
Rửa như trên.
CHƯƠNG 3: