Quan sát các băng dưới tia cực tím, dùng dao lam cắt phần gel chứa vạch DNA mong muốn và tiến hành tinh chế bằng bộ kít Wizard SV Gel và PCR Clean- up system của hãng Promega. 2.2.8.Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn Trong một eppendorf 0,5ml đã tiệt trùng: Nước khử ion tiệt trùng 16,3 µl RE 10X buffer 2,0 µl Acetylated BSA 10 µl/ml 0,2 µl
DNA, 1μg/ml 1,0 µl RE 10u/ µl 0,5 µl Thể tích cuối cùng 20 µl
Trộn nhẹ nhàng bằng micropipet, spin eppendorf và ủở 37oC trong 1-4 giờ
2.2.9. Phản ứng ghép nối đoạn DNA vào vector pJet1.2 blunt
Sản phẩm PCR sau khi tinh chếđược nối vào vector pJet 1.2 theo qui trình của bộ kit pJet clone kit của hãng Fermentas.
Hình 2.3. Vector Pjet1.2 blunt
2.2.10. Phản ứng nối đoạn DNA chèn vào vector pET-22b
Trước hết đoạn DNA chèn và vector đã thủy giải bởi các RE được đo nồng độ bằng máy đo nồng độ (nanodrop), từđó tính tỉ lệ DNA chèn và vector theo công thức sau:
Vector ng của vector × kb của đoạn DNA chèn
Đoạn chèn kb của vector × ng của đoạn DNA chèn
Lượng DNA trong phản ứng lai không được quá 200 ng và thể tích tổng cộng thường là 10-20 μl.
Sau khi đã tính tỉ lệ, tiến hành phản ứng lai trong một eppendorf 0.5ml;
Vector x μl
Đoạn DNA chèn y μl
Ligation buffer 10X 1,0 μl T4 DNA ligase ( 3u/ μl) 0,5 μl Nước khử ion tiệt trùng vừa đủ thểtích 10 μl
2.2.11. Chuyển DNA vào E.coli bằng phương pháp hóa biến nạp
Hóa biến nạp là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao. Cơ chế biến nạp chủ yếu bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể tiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp nhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả biến.
2.2.11.1. Nguyên tắc
Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA. Tạo hỗn hợp vi khuẩn với DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao (42oC). Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và cố định trong tế bào vi khuẩn. Bổ sung thêm môi trường SOC. Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứa môi trường có bổ sung kháng sinh.
2.2.11.2. Cách tiến hành Chuẩn bị tế bào khả biến: Chuẩn bị tế bào khả biến:
Cấy 1 khuẩn lạc E.coli vào 10ml môi trường LB, lắc ở 37oC qua đêm. Cấy chuyền 100 μl dịch nuôi cấy E.coli qua đêm vào 100 ml môi
trường LB. Lắc 250 rpm ở 37oC. Đo OD600 mỗi giờ.
Khi OD đạt đến 0,35-0,4, đặt tế bào lên đá. Để lạnh trong 20-30 phút, thỉnh thoảng khuyấy đều để chắc chắn rằng các tế bào đều lạnh.
Tiếp đó chuyển dịch nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50 ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000 rpm trong 5 phút.
Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12,5 ml) dung dịch 50 mM CaCl2. Lắc nhẹđể làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phút trên đá. Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên và cho vào 1/10 thể tích (2,5ml) dung dịch 100 mM CaCl2
và làm tan hoàn toàn cặn. Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerol bảo quản ở -70oC.
Biến nạp:
Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µl DNA. Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt trong 30 giây ở 42oC. Sau sốc nhiệt bổ sung thêm 250 µl môi trường SOC và lắc ở 37oC trong 1h. Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biến nạp trên trải trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (Amp 100 µg/ml) và để phát triển qua đêm ở 37oC. Sàng lọc các dòng mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR khuẩn lạc.
Tất cả các thao tác và dụng cụđều thực hiện ởđiều kiện vô trùng.
2.2.12.Ly trích DNA plasmid của E.coli theo phương pháp DNA-spin
Các khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid được tiến hành tách chiết theo hướng dẫn của bộ kít DNA-spin của hãng Intron Biotechnology.
