Báo cáo nghiên cứu khoa học: "THU NHẬN POLY - HYDROXYBUTYRATE, MỘT LOẠI NHỰA SINH HỌC DỄ PHÂN HỦY, TỪ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM" ppt

THU NHẬN POLY -  HYDROXYBUTYRATE, MỘT LOẠI NHỰA SINH HỌC DỄ PHÂN HỦY, TỪ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM PRODUCTION OF POLY -  -  HYDROXYBUTYRATE, A BIODEGRADABLE POLYMER, BY METHYLOBACTERIUM SP. ISOLATED IN VIETNAM LÊ LÝ THÙY TRÂM Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng KIỀU PHƯƠNG NAM, BÙI VĂN LỆ Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh TÓM TẮT PHB (poly--hydroxybutyrate), một loại nhựa sinh học chịu nhiệt, dễ phân hủy, đang được quan tâm như là một nguồn thay thế lý tưởng cho nhựa tổng hợp bởi nó có các tính chất tương tự nhựa tổng hợp. PHB được tích lũy trong tế bào nhiều loài vi sinh vật với hàm lượng khác nhau. Chủng Methylobacterium sp. (kí hiệu Mcd), được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây chanh dây tạp nhiễm vi khuẩn màu hồng, có thể phát triển trên môi trường khoáng căn bản với methanol 1% là nguồn C và lượng PHB tạo ra chiếm 31,37 % tổng lượng sinh khối khô sau 4 ngày nuôi cấy. Sản xuất PHB theo con đường sinh học từ nguồn C rẻ tiền (methanol) đang mở ra một hướng nghiên cứu và ứng dụng mới đầy triển vọng ở nước ta hiện nay. ABSTRACT PHB (poly--hydroxybutyrate), a biodegradable thermoplastic material, has been considered as an attractive substitute for petroleum-derived synthetic plastic because it has properties similar to synthetic plastic. PHB can be accumulated intracellularly in a wide range of microorganisms at different levels. Methylobacterium sp. (Mcd for short) has been isolated from the culture medium of water lemon (Passiflora sp.) in vitro contaminated by pink- pigmented bacteria. Mcd is capable of growing in a basal mineral medium containing 1 % (v/v) methanol as a sole source of carbon, yielding PHB which accounts for 31.37% of its dry weight after 4 days of culture. The production of PHB by means of the biological method using methanol, one of the cheapest substrates, is currently opening a new and promising approach for research and application in Vietnam. 1. MỞ ĐẦU Một trong những tác nhân chính gây ô nhiễm môi trường là nguồn chất thải rắn như bao bì, vật liệu nhựa từ các polymer tổng hợp… Các vật liệu này rất khó bị phân hủy và do đó tồn tại rất lâu trong đất, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Giải pháp khắc phục hiện nay là nghiên cứu và tìm ra các nguồn vật liệu mới để thay thế. Trong đó, các loại polymer sinh học có khả năng bị phân hủy nhanh nhờ các loài vi sinh vật đang rất được quan tâm. Thuộc trong nhóm PHAs (poly hydroxyalkanoates), các polyester có tính chất tương tự nhựa tổng hợp, PHB đang được quan tâm đặc biệt do chúng có độ dẻo và tính chịu nhiệt cao (nhiệt độ nóng chảy xấp xỉ 170 0 C)[3]. Đặc biệt, PHB rất dễ được phân hủy tự nhiên nhờ các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PHB như là nguồn Carbon và năng lượng cho các hoạt động sống của nó[1]. PHB là một nguồn Carbon dự trữ trong tế bào ở một số loài vi sinh vật: Alcaligenes eutropha, Pseudomonas sp., Methylobacterium sp., Bacillus