Plasmid chứa trình tự đoạn gen TreS sau khi được tinh sạch được cắt với enzyme cắt hạn chếđể thu lại đoạn gen TreS làm nguyên liệu chèn vào vector pET - 22b. Vectơ pET-22b (+) có chiều dài 5493 bp , được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E. coli. Vector pET-22b(+) mang gen lac I mã hoá cho protein lac repressor, can thiệp vào quá trình điều hoà hoạt động của promoter trên vector và được cảm ứng bằng cơ chất tổng hợp IPTG.
Plasmid pJet-TreS (kích thước khoảng 5870bp) được cắt với 2 enzyme NdeI và EcoRI để thu lại đoạn gen TreS. Tuy nhiên do kích thước của vector pJet1.2 2895 bp
blunt tương đương với kích thước đoạn gen (2974 bp và 2895 bp) nên trong phản ứng cắt chúng tôi dùng thêm enzyme Vsp I để cắt nhỏ pJet.
Hình 3.4. Vị trí cắt của Vsp 1 trên vector pJet1.2/blunt
Enzyme Vsp I sẽ cắt vector pJet1.2/blunt thành 2 đoạn nhỏ, trong khi đó nó không cắt đoạn gen TreS. Do vậy, đoạn khoảng 3kb thu được trên bản điện di sau phản ứng cắt chính là đoạn gen TreS.
Đoạn gen TreS này sau đó được tinh chế và chèn vào vector pET-22b đã được xử lý với 2 enzyme NdeI và EcoRI trước đó. Cả đoạn chèn TreS và vector pET-22b đều được tiến hành đo nồng độ bằng máy đo nồng độ (nanodrop) và từđó tính tỉ lệ lai giữa vector và đoạn chèn cho thích hợp. Ở đây, tỉ lệ vector: đoạn chèn chúng tôi sử dụng là 1: 6. Sản phẩm nối này sau đó được biến nạp vào vi khuẩn
E.coli BL21(DE3) bằng phương pháp hóa biến nạp và nuôi cấy trên đĩa LB có chứa kháng sinh Amp ở 37oC, qua đêm. Sự có mặt của đoạn gen TreS trong pET-22b được kiểm tra bằng PCR colony với cặp mồi pMtreSF và pMtreSR.
500 1000 1500 2000 2500
Vsp 1 Vsp 1
Hình 3.5. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR các mẫu plasmid pET-TreS (giếng 1: mẫu PCR dương; giếng 2: mẫu âm; giếng 3,4,5,6 các mẫu plasmid;
giếng 7: thang chuẩn MassRuler DNA ladder Mix)
Kết quả điện di cho thấy một băng duy nhất xuất hiện, khoảng 3kb, đó là kích thước của đoạn gen TreS. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác có đoạn chèn hay không, plasmid sau khi tinh chếđược tiến hành cắt mở vòng với 2 enzyme NdeI và EcoRI. Kết quả cho thấy sản phẩm cắt có 2 băng là 5493 bp (vector pET-22b) và 2895 bp (TreS). Như vậy đoạn gen TreS đã được chèn thành công vào vector pET- 22b.