2.2.13. Kiểm tra sản phẩm tạo dòng
Mẫu plasmid tái tổ hợp pET-TreS sau khi được tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng phương pháp PCR, cắt với RE. Sau đó, mẫu plasmid cùng với các mồi
pMtreSF, pMtreSR, A, B, C,D được gửi giải trình tự tại Công ty Biotek Nam Khoa – thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả giải trình tự đoạn chèn TreS được so sánh với trình tự trên ngân hàng dữ liệu thuộc trung tâm Quốc gia về Thông tin Công Nghệ Sinh học của Mỹ (NCBI)
2.2.14. Biểu hiện protein tái tổ hợp
Cấy chuyển từ khuẩn lạc đơn, dòng tế bào E. coli BL21(DE3) mang vectơ biểu hiện pET-Tres sang 5 ml môi trường lỏng LB có chứa ampicilin 100 μg/ml, nuôi lắc 370C qua đêm đến pha ổn định. Từ dịch nuôi cấy qua đêm cấy chuyển 1 ml sang bình 500 ml chứa 100 ml LB lỏng và kháng sinh ampicilin100 μg/ml, nuôi lắc 370C, sau 2 giờ (OD600nm = 0,6), môi trường được bổ sung chất cảm ứng IPTG (nồng độ cuối cùng 1 mM) và tiếp tục nuôi lắc 200 v/phút. Tế bào được thu sau 4 giờ cảm ứng và kiểm tra mức độ biểu hiện bằng điện di SDS-PAGE.
2.2.15.Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE) 2.2.15.1 Nguyên tắc 2.2.15.1 Nguyên tắc
Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽđược nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Vì vậy, những protein chênh lệch về khối lượng có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE.
2.2.15.2. Cách tiến hành
Gắn khung đổ gel theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Pha gel tách 12%: trong một ống falcon 15 ml hoặc 50 ml cho vào các thành phần theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần gel tách polyacrylamide 12% (10 ml)
Thành phần Nước cất Resolving gel Acrylamide 30% APS 10% TEMED Thể tích 3,5 ml 2,5 ml 4,0 ml 50 µl 5 µl Dùng pipet cho dung dịch gel vào khuôn, phủ trên lớp gel một lớp nước cất.
Để yên khoảng 30 phút cho polyme hóa hoàn toàn.
Sau khi phần gel tách polyme hóa hoàn toàn, đổ bỏ và thấm bằng giấy thấm cho hết lớp nước phủ trên gel tách.
Pha gel gom 4,5%: Trong một ống falcon 15 ml hoặc 50 ml cho vào các thành phần theo bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần gel gom polyacrylamide 4.5% ( 5ml)
Thành phần
Nước cất
Stacking gel buffer 4X Acrylamide 30% APS 10% TEMED Thể tích 3 ml 1,25 ml 0,75 ml 25 µl 10 µl Dùng pipet cho dung dịch vào khuôn, cài lược vào. Để yên khoảng 30 phút
cho polyme hóa hoàn toàn.
Pha mẫu: trộn mẫu protetin với dung dịch đệm nạp mẫu 4X theo tỉ lệ 3:1 trong ống 1,5 ml. Đun sôi 3-5 phút, để ngay vào đá sẵn sàng cho chạy gel. Các mẫu này có thể bảo quản ở -20oC trong 6 tháng.
Lấy lược ra từ từđể tránh làm vỡ gel.
Rửa gel với dung dịch đệm chạy gel, lật ngược giá gel để cho ráo giếng, rồi cho gel vào bình chạy.
Dùng micropipet cho 10-15 μl mẫu pha vào giếng. các giếng phải được cho cùng một thể tích dung dịch đệm loading. Ở các giếng không cần cũng được cho cùng một thể tích dung dịch đệm loading 1X.
Chạy điện di với hiệu điện thế không đổi là 100V cho đến khi vạch màu xanh của bromophenol trong dung dịch đệm nạp mẫu chạy đến mép dưới của gel. Nhuộm gel bằng dung dịch xanh Coomassie G250 trong 1 giờ. Các băng
protein xuất hiện trong khi nhuộm.
Giải nhuộm gel bằng dung dịch acid acetic 10% cho đến khi xuất hiện các băng. Đọc kết quả.