sp., Rhodospirillum rubrum…[1]. Năm 1982, công ty hóa chất ICI đã thương mại hóa sản phẩm PHB từ Rastonia eutropha. Tuy nhiên giá thành của sản phẩm vẫn còn khá cao do sử dụng nguồn nguyên liệu là đường nguyên chất (glucose) và acid propionic. Do vậy, việc ứng dụng sản phẩm đại trà vẫn còn nhiều hạn chế [1]. Ý tưởng nghiên cứu của nhóm chúng tôi xuất phát từ việc phân lập được chủng vi khuẩn Methylobacterium sp., là nhóm vi khuẩn sắc tố hồng, có khả năng sử dụng methanol làm nguồn cung cấp Carbon và tổng hợp PHB theo con đường biến dưỡng serine. Từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền (methanol) có thể sản xuất được PHB, một sản phẩm nhựa có giá trị ứng dụng, chúng tôi hy vọng sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường hiện nay. 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng vi khuẩn, môi trường nuôi cấy và điều kiện tăng trưởng Chủng vi khuẩn được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây chanh dây bị tạp nhiễm vi khuẩn có sắc tố hồng trên môi trường MMS có bổ sung 1% methanol. Chủng thuần được phân tích các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái, kết hợp với giải trình tự vùng 16S rDNA nhằm tiến hành định danh. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này thuộc chi Methylobacterium (kí hiệu là Mcd). Môi trường nuôi cấy được sử dụng có thành phần như sau: 1% (v/v) methanol, 0,1 g/L cao nấm men, 1 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,45 g/L MgSO 4 .7H 2 O, 1,305 g/L KH 2 PO 4 , 4,02 g/L Na 2 HPO 4 , 3,3 mg/L CaCl 2 .2H 2 O, 1,3 mg/L FeSO 4 .7H 2 O, 30 g/L H 3 BO 3 , 40g/L, CoCl 2 .6H 2 O, 40g/L Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 40g/L CuSO 4 .5H 2 O, 130 g/L ZnSO 4 .7H 2 O, 100 g/L MnSO 4 .H 2 O, pH =7.[2] Khuẩn lạc được cấy vào các erlen 250mL chứa 100mL môi trường, nuôi lắc 150v/p ở nhiệt độ 29 ± 1 0 C. Tiến hành ly tâm thu sinh khối ở 8500v/p trong 20 phút vào các thời điểm khác nhau (24h, 48h, 72h, 96h và 120h). Sinh khối được sấy khô hoàn toàn ở 65 0 C và cân trọng lượng. 2.2. Xác định hàm lượng PHB trong sinh khối vi khuẩn Sau khi ester hóa chuyển PHB về dạng -hydroxybutyric methyl ester, hàm lượng PHB trong sinh khối vi khuẩn ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau được xác định bằng phương pháp sắc ký khí (GC - Gas Chromatography) với acid benzoic là chất nội chuẩn [5]. Đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn là PHB (hãng Aldrich,USA) 2.3. Tách chiết PHB Đồng nhất 0,1g sinh khối khô thành bột mịn, sau đó hòa trong 3mL NaOCl 5% và vortex mạnh cho đến khi sinh khối trắng hoàn toàn. Sau đó, bổ sung 4mL chloroform, vortex đều và ủ ở 60 0 C trong 60 phút. Ly tâm 8000v/p trong 15 phút để thu nhận phân lớp chloroform có hòa tan PHB. Để bay hơi chloroform tự nhiên thu được một dạng bột trắng. 2.4. Xác định cấu trúc và các đặc điểm lý hóa của sản phẩm thu được Cấu trúc của sản phẩm tách chiết được xác định thông qua phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR). Nhiệt độ nóng chảy được xác định bằng máy DSC (Different Scanning Calori) và phân tử lượng của sản phẩm được xác định bằng phương pháp sắc ký lọc gel (GPC – Gel permeation chromatography). 