Hình 3.6. Điện di trên gel agarose sản phẩm cắt plasmid pET-TreS (giếng 1: thang chuẩn MassRuler DNA ladder Mix; giếng 2: sản phẩm cắt với 2
enzyme NdeI và EcoRI; giếng 3: plasmid pET-TreS)
3.3.3. Kiểm tra trình tự sản phẩm tạo dòng
Vector pET-TreS sau khi được kiểm tra bằng PCR và phản ứng cắt RE sẽ được tiến hành giải trình tự để so sánh với trình tự gen mã hóa cho enzyme Trehalose synthase đã công bố. Chúng tôi tiến hành thiết kế các mồi A, B, C, D cùng với hai mồi pMtreSF và pMtreSR để giải những đoạn trình tự ngắn trên vector pET-TreS. Sau đó dùng chương trình Blast Nucleotide trên NCBI để so sánh những đoạn trình tự này. 5493 bp 2895 bp A 573 B 1060 C 1708 D 2358 Hình 3.7. Vị trí các mồi giải trình tự 3000 bp 6000 bp
Trình tự truy vấn Trình tự tham khảo Accession No Loài Chiều dài (bp) Độ bao phủ Giá trị E Độ tương đồng Khác biệt (nu) A
HM587953.1 Meiothermus sp. SK3-2 trehalose synthase (treS)
gene, partial cds 1258 100% 0.0 99% 1
CP001743.1 Meiothermus ruber DSM 1279, complete genome 1258 100% 0.0 99% 1
EU443098.1 Meiothermus ruber strain CBS-01 trehalose
synthase (treS) gene, complete cds 1258 100% 0.0 99% 1
B
HM587953.1 Meiothermus sp. SK3-2 trehalose synthase (treS)
gene, partial cds 1341 100% 0.0 99% 1
CP001743.1 Meiothermus ruber DSM 1279, complete genome 1341 100% 0.0 99% 1
EU443098.1 Meiothermus ruber strain CBS-01 trehalose
synthase (treS) gene, complete cds 1341 100% 0.0 99% 1
C
HM587953.1 Meiothermus sp. SK3-2 trehalose synthase
(treS) gene, partial cds 1055 100% 0.0 100% 0
CP001743.1 Meiothermus ruber DSM 1279, complete genome 1055 100% 0.0 100% 0
EU443098.1 Meiothermus ruber strain CBS-01 trehalose
synthase (treS) gene, complete cds 1055 100% 0.0
100% 0
D
EU443098.1 Meiothermus ruber strain CBS-01 trehalose
synthase (treS) gene, complete cds 1288 100% 0.0 99% 1
HM587953.1 Meiothermus sp. SK3-2 trehalose synthase (treS)
gene, partial cds 1282 100% 0.0 99% 1
CP001743.1 Meiothermus ruber DSM 1279, complete genome 1282 100% 0.0 99% 1
pMTresSR
HM587953.1 Meiothermus sp. SK3-2 trehalose synthase
(treS) gene, partial cds 939 100% 0.0 100% 0
EU443098.1 Meiothermus ruber strain CBS-01 trehalose
synthase (treS) gene, complete cds 939 100% 0.0
100% 0
Kết quả ở bảng 3.1. cho thấy các đoạn trình tự trên plasmid pET-TreS mà chúng tôi tạo dòng được giải với các mồi A, B, C, D, pMtreSR có tương đồng cao (99%), trong đó có 2 đoạn tương đồng 100% với trình tự của gen Trehalose synthase của vi khuẩn Meiothermus ruberđã công bố.
3.4. BIỂU HIỆN TRÊN E.COLI BL21(DE3)
Vector pET-TreS được biến nạp vào tế bào E.coli BL21(DE3) để biểu hiện. Protein TreS được biểu hiện ở dạng dung hợp đầu C với đoạn 6xHis. Sự biểu hiện protein TreS trong E coli BL21(DE3) bước đầu được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE và tiếp theo là Western blot. Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 110 kDa .
3.4.1. Chọn lọc dòng
Các dòng tế bào E.coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-Tresđược tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trường lỏng LB có chứa ampicilin 100 μg/ml, ở 370C qua đêm đến pha ổn định. Từ dịch nuôi cấy qua đêm chúng tôi tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin 100 μg/ml, lắc trong khoảng 4 giờ để OD600 đạt từ 0,6-1 và bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối cùng là 1 mM. Tiến hành nuôi lắc với tốc độ 200 rpm ở 370C trong khoảng 4h. Thu nhận tế bào, xử lý và điện di trên gel polyacrylamide có sự hiện diện của SDS và so sánh kích thước với thang protein chuẩn.