2.2.16. Phân tích protein bằng phương pháp Western blot 2.1.16.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật Western blot gồm hai bước: Điện di protein trên gel polyacrylamide và chuyển (blot) protein từ gel vào màng nitrocellulose và phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu.
2.1.16.2. Cách tiến hành
Điện chuyển thẩm protein từ gel lên màng nitrocellulose.
Gel SDS-PAGE sau khi chạy điện di xong, lấy ra khỏi hệ thống chạy gel và ngâm trong dung dịch đệm chuyển màng trong 15 phút.
Ngâm màng và giấy thấm trong dung dịch đệm chuyển trong 5 phút.
Sắp xếp hệ thống chuyển màng theo thứ tự : một miếng giấy thấm dày (có cùng kích thước với gel và màng), màng nitrocellulose, gel, một miếng giấy thấm dày khác. Sau mỗi lớp đặt, dùng pipet lăn trên bề mặt để đuổi bọt khí có thể có.
Đậy nắp của hệ thống chuyển màng.
Điều chỉnh dòng điện nguồn để có dòng điện 400 mA và chạy trong thời gian 60 phút.
Tắt nguồn điện và lấy màng ra.
Ủ màng trong 20 ml dung dịch khóa màng (3% sữa gầy) trên máy lắc nhẹ trong 1-2 giờ. Rửa màng bằng dung dịch rửa.
Ủ màng với 20 ml dung dịch kháng thể thứ 1.
Đổ bỏ dung dịch ủ. Rửa màng 3 lần với dung dịch rửa, lắc nhẹ 10 phút/lần. Ủ màng trong 20 ml dung dịch protein A, lắc trong 1-2 giờở nhiệt độ phòng.
Rửa như trên.
CHƯƠNG 3:
3.1. PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER Từ SUỐI NƯỚC NÓNG NƯỚC NÓNG
Các mẫu suối nước nóng ở Bình Châu – Phước Bửu (Bà Rịa – Vũng Tàu) sau khi được lấy được nuôi tích lũy trong môi trường dịch thể CS-TYE ở nhiệt độ 55oC - 60oC, pH trong khoảng từ 7,2-7,6. Dịch nuôi cấy sau đó được pha loãng và cấy ria trên môi trường thạch, ủ ở nhiệt độ 55oC để tiến hành phân lập và làm thuần. Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ của vi khuẩn Meiothermus ruber: khuẩn lạc có màu đỏ, hình tròn, bề mặt phẳng trơn láng nhô cao. Quan sát sơ bộ dưới kính hiển vi và tiến hành nhuộm gram để quan sát hình thái tế bào.
A B
Hình 3.1. Khuẩn lạc (A) và hình dáng tế bào (B) vi khuẩn Meiothermus ruber
Vi khuẩn Meiothermus ruber hình que dài, đứng riêng lẻ không xếp thành cụm, không di động, gram âm, có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 45-65oC, pH trong khoảng từ 5,0-9,0. Để khẳng định chính xác chủng vi khuẩn chúng tôi phân lập được chính là vi khuẩn Meiothermus ruber, chúng tôi tiến hành gửi giải trình tự gen 16S ở công ty Nam Khoa và kết quảđược tra cứu trên Blast search. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn chúng tôi phân lập được chính là Meiothermus ruber (phụ lục 1)
3.2. THU NHẬN GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER
DNA chủng vi khuẩn Meiothermus ruber sau khi được tinh chế tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi pMtreSF và pMtreSR. Việc thiết kế cặp mồi này dựa trên nghiên cứu của Wei và cộng sự (2009) [35]. Cặp mồi này khuyếch đại đoạn gen Tres có chiều dài 2895 bp và có chứa vị trí cắt của enzyme NdeI và EcoRI.
Hình 3.2. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR ( giếng 1: thang chuẩn MassRuler DNA ladder Mix, giếng 2: mẫu dương, giếng 3 mẫu âm)
Kết quảđiện di trên hình 3.2. cho thấy sản phẩm PCR có 1 băng duy nhất có kích thước đúng như dự kiến. Trong khi đó ở mẫu âm, không có tín hiệu. Như vậy cặp mồi đặc hiệu do chúng tôi thiết kế có thể dùng để thu nhận trình tự gen mục tiêu đúng như trình tự lý thuyết.