3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN 3.1. Sự tăng trưởng và hàm lượng PHB tích lũy trong sinh khối thay đổi theo thời gian nuôi cấy 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian (h) Sinh khối khô, PHB (g/l môi trườ ng) Sinh khối khô Hàm lượng PHB Đồ thị 1: Sự thay đổi sinh khối khô và hàm lượng PHB tích lũy trong tế bào ở các thời điểm khác nhau Từ đồ thị có thể nhận thấy, sau 5 ngày nuôi cấy, sinh khối vẫn tiếp tục gia tăng, trong khi, hàm lượng PHB đạt cực đại ở ngày thứ 4 (0,252 g/L môi trường, chiếm 31,37% tổng sinh khối khô vi khuẩn) và sau đó giảm dần. Như vậy, trong giai đoạn đầu, khi nguồn C còn dồi dào, vi khuẩn sử dụng chính methanol làm nguồn C để sinh trưởng và tích lũy PHB. Tuy nhiên, sau ngày thứ 4, có lẽ nguồn C trong môi trường đã cạn kiệt nên vi khuẩn sử dụng chính PHB tích lũy trong tế bào làm nguồn C dẫn tới sự suy giảm hàm lượng PHB trong nội bào. Từ kết quả này, chúng tôi cũng đã thử nghiệm tăng hàm lượng methanol bổ sung vào môi trường lên 2%, tuy nhiên tốc độ tăng trưởng lại giảm so với methanol 1%. Rất có thể, nồng độ methanol 2% có ức chế đến sự tăng trưởng tế bào. Thử nghiệm bổ sung methanol 1% vào môi trường sau ngày thứ 4 cho kết quả sinh khối vẫn không tăng đáng kể trong các ngày thứ 6 và thứ 7. Điều này có thể là do lượng dinh dưỡng tổng cộng trong môi trường đã cạn kiệt. Như vậy trong điều kiện nuôi cấy đã khảo sát, chủng Mcd tích luỹ PHB cực đại vào ngày thứ 4 nuôi cấy. 3.2. Kết quả tách chiết PHB Từ kết quả khảo sát hàm lượng PHB trong sinh khối qua các thời điểm khác nhau, sinh khối sau 4 ngày nuôi cấy được chọn để tách chiết PHB. Sau khi ly tâm, có sự hình thành 3 phân đoạn: lớp trên cùng là NaOCl, lớp giữa là cặn tế bào đã bị cắt bới NaOCl nhưng không tan trong chloroform và lớp dưới cùng là chloroform có hòa tan PHB. Hàm lượng bột trắng thu được so với tổng sinh khối khô đem chiết chỉ đạt khoảng 20-25%. So sánh với kết quả xác định hàm lượng PHB trong sinh khối bằng phương pháp GC (31,37%) cho thấy có sự chênh lệch. Sai số này có thể giải thích là do sự hao hụt sản phẩm trong quá trình tách chiết do chưa có các thiết bị chuyên dùng. Hình 1. Bột trắng thu được sau khi tách chiết từ 0,1 g sinh khối khô vi khuẩn 3.3. Xác định cấu trúc và đặc điểm lý hóa của sản phẩm thu nhận được Kết quả phổ hồng ngoại IR (hình 2) cho thấy có đỉnh hấp thu (cm -1 ) 1725,42 tương ứng với nhóm chức C=O có trong sản phẩm Hình 2. Phổ IR của sản phẩm PHB thu nhận Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) cho phép khẳng định sản phẩm thu được chính là PHB. Hình 3. Phổ 13 C-NMR với các mũi tương ứng 4 loại C trong cấu trúc của PHB CDCl 3 1 3 2 4 O CH CH 3 CH 2 C O 1 2 3 4 n CDCl 3 1 3 2 4 O CH CH 3 CH 2 C O 1 2 3 4 n O CH CH 3 CH 2 C O O CH CH 3 CH 2 C O 1 2 3 4 n 1 2 3 4 n Hình 4. Phổ 1 H-NMR với các mũi tương ứng với 3 loại H trong cấu trúc của PHB * Các đặc tính lý hóa của sản phẩm Các thông số PHB tách chiết PHB chuẩn (Aldrich,USA) Mw (g/mol) 1.2793 x10 5 7.0464x10 5 D (độ đa phân tán) 3.8034 3.2738 Bảng 1. So sánh các thông số về phân tử lượng bằng phương pháp GPC của sản phẩm và chất chuẩn Từ bảng 1 cho thấy sản