Hình 3.8. Điện di SDS-PAGE các dòng mang plasmid tái tổ hợp (giếng 1:
mẫu không bổ sung IPTG; giếng 2: thang Multicolor Broad Range Protein
Ladder, giếng 3,4,5,6 các dòng tương ứng 1, 2, 3, 4)
Kết quả phân tích SDS-PAGE trên hình 3.8. cho thấy xuất hiện một vạch protein đậm có kích thước khoảng 110 kDa ở giếng 3, 4, 5, 6 (giếng số 4 tương đương với dòng số 2 có băng đậm nhất) trong khi ở giếng đối chứng (mẫu không có bổ sung IPTG) không có sự xuất hiện của băng này. Như vậy bước đầu chúng tôi đã biểu hiện thành công vector tái tổ hợp pET-TreS trong vi khuẩn E.coli
BL21(DE3). Đồng thời, kết quả điện di SDS-PAGE cũng cho thấy dòng số 2 cho kết quả biểu hiện tốt nhất trong cùng một điều kiện so với các dòng khác. Vì vậy, chúng tôi chọn dòng số 2 để tiếp tục khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu cho việc tổng hợp protein. 110 KDa 140 KDa 100 KDa
3.4.2. Kết quả Western blot
Để khẳng định chắc chắn khả năng biểu hiện của gen TreS, chúng tôi tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể đặc hiệu. Mẫu sau khi được phân tích trên gel polyacrylamide, chuyển sang màng nitrocellulose, phản ứng với kháng thểđặc hiệu (kháng thể kháng His) và sau đó được gắn với protein A gắn peroxidase, hiện màu bằng TMB. Kết quảđược trình bày trong hình 3.14.
Hình 3.9. Kết quả phân tích Western blot(giếng 1: thang Multicolor Broad Range Protein Ladder ; giếng 2,3 mẫu có biểu hiện TreS; giếng 4 mẫu không có
bổ sung IPTG)
Kết quả trên hình 3.9. cho thấy ở 2 giếng 2 và 3 tương ứng với mẫu plasmid có mang vector tái tổ hợp cho băng rất rõ có kích thước 110 KDa trong khi giếng 4( mẫu không được cảm ứng IPTG) không có tín hiệu. Như vậy, chúng tôi đã biểu hiện thành công gen TreSở vi khuẩn E.coli BL21(DE3).
140 KDa 100 KDa
3.4.3. Khảo sác các điều kiện cảm ứng tối ưu 3.4.3.1. Khảo sát chất cảm ứng
Với các điều kiện cảm ứng tương tự như trên nhưng sử dụng lactose để cảm ứng biểu hiện của gen TreS thay cho chất cảm ứng IPTG. Hình điện di SDS- PAGE 3.10. cho thấy sự cảm ứng biểu hiện bằng IPTG vẫn cho kết quả tốt hơn so với chất cảm ứng lactose. Do vậy, chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng IPTG cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.
Hình 3.10. Kết quảđiện di SDS-PAGE plasmid pET-TreS với 2 chất cảm
ứng (giếng1: cảm ứng với lactose; giếng 2: cảm ứng với IPTG; giếng 3: thang Multicolor Broad Range Protein Ladder; giếng 4: mẫu không bổ sung IPTG)
110 KDa
140 KDa
3.4.3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng
Để xác định nồng độ IPTG tối ưu cho việc biểu hiện của gen TreS, chúng tôi tiến hành thử nghiệm lần lượt với các nồng độ IPTG tương ứng là 0,2 mM, 0,4 mM, 0,6 mM, 0,8 mM và 1 mM. Cùng với sự thay đổi về nồng độ IPTG, các điều kiện khác cần cho sự cảm ứng protein đều không thay đổi: nuôi lắc ở tốc độ 200 rpm; nhiệt độ nuôi lắc 37oC, thời gian cảm ứng 4h.
Hình 3.11. Kết quảđiên di SDS-PAGE mẫu plasmid tái tổ hợp với các nồng
độ IPTG khác nhau (giếng 1: mẫu không bổ sung IPTG; giếng 2: thang
Multicolor Broad Range Protein Ladder; giếng 3: 0,2 mM; giếng 4: 0,4 mM;
giếng 5: 0,6 mM; giếng 6: 0,8 mM; giếng 7: 1.0 mM)
Kết quảđiện di trên hình 3.11. cho thấy ở giếng số 6 tương ứng với nồng độ IPTG là 0,8 mM, băng protein biểu hiện 110 kDa xuất hiện đậm nhất. Như vậy, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,8 mM là thích hợp cho sự biểu hiện của gen TreS.
