Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc đồng bằng sông cứu long

Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc đồng bằng sông cứu long



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA

CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ VÀO CÁC THỜI ĐIỂM KHÁC NHAU THUỘC

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007

SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ HÙNG DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007



XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA

CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ VÀO CÁC THỜI ĐIỂM KHÁC NHAU THUỘC

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Th.S NGUYỄN DIỄM THƢ Th.S NGUYỄN THỊ HIỀN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007

iii

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

TS Nguyễn Văn Hảo đã hết lòng hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tại Viện

Th.S Nguyễn Diễm Thư, Th.S Nguyễn Thị Hiền, Th.S Nguyễn Mạnh Thắng, KS Nguyễn Thị Mộng Hoàng, KS Phạm Hồng Lan, KS Lê Văn Tám, KS Nguyễn Thị Hồng Vân, KS Hà Thị Ngọc Nga đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực tập

Ban Giám Đốc Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ, và các anh chị công nhân viên chức Trung tâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập

Các bạn sinh viên Đại học Nha Trang lớp Nuôi Trồng Thủy Sản một, hai khoá 2003 – 2008, các bạn sinh viên Đại học An Giang khoá 2004 - 2008, các bạn sinh viên lớp Nuôi Trồng Thuỷ Sản 30, Ngư Y 30 đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ công việc với tôi trong suốt quá trình thực tập

Bạn Phạm Văn Hùng, Nguyễn Thời Duy, Lê Thanh Tú, Nguyễn Thị Đang, Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Thảo Sương, Đinh Thị Thuỳ Trang

Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi trong quá trình học tập và trong suốt quá trình thực tập

Sinh viên thực hiện LÊ HÙNG DŨNG

iv

nước ngọt tại đồng bằng sông Cửu Long Bệnh đốm trắng trên cá tra với các triệu chứng điển hình như việc xuất hiện các đốm trắng ở gan, thận, lách đang diễn ra khá phổ biến và gây thiệt hại đáng kể cho người nuôi Nhằm hạn chế thiệt hại cũng như giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trên cá tra nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác

nhau thuộc đồng bằng sông Cửu Long" Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến 8 năm 2007 tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

Sau khi thu mẫu bệnh phẩm ngoài hiện trường, định danh vi khuẩn bằng phương pháp định danh truyền thống và phương pháp PCR, thử nghiệm lại độc lực

của vi khuẩn phân lập được (Edwarsiella ictaluri) và xác định liều gây chết 50%

(LD50) của vi khuẩn này trên cá tại phòng thí nghiệm Tiến hành sản xuất thử nghiệm vacxin kháng bệnh đốm trắng trên gan, thận lách cá tra bằng cách bất hoạt tế bào vi khuẩn bằng 0,4% formol kết hợp với hai chất bổ trợ là Montanide ISA 70M-PG và phèn chua nhằm đánh giá tính an toàn của các chất bổ trợ này và khả năng sinh miễn dịch của các loại vacxin trên Những kết quả đạt được:

 Vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG không hiệu quả, không có tính an toàn

 Vacxin với chất bổ trợ phèn chua bước đầu thử nghiệm có độ an toàn, có khả năng tạo sức đề kháng và tạo đáp ứng miễn dịch cho cá tra mang mầm bệnh đốm trắng Nồng độ vacxin thích hợp cho cá tra với chất bổ trợ phèn chua là 3x109 CFU/cá

v

becomes one of aqua-species with highly economic value in Mekong Delta However, diseases had been occurred, particularly the white spot disease (WSD) with typical signs such as white spots of different sizes on liver, kidney and spleen The outbreak in Tra-catfish caused unbenefied for fish farms To reduce the risks for Tra-catfish farm as well as the antibiotics overused, we carry out this topic: “Determination of immune response on Tra-catfish and the efficacy of different

vaccines against Edwardsiella ictalluri isolated from different areas and times in

Mekong Delta” This topic was performed from 3 to 8/2007 in Research Institute for Aquaculture II