phẩm có độ đồng nhất về phân tử lượng tương ứng với chất chuẩn. Tuy nhiên, phân tử lượng của sản phẩm thu được vẫn còn thấp hơn nhiều so với chất chuẩn (PHB từ Alcaligenes sp.). So sánh với PHB tách chiết từ Methylobacterium sp. B3-Bp có Mw là 2,5x10 5 [1] cho thấy sản phẩm thu nhận được cũng không có sự chênh lệch phân tử lượng quá lớn. Điều này cũng phù hợp với kết quả ghi nhận của một số công trình nghiên cứu cho thấy PHB từ Methylobacterium sp. có phân tử lượng không cao lắm. Kết quả DSC xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm là 167 0 C so với PHB chuẩn (hãng Aldrich, USA) là 175 0 C. Sự chênh lệch về phân tử lượng có thể làm giảm nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm, tuy nhiên chênh lệch này là không đáng kể và sản phẩm thu nhận vẫn đáp ứng được tính chất của một loại nhựa chịu nhiệt. 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Các kết quả đạt được cho thấy chúng tôi đã bước đầu thành công trong việc tách chiết PHB từ vi khuẩn Methylobacterium sp Mcd. Sản phẩm thu được có các tính chất hóa lý tương tự như PHB chuẩn. Trong hướng nghiên cứu sắp đến chúng tôi sẽ khảo sát thêm ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng lên sự tích lũy PHB trong tế bào với hy vọng sẽ tăng cao hiệu suất thu nhận PHB. Đồng thời sẽ nghiên cứu tạo dạng đồng polymer (PHBV: poly- hydroxybutyrate co poly- - hydroxyvalerate) nhằm gia tăng phân tử lượng của sản phẩm, tăng độ đàn hồi để có thể đưa sản phẩm vào ứng dụng. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Anderson AJ, Dawes EA, Occurrence, metabolism, metabolic role and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates, Microbiological Rewiews, p.450-472, 1990. [2] Bourque D., Pomerleau Y., Groleau D., High-cell-density production of poly-  - hydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium extorquens: production of high-molecular-mass PHB, Appl Microbiol Biotechnol 44: p367-376, 1995. [3] Lundgren D.G., Alper R., Schnaitman C., Marchessault R.H., Characterization of poly-  -hydroxybutyrate extracted from different bacteria, Journal of Bacteriology, 1965. [4] Kim Pil, Kim Jung-Hoe, Oh Deok-Kun, Improvement in cell yield of Methylobacterium sp. by reducing the inhibition of medium components for poly-  - hydroxybutyrate production, Journal of Microbiol and Biotech 19:357-361, 2003. [5] Riis V, Mai W., Gas chromatographic determination of poly-  -hydroxybutyric acid in microbiol biomass after hydrochloric acid propanolysis, Journal Chromatogr, 445:285 -289, 1988. . NHẬN POLY -  HYDROXYBUTYRATE, MỘT LOẠI NHỰA SINH HỌC DỄ PHÂN HỦY, TỪ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. PHÂN LẬP TẠI VI T NAM PRODUCTION OF POLY -  -  HYDROXYBUTYRATE, A BIODEGRADABLE POLYMER,. PHB (poly- -hydroxybutyrate), một loại nhựa sinh học chịu nhiệt, dễ phân hủy, đang được quan tâm như là một nguồn thay thế lý tưởng cho nhựa tổng hợp bởi nó có các tính chất tương tự nhựa tổng. trà vẫn còn nhiều hạn chế [1]. Ý tưởng nghiên cứu của nhóm chúng tôi xuất phát từ vi c phân lập được chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. , là nhóm vi khuẩn sắc tố hồng, có khả năng sử dụng methanol