110 KDa
140 KDa 100 KDa
3.4.3.3. Khảo sát thời gian cảm ứng
Thời gian cảm ứng cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự thu nhận protein. Với nồng độ IPTG tối ưu là 0.8 mM đã khảo sát ở trên, thời gian cảm ứng cũng được tiến hành khảo sát với 3 khoảng thời gian là 2h, 4h, 6h. Mẫu được nuôi lắc với tốc độ 200 rpm ở 37oC, dịch nuôi cấy sau đó đã được lấy ở các thời điểm 2h, 4h và 6h, xử lý và điện di SDS-PAGE. Kết quả điện di trên hình
3.12. cho thấy ở giếng số 4 tương ứng với thời gian cảm ứng 4h là tối ưu nhất cho sự biểu hiện của gen TreS.
Hình 3.12. Điện di SDS-PAGE thời giam cảm ứng ( giếng 1: thang Multicolor Broad Range Protein Ladder; giếng 2 mẫu không bổ sung IPTG;
giếng 3: 2h; giếng 4: 4h; giếng 5: 6h)
110 KDa 100 KDa
3.4.3.4. Khảo sát vận tốc lắc cảm ứng
Cùng với chất cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng thì vận tốc nuôi lắc cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự cảm ứng tổng hợp protein của gen
TreS. Với nhiệt độ nuôi lắc là 37oC cùng với các điều kiện cảm ứng tối ưu đã khảo sát ở trên: chất cảm úng tối ưu IPTG, nồng độ chất cảm ứng ITPG tối ưu là 0,8 mM, thời gian cảm ứng tối ưu là 4h, , chúng tôi tiến hành biểu hiện với 3 vận tốc lắc khác nhau là 150, 200, 250 rpm. Kết quảđược thể hiện ở hình 3.13.
Hình 3.13. Điện di SDS-PAGE vận tốc lắc cảm ứng (giếng 1: mẫu không bổ
sung IPTG; giếng 2 thang Multicolor Broad Range Protein Ladder; giếng 3: 150
rpm; giếng 4: 200 rpm; giếng 5: 250 rpm)
Hình điện di SDS-PAGE 3.12. cho thấy ở giếng số 4 tương ứng với vận tốc lắc là 200 rpm là cho băng 110 kDa đậm nhất. Như vậy, 200 rpm là vận tốc lắc tối ưu cho việc biểu hiện của gen TreS ở E.coli BL21(DE3).
110KDa
140KDa 100KDa
3.4.3.5. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng
Yếu tố cuối cùng có khả năng ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện của gen
TreS chính là nhiệt độ nuôi lắc. Với tất cả các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu ở trên: chất cảm ứng tối ưu IPTG, nồng độ IPTG 0.8 mM, tốc độ lắc tối ưu 200 rpm, thời gian cảm ứng tối ưu 4h chúng tôi tiến hành nuôi lắc ở 3 nhịệt độ khác nhau là 20oC, 30oC, 37oC. Kết quảđiện di được thể hiện trong hình 3.14.
Hình 3.14. Điện di SDS-PAGE nhiệt độ cảm ứng (giếng 1: 20oC; giếng 2: 30oC; giếng 3 37oC; giếng 4: mẫu không bổ sung IPTG; giếng 5: thang
Multicolor Broad Range Protein Ladder)
Ở giếng số 2 tương ứng với nhiệt độ nuôi lắc là 30oC, băng protein là đậm nhất. Như vậy, sự cảm ứng tổng hợp protein của gen TreS là tốt nhất khi được nuôi lắc ở 30oC.
110 KDa
140 KDa 100 KDa
Như vậy, tổng hợp các điều kiện cảm ứng tối ưu ở trên chúng tôi kết luận rằng điều kiệm cảm ứng tối ưu cho sự tổng hợp enzyme Trehalose synthase ở vi khuẩn Meiothermus ruber là nồng độ cảm ứng IPTG 0,8 mM, nuôi lắc với tốc độ 200 rpm ở 30oC trong 4h.