After collecting fish samples in different areas on fish farms, biochemical tests and PCR analyses, challenge test to identify 50% lethal dose (LD50) of

Edwardsiella ictalluri in wetlab We carried out the experiments on vaccines with

oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG and alum adjuvant to evaluate the immunizarion and safety of these vaccines The results showed that:

 Vaccine with oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG is not effective and safe

 While vaccine with alum adjuvant is safe, can induce the immune

response of fish and increase its resistance to Ed ictaluri A suitable

concentration of vaccine with alum adjuvant determined is 3 x109 CFU/ fish

vi TRANG TỰA

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cá tra Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878 3

2.2.1.1 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas 5

2.2.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas .6

2.2.1.3 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella 6

2.3.3.2 Tại Việt Nam 14

2.3.4 Các phương pháp sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá 15

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.3.3 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn sống 21

3.3.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm 22

3.3.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm 22

3.3.6 Phương pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn 22

3.3.7 Phương pháp vi ngưng kết xác định hiệu giá kháng thể 24

3.3.8 Phương pháp xử lý thống kê 25

3.4 Bố trí thí nghiệm 25

3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu .25

3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn 27

3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua 27

viii

4.1 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin

với chất bổ trợ nhũ dầu 29

4.2 Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn 35

4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua 36

4.3.1 Kết quả theo dõi bệnh tích lâm sàng của cá 37

4.3.2 Kết quả phản ứng vi ngưng kết xác định hiệu giá kháng thể 40

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

1 Tài liệu tiếng Việt 46

2 Tài liệu tiếng nước ngoài 47

3 Tài liệu từ internet 47 PHỤ LỤC

ix

Bảng 3 3 Bố trí thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn 27

Bảng 3 4 Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ phèn chua 28

Bảng 4 1 Thí nghiệm 1: Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức 29

Bảng 4 2 Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 1 30

Bảng 4 3 Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn 35

Bảng 4 4 Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 2 35

Bảng 4 5 Kết quả thí nghiệm 3 - Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ chết của từng nghiệm thức 36

Bảng 4 6 Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 3 36

Bảng 4 7 Kết quả giá trị hiệu giá kháng thể trung bình thí nghiệm 3 40

Hình 3 2 Thao tác lấy máu cá 23

Hình 3 3 Thao tác lấy mẫu vi khuẩn trên thận 23

Hình 3 4 Sơ đồ cụ thể hóa các bước tiến hành phản ứng vi ngưng kết 25

Hình 3 5 Hệ thống bố trí bể kính thí nghiệm 26

Hình 4 1 Cá bị lở loét ngay vùng bụng 32

Hình 4 2 Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng 32

Hình 4 3 Cá có biểu hiện xuất huyết bên ngoài 38

Hình 4 4 Cá có dấu hiệu xuất huyết xoang bụng 38

Do những ưu điểm của cá tra như dễ nuôi, mau lớn, sức chống chịu tốt, nhu cầu tiêu thụ trong và ngoài nước lớn, đem lại thu nhập cao nên chúng bắt đầu được nuôi rộng rãi ở các vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL)

Hiện nay, với diện tích ao bè nuôi cá tra ngày càng tăng nhanh, cá được nuôi

tạo cho các bệnh nhiễm khuẩn phát triển và lây lan mạnh như bệnh đốm trắng nội tạng, bệnh xuất huyết trên cá tra… Việc dùng kháng sinh để điều trị bệnh như hiện nay tốn kém, không cho hiệu quả cao và lượng tồn dư kháng sinh ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm Để hạn chế các thiệt hại do bệnh nhiễm khuẩn gây ra và nâng cao chất lượng sản phẩm trong nước đặc biệt là xuất khẩu thì sử dụng vaxcin phòng bệnh trở thành biện pháp thay thế, đang được nghiên cứu và dần dần đưa vào áp dụng trong thực tế Với mong muốn góp phần vào việc ổn định nghề nuôi trồng thuỷ sản và do nhu cầu cấp thiết của thực tế chúng tôi tiến hành đề tài "Xác định

tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc

ĐBSCL"