2895 bp 3000 bp
3.3. TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE VÀO VECTOR pET- 22b
3.3.1. Chèn gen TreS vào pJet1.2blunt
Muốn gen hoạt động và biểu hiện ra sản phẩm protein, gen phải nằm trong một kết cấu hoàn chỉnh gồm: Promoter, vùng gắn của ribosome, codon mở đầu, codon kết thúc và vùng kết thúc phiên mã. Bởi vậy, để gen TreS biểu hiện thành công, trình tự DNA mang mã di truyền của TreS phải được lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên vector pET-22b.
Trước hết, trình tự của gen TreS được chúng tôi nối ghép vào vector tách dòng pJET1.2 blunt để nhân lên lượng lớn. Đây là vector tách dòng thế hệ mới của hãng Fermetas có kích thước gần 3kb (2974bp). Trên vector có gắn gen kháng kháng sinh (bla) nên chỉ có những tế bào có mang vector này mới có thể sống được trên môi trường có Ampicilin. Đồng thời trên vector này còn có chứa gen gây chết
eco47IR mã hóa cho nuclease phân hủy DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy, vector khi được gắn thêm gen ngoại lai sẽ làm mất đi hoạt tính của enzyme này dẫn đến sự không phân hủy DNA của tế bào chủ. Nhờ có eco47RI mà quá trình chọn lọc plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn.
Việc sử dụng enzyme Taq polymerase trong các phản ứng PCR sẽ tạo ra các sản phẩm có gắn thêm một A ởđầu 3’. Sản phẩm PCR này sau đó sẽđược dòng hóa vào vector pJet1.2 blunt theo qui trình dành cho nối đầu dính và biến nạp vào vi khuẩn E.coli BL21(DE3). Các tế bào khả biến này được nuôi cấy trên môi trường LB có bổ sung Amp (100 μg/ml) ở 37oC qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc. Để xác định xem các plasmid này thực sự có mang đoạn gen TreS
hay không, chúng tôi tiến hành PCR colony trên 9 khuẩn lạc với cặp mổi pMtreSF và pMtreSR.
Hình 3.3. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR colony các mẫu plasmid pJet-TreS (giếng 1: mẫu âm; giếng 2: mẫu PCR dương; từ giếng 3 đến giếng 10:
các mẫu plasmid chiết từ 1 đến 9)
Kết quả trên hình 3.3. cho thấy trong 9 plasmid mà chúng tôi tiến hành PCR, có 3 plasmid 5, 7, 8 là có xuất hiện băng có kích thước 2895 bp (tương ứng với mẫu dương tính là sản phẩm PCR chuẩn). Như vậy chỉ có 3 plasmid này mang gen TreS.
Như vậy, bước đầu chúng tôi đã tách dòng thành công gen TreS trong vector pJet1.2 blunt. Các plasmid này sau đó được chúng tôi tiến hành nuôi cấy trong môi trường lỏng, tách chiết và tinh sạch.
3.3.2. Chèn gen TreS vào pET-22b
Plasmid chứa trình tự đoạn gen TreS sau khi được tinh sạch được cắt với enzyme cắt hạn chếđể thu lại đoạn gen TreS làm nguyên liệu chèn vào vector pET - 22b. Vectơ pET-22b (+) có chiều dài 5493 bp , được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E. coli. Vector pET-22b(+) mang gen lac I mã hoá cho protein lac repressor, can thiệp vào quá trình điều hoà hoạt động của promoter trên vector và được cảm ứng bằng cơ chất tổng hợp IPTG.
Plasmid pJet-TreS (kích thước khoảng 5870bp) được cắt với 2 enzyme NdeI và EcoRI để thu lại đoạn gen TreS. Tuy nhiên do kích thước của vector pJet1.2 2895 bp
blunt tương đương với kích thước đoạn gen (2974 bp và 2895 bp) nên trong phản ứng cắt chúng tôi dùng thêm enzyme Vsp I để cắt nhỏ pJet.
Hình 3.4. Vị trí cắt của Vsp 1 trên vector pJet1.2/blunt
Enzyme Vsp I sẽ cắt vector pJet1.2/blunt thành 2 đoạn nhỏ, trong khi đó nó