Hình 3.15. Điện di SDS-PAGE điều kiện cảm ứng tối ưu (giêng 1: mẫu cảm ứng ởđiều kiện tối ưu; giếng 2: mẫu không bổ sung IPTG; giếng 3:
thang Multicolor Broad Range Protein Ladder)
110 KDa
100 KDa 140 KDa
Chương 4
4.1. Kết luận
Chúng tôi đã phân lập được chủng vi khuẩn Meiothermus ruber từ các mẫu suối nước nóng thu thập được thừ suối nước nóng Bình Châu (Bà Rịa Vũng Tàu).
Phân lập được đoạn gen mã hóa enzyme Trehalose synthase với cặp mồi pMtreSF và pMtreSR.
Tạo được dòng trung gian mang gen TreS (pJet-TreS) Tạo được dòng tái tổ hợp mang gen TreS (pET-TreS) Kiểm tra trình tự của sản phẩm tạo dòng pET-TreS
Biểu hiện thành công protein dung hợp pET-TreS ở vi khuẩn E.coli
BL21(DE3)
Xác định được các điều kiện cảm ứng tối ưu cho sự biểu hiện protein ở gen Trehalose synthase ở vi khuẩn Meiothermus ruber là nồng độ cảm ứng IPTG 0.8 mM, nuôi lắc với tốc độ 200 rpm ở 30oC trong 4h.
4.2. Kiến nghị
Tiến hành tinh sạch enzyme Trehalose synthase tái tổ hợp
Xác định hoạt tính của enzyme trehalose synthase tái tổ hợp thu được Xác định các điều kiện ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]Hồ Huỳnh Thùy Dương (2000), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
[2]Vũ Thị Hằng (2010), Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme”, khóa luận tốt nghiệp, Viện Đại Học Mở Hà Nội.
[3] Dương Huy Hoàng (2005), Phân lập, định danh vi khuẩn ưa nhiệt ở một số
suối nước nóng khu vực phía nam - Việt Nam, luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên tp Hồ Chí Minh.
[4] Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa, Trần Cát Đông (2008), Giáo trình sinh học phân tử - Tài liệu giảng dạy sau đại học, Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[5] Alan D.Elbein, Y.T.Pan, Irena Pastuszak, and David Carroll (2003), New insights on trehalose: a multifunctional molecule, Glycobiology, 13(4), pp. 17R- 27R.
[6]Argu¨ elles JC. (2000), Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts: a comparative analysis, Arch Microbiol, 174(4), pp.217–224.
[7]Avonce N, Mendoza Vargas A, Morett E, Iturriaga G (2006), Insights on the evolution of trehalose biosynthesis, BMC Evolutionary Biology, Biol 6:109.
[8]Canovas D, Fletcher SA, Hayashi M, Csonka LN. (2001), Role of trehalose in growth at high temperature of Salmonella enterica serovar Typhimurium, J
Bacteriol, 183(11), pp. 3365–3371.
[9] Cardoso FS, Gaspar P, Hughenholtz J, Ramos A. & Santos H (2004), Enhancement of trehalose production in dairy propionibacteria through manipulation of environmental conditions, Int J Food Microbiol, 91(2), pp.195– 204.
[10]Chen J., Abbott P.J. (2010), WHO Food Additives Series 46: Trehalose,
International Programme on Chemical Safety, World Health Organization.
[11]Claire Vieille and Gregory J. Zeikus (2001) Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 65(1), pp. 1-43.
[12] De Smet KA, Weston A, Brown IN, Young DB, Robertson BD (2000), Three pathways for trehalose biosynthesis in Mycobacteria, Microbiology, 146(1), pp. 199–208.
[13] Filipa S. Cardoso, Rute F. Castro, Nuno Borges and Helena Santos (2007), Biochemical and gentic characterization of the pathways for trehalose metabolism in Propionibacterium freudenreichii, and their role instress response, Microbiology, 153(1), pp.270–280.
[14] Frederick M Ausubel, Roger Brent, Robert E Kingston, David D Moore, JG Seidman, John A Smith, Kevin Struhl (1992), Short protocols in molecular
biology, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, New York.