1.2 Mục đích và yêu cầu

Xác định tính sinh miễn dịch của các loại vacxin và hiệu quả của chúng đối

với vi khuẩn Ed ictaluri được phân lập trên cá tra ở các vùng địa lí vào các thời

điểm khác nhau:

 Xác định hiệu quả của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70 M-PG và chất bổ trợ phèn chua về độ an toàn, khả năng tạo đáp ứng miễn

dịch và khả năng bảo hộ trên cá tra đối với vi khuẩn Ed ictaluri

 Sử dụng phương pháp vi ngưng kết xác định hiệu giá kháng thể đối với thí nghiệm dùng chất bổ trợ phèn chua

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cá tra Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những loài cá có giá trị kinh

tế quan trọng và được nuôi rộng rãi ở khu vực ĐBSCL Cá tra có khả năng chịu đựng môi trường nước khắc nghiệt, thích nghi rộng với nhiều loại thức ăn Tốc độ tăng trưởng khá nhanh: 0,7 - 1,5 kg/năm Mật độ nuôi trong ao có thể đạt tới 15 - 20

Trước đây giống cá tra được vớt ở sông Cửu Long (vùng giáp giới với Campuchia) Đến nay tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, việc nuôi cá bè phân bố ở một nửa số tỉnh của vùng trong đó cá tra thường được nuôi ở các bè cỡ lớn (Phạm Văn Khánh, 2000)

râu hàm dưới ngắn hơn ¼ chiều dài đầu Vây lưng và vây ngực của cá tra có gai cứng, có răng cưa ở mặt sau Điểm khởi đầu của vây lưng gần đối xứng với vây bụng Vây hậu môn tương đối dài Thân cá có màu xám hơi xanh trên lưng, bụng có màu trắng hơi bạc (Phạm Văn Khánh, 2000)

2.1.3 Đặc điểm sinh sản

Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá tra từ 3 - 4 năm, thường sinh sản vào tháng 5 - 7 hàng năm Cá tra có tập tính bơi ngược dòng đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục Các bãi đẻ thường nằm ở vùng Kratie của Campuchia (www.fistenet.com.vn)

Cá mẹ nặng 8 – 10 kg/con có sức sinh sản thực tế 3 - 6 vạn trứng/con, cá nặng 3,2 kg/con có sức sinh sản tương đối 139 - 150 ngàn trứng/con (Phạm Văn Khánh, 1997)

Trong sinh sản nhân tạo, cá được nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên, cá tra có thể phát dục 1 – 3 lần trong một năm (Phạm Văn Khánh, 2000)

2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra

Gần đây, diện tích và sản lượng nuôi cá tra, basa ở vùng ĐBSCL càng mở rộng Đối tượng nuôi này không chỉ là kế sinh nhai của hàng triệu người dân, mà còn là ngành kinh tế mũi nhọn; không chỉ là nguồn thực phẩm cho người tiêu dùng, mà còn là mặt hàng xuất khẩu chiến lược với giá trị kim ngạch năm 2006 đạt đến gần 737 triệu USD, đứng thứ 2 sau xuất khẩu tôm (www.fistenet.com.vn)

Sản lượng tăng đều đặn qua từng năm tương ứng từ 86.700 tấn (1999) 110.000 tấn (2001) lên gần 210.000 (2003) rồi đến 375.500 tấn (2005) và năm 2006 vừa qua đã đạt mức 825.000 tấn Nguồn này cung cấp cho tiêu thụ nội địa và chế biến xuất khẩu của 70 nhà máy có công suất chế biến khoảng 1,5 triệu tấn/năm

Tại thời điểm tháng 6/2007 diện tích nuôi cá tra, ba sa của 8 tỉnh ĐBSCL đã trên 4.800 ha vượt so với cuối năm 2006 đến 2.484 ha (www.vietlinh.com.vn)

Về xuất khẩu, trong tháng 5/2007, các doanh nghiệp Việt Nam đã xuất 27.700 tấn, kim ngạch đạt 79 triệu USD, tăng khá mạnh so với cùng kỳ năm 2006 Và tổng kim ngạch xuất khẩu cá tra, basa của Việt Nam 5 tháng đầu năm đã đạt gần 375 triệu USD (www.vietlinh.com.vn)

