Cấy 1 khuẩn lạc E.coli vào 10ml môi trường LB, lắc ở 37oC qua đêm. Cấy chuyền 100 μl dịch nuôi cấy E.coli qua đêm vào 100 ml môi
trường LB. Lắc 250 rpm ở 37oC. Đo OD600 mỗi giờ.
Khi OD đạt đến 0,35-0,4, đặt tế bào lên đá. Để lạnh trong 20-30 phút, thỉnh thoảng khuyấy đều để chắc chắn rằng các tế bào đều lạnh.
Tiếp đó chuyển dịch nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50 ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000 rpm trong 5 phút.
Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12,5 ml) dung dịch 50 mM CaCl2. Lắc nhẹđể làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phút trên đá. Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên và cho vào 1/10 thể tích (2,5ml) dung dịch 100 mM CaCl2
và làm tan hoàn toàn cặn. Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerol bảo quản ở -70oC.
Biến nạp:
Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µl DNA. Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt trong 30 giây ở 42oC. Sau sốc nhiệt bổ sung thêm 250 µl môi trường SOC và lắc ở 37oC trong 1h. Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biến nạp trên trải trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (Amp 100 µg/ml) và để phát triển qua đêm ở 37oC. Sàng lọc các dòng mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR khuẩn lạc.
Tất cả các thao tác và dụng cụđều thực hiện ởđiều kiện vô trùng.