2.2 Các bệnh thường gặp trên cá tra 2.2.1 Bệnh nhiễm khuẩn

2.2.1.1 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas

- Tác nhân gây bệnh: là các loài thuộc giống Aeromonas: A hydrophila, A

caviae, A sobria (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005)

- Dấu hiệu bệnh lý: Khi cá mắc bệnh, vùng bụng bị sẫm màu, xuất hiện từng

mảng đỏ trên cơ thể, hoại tử đuôi và các vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi mờ đục và sưng phù, xoang bụng chứa dịch nội tạng hoại tử (Từ Thanh Dung, 1994)

- Phòng trị: Tránh tạo ra các tác nhân cơ hội như nhiễm ký sinh trùng, tránh

làm xây xát cá, mật độ nuôi quá dày, Dùng thuốc tím tắm cá, liều dùng là 4 ppm

lặp lại sau 3 ngày và tắm cá theo định kì (Bùi Quang Tề và ctv., 1999) Ngoài ra, cũng có thể dùng các loại kháng sinh (Oxytetracyline, Streptomycin, Sulfamid, Kanamycin) trộn vào thức ăn để trị bệnh cho cá (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005)

2.2.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas (bệnh đốm đỏ)

- Tác nhân gây bệnh: P fluorescens, P anguiliseptica, P chlororaphis (Bùi

Quang Tề và ctv., 1999)

- Dấu hiệu bệnh lý: Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp

mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất

huyết vây và hậu môn, Pseudomonas spp xâm nhập vào cơ thể sẽ phá hủy các mô,

các chức năng trong cơ thể, khi các cơ quan bị phá hủy có thể gây chết đến 70 - 80% (Từ Thanh Dung, 1994).

- Phòng trị: Giảm mật độ nuôi, cung cấp nguồn nước tốt, tắm 3 - 5 ppm KMnO4

trong một khoảng thời gian, có thể dùng các loại kháng sinh để điều trị như trong

bệnh nhiễm khuẩn huyết do Aeromonas (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan,

2005)

2.2.1.3 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella (Edwarsiellosis)

- Tác nhân gây bệnh: Do Edwardsiella tarda (Bùi Quang Tề và ctv., 1999) - Dấu hiệu bệnh lý: Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da, đường kính

khoảng 3 – 5 mm Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị tưa rách Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ chung quanh Bệnh xuất hiện khi chất lượng nước trong môi trường

C (Từ Thanh Dung, 1994)

- Phòng trị: Giữ sạch môi trường nước nuôi, giảm mật độ nuôi, có thể dùng các

loại kháng sinh để điều trị như trong bệnh nhiễm khuẩn huyết do Aeromonas (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005)

2.2.1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng

Bệnh này xuất hiện đầu tiên trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 (Ferguson và ctv., 2001) và từ đó đã gây thiệt hại nghiêm trọng đến nghề nuôi cá tra thâm canh Khi cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao từ 10 – 90% (Từ Thanh Dung và ctv., 2003)

Hình 2 2 Cá tra nhiễm bệnh đốm trắng

- Tác nhân gây bệnh: Tác nhân được biết tới là Hafnia alvei, Plesiomonas

shigelloides (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003) hoặc Ed ictaluri (Từ Thanh Dung

và ctv., 2003).

+ H alvei thuộc họ Enterobacteriacea, là trực khuẩn tròn 2 đầu, đường kính

1 µm, dài 2 - 5 µm, gram âm (-), di động nhờ lông mao, yếm khí không bắt buộc, có

C (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003)

+ P shigelloides thuộc họ Enterobacteriacea, là trực khuẩn tròn 2 đầu, kích

thước 0,8 - 1,0 x 3,0 µm, gram âm (-), di động, kỵ khí không bắt buộc, có 2 cơ chế biến dưỡng lên men hoặc hô hấp Trên môi trường thạch dinh dưỡng hoặc thạch

máu P shigelloides có đường kính 1,0 - 1,5 µm, màu xám, nhẵn bóng, hình ovan

(trích từ Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003)

+ Vi khuẩn Ed ictaluri thuộc họ Enterobacteriacea phân lập từ cá tra là vi

khuẩn gram âm (-), không di động, lên men, không oxy hoá Cho phản ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxidase (Từ Thanh Dung và ctv., 2003) Theo

C Vi khuẩn này được phân lập lần đầu tiên trên cá nheo Mỹ (Hawke, 1979) Tuy nhiên, những biểu hiện bệnh lý trên cá nheo hoàn toàn khác so với trên cá tra nhiễm bệnh (Từ Thanh Dung và ctv., 2003)

Hình 2 3 Vi khuẩn Edw ictaruli dưới kính hiển vi quang học

Hình 2 4 Cá tra bệnh

- Dấu hiệu bệnh lý:Bệnh hoại tử cơ quan nội tạng ở cá tra được mô tả với biểu hiện bệnh là các điểm hoại tử màu trắng đục chủ yếu ở thận, lách, gan của cá tra, đường kính dao động từ 1 - 3 mm Bệnh gây chết hàng loạt và tỉ lệ chết rất cao, xảy

ra từ giai đoạn cá hương đến giai đoạn cá thịt và giảm dần sau giai đoạn 5 tháng tuổi.

Dấu hiệu biểu hiện bên ngoài như: cá bơi lờ đờ quanh bờ, xuất huyết, lồi mắt, bỏ ăn, Những đốm trắng thường xuất hiện đầu tiên và nhiều ở thận Khi cá bệnh nặng, những tổ chức này bị huỷ hoại hoàn toàn Vì vậy, khi bệnh đã xảy ra việc dùng thuốc để điều trị chỉ có tác dụng đối với những con bị bệnh nhẹ, tuy nhiên việc điều trị cho hiệu quả thấp và thời gian bình phục lâu (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003)

- Phòng trị bệnh:

Biện pháp phòng bệnh thông thường nhất là bảo đảm tốt khâu môi trường ao nuôi, nguồn nước, giảm tác nhân gây bệnh…, dùng kháng sinh Oxytetracyline (55 – 77 mg/kg thể trọng cá, từ 7 – 10 ngày), Streptomycine (50 – 75 mg/kg thể trọng cá, từ 5- 7 ngày),…(www.fistenet.com.vn) Tuy nhiên, khi bệnh đã xuất hiện, thì biện pháp này tỏ ra không hiệu quả, tỉ lệ cá chết cao, do đó việc tiêm phòng vacxin cho cá trước để ngăn ngừa mầm bệnh là biện pháp mới và đang được triển khai nghiên cứu để giảm bớt tỉ lệ chết này (Từ Thanh Dung và ctv., 2003)

2.2.2 Bệnh ký sinh trùng 2.2.2.1 Bệnh trùng bánh xe

- Tác nhân gây bệnh: Thường gặp là 3 giống trùng: Trichodina, Tripartiella,

Trichodinella (Lê Như Xuân và ctv., 1994)

- Dấu hiệu bệnh lý: Khi mới mắc bệnh trên thân có nhiều nhớt màu hơi trắng

đục, mang cá đầy nhớt Cá thường nhô hẳn đầu lên mặt nước và lắc mạnh Những con bệnh nặng mang đầy nhớt và bạc trắng, cá bơi không định hướng, cá lật bụng mấy vồng, chìm xuống đáy ao và chết (Bùi Quang Tề và ctv., 1999)

- Phòng và trị bệnh: Giữ môi trường luôn sạch, mật độ nuôi không quá dày

Dùng CuSO4 ngâm cá bệnh 0,5 – 0,7 g/m3 hoặc tắm cho cá bệnh nồng độ 2 – 5 g/m3 trong 30 phút Dùng muối ăn 2 – 3% tắm cho cá 5 – 15 phút hoặc dùng formol liều lường 20 ppm tắm cho cá từ 5 – 15 phút (Từ Thanh Dung, 1994)

2.2.2.2 Bệnh trùng quả dưa

- Tác nhân gây bệnh: Do một giống tiêm mao trùng Ichthyophthiosis (Lê Như

Xuân và ctv., 1994)

- Dấu hiệu bệnh lý: Trùng ký sinh trên da, mang và vây của cá, bám thành các

hạt lấm tấm rất nhỏ, đường kính từ 0,5 – 1 mm Đồng thời, da và mang cá có nhiều nhớt màu sắc nhợt nhạt (Phạm Văn Khánh và ctv., 2005) Bệnh phát triển tốt ở nhiệt

- Phòng và trị bệnh: Định kỳ vệ sinh ao nuôi, không thả cá với mật độ quá dày

phun xuống ao cá bệnh hay 1 – 2

2.2.2.3 Bệnh trùng mỏ neo

- Tác nhân gây bệnh: Trùng gây bệnh gồm các loài thuộc giống Lernaea, có

dạng giống mỏ neo Ký sinh trên cá là con cái trưởng thành, thân dài 8 -16 mm Nhiệt độ trùng phát triển là 26 – 28oC (Bùi Quang Tề và ctv., 1999)

- Dấu hiệu bệnh lý: Cá nhiễm bệnh kém ăn gầy yếu, xung quanh chỗ trùng bám

viêm và xuất huyết Nơi trùng mỏ neo bám là điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập và phát triển (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005)

- Phòng trị bệnh: Kiểm tra cá trước khi thả vào ao nuôi Xử lý thuốc tím 10 –

2.2.2.4 Bệnh do sán lá đơn chủ ký sinh

- Tác nhân gây bệnh: Do hai giống Dactylogyrus (sán lá 16 móc) và

Gyrodactylus (sán lá 18 móc) (Bùi Quang Tề và ctv., 1999)

- Dấu hiệu bệnh lý: Sán lá đơn chủ bám chặt vào mang và niêm mạc của mang

để hút máu, gây viêm loét mang cá (Phạm Văn Khánh, 2000)

- Phòng trị bệnh: Không nên thả cá với mật độ dày, thường xuyên theo dõi chế

độ ăn của cá để điều chỉnh cho thích hợp Dùng nước muối tắm cho cá nhỏ 0,5 – 1 kg/100 lít nước và cá lớn 3 – 4 kg/100 lít nước trong 15 – 30 phút Dùng Dipterex

(Từ Thanh Dung, 1994)

2.2.2.5 Bệnh do giun sán nội ký sinh

-Tác nhân gây bệnh: gồm các loại giun đầu móc (Acanthocephola), sán dây

(Bothoricephalus), giun tròn (Philometra) (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh

Loan, 2005)

- Dấu hiệu bệnh lý: Giun chui vào và phá hoại tầng niêm mạc thành ruột, tạo

điều kiện cho vi khuẩn khác xâm nhập gây bệnh Đồng thời, giun hút chất dinh dưỡng làm cho cá chậm lớn và tiêu tốn thức ăn (Bùi Quang Tề và ctv., 1999)

- Phòng trị bệnh: Định kỳ vệ sinh ao nuôi Dùng Dipterex 8 – 10 g/100 kg cá

bệnh trộn vào thức ăn để tẩy giun (Phạm Văn Khánh, 2000)

2.2.2.6 Bệnh rận cá

- Tác nhân gây bệnh: Trùng gây bệnh là một số loài thuộc giống Argulus và

Alitropus (Bùi Quang Tề và ctv., 1999)

- Dấu hiệu bệnh lý: Rận cá ký sinh trên thân, da, vây xoang bụng và mang cá

hút máu làm da bị tổn thương, sưng đỏ tạo điều kiện cho tác nhân gây hại khác tấn công (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005)

- Phòng trị bệnh: Dùng thuốc tím với nồng độ 5 – 10 g/m3 trong thời gian 15 – 30 phút (Từ Thanh Dung, 1994)

2.2.3 Bệnh nấm thủy mi

- Tác nhân gây bệnh: Do hai giống nấm là Saprolegnia và Achlya (Từ Thanh

Dung, 1994)

- Dấu hiệu bệnh lý: Khi cá mắc bệnh, trên da cá xuất hiện những vùng trắng

xám, trên đó có các sợi nấm nhỏ, mềm, tua tủa (Từ Thanh Dung, 1994) Sau vài ngày sợi nấm phát triển đan chéo vào nhau thành búi trắng như bông có thể thấy bằng mắt thường (Lê Như Xuân và ctv., 1994)

- Phòng trị bệnh: Áp dụng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp: ao ương nuôi

phải được tẩy dọn kỹ, làm tốt công tác kỹ thuật nuôi, cách li cá bệnh để tránh sự lây lan (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005) Trị bệnh cho cá: tắm cá bệnh

trong nước muối 0,5 – 1 kg/100 lít nước cho cá hương và 2 – 3 kg/100 lít nước cho

cá lớn trong 10 – 15 phút (Lê Như Xuân và ctv., 1994)

2.3 Giới thiệu về vacxin phòng bệnh

2.3.1 Hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Để hiểu rõ tác dụng của vacxin trước hết chúng ta cần tìm hiểu về nguyên lí cơ bản của sự kích thích đối với hệ thống miễn dịch đặc hiệu Khả năng đáp ứng miễn dịch hay miễn dịch đặc hiệu gồm hai dạng:

+ Miễn dịch dịch thể: Khi có kháng nguyên vào cơ thể hai loại tế bào lympho T và B cùng tham gia vào quá trình tiêu diệt kháng nguyên Tế bào lympho B sẽ biệt hóa thành tế bào plasma và sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích Hoặc chúng biệt hóa thành các tế bào có khả năng trở thành tế bào plasma gọi là tế bào nhớ và khi có sự xâm nhập của kháng nguyên lần thứ hai, chúng sẽ tăng sinh nhanh và kết hợp với tế bào nhớ để tạo ra kháng thể nhanh hơn trong máu và đạt nồng độ cao hơn lần đầu tiên (Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992)

+ Miễn dịch qua trung gian tế bào: Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể kích thích dòng lympho T biệt hóa thành các loại tế bào như tế bào giết, tế bào sinh chất lymphokin, tế bào ức chế với những chức năng khác nhau, chúng tăng sinh nhanh với số lượng lớn nhằm tấn công kháng nguyên (Lê Văn Hùng, 2002)

2.3.2 Các loại vacxin:

Vacxin được chế tạo từ kháng nguyên của các tác nhân gây bệnh với mục đích phòng bệnh hay tạo miễn dịch cho cơ thể đáp ứng với bệnh trước khi có sự xâm nhập của mầm bệnh Hiện nay có ba loại vacxin được sử dụng rộng rãi: vacxin bất hoạt, vacxin sống nhược độc, ngoài ra vacxin DNA mới được sử dụng mấy năm gần đây và có nhiều triển vọng

2.3.2.1 Vacxin bất hoạt (chết)

Vacxin được chế tạo từ vi sinh vật chết hoặc đã bị bất hoạt bằng các phương pháp vật lý như chiếu xạ, nhiệt hay hóa chất để chúng không thể phát triển trong cơ thể và gây bệnh (Phạm Văn Ty, 2001)

2.3.2.2 Vacxin sống nhược độc

Các loại vacxin này được chế tạo từ các chủng vi sinh vật có độc lực thấp hoặc các chủng gây bệnh có độc lực cao bị làm yếu bằng phương pháp chọn lọc tự nhiên hoặc gây ra đột biến đối với những gen kiểm soát độc lực để chúng không còn có khả năng gây bệnh Tuy nhiên, các chủng vi sinh vật này vẫn còn sống và có thể gây ra một số phản ứng phụ, do vậy cần phải hết sức cẩn thận trong quá trình bảo quản và sử dụng vacxin sống (Lê Văn Hùng, 2002)

2.3.2.3 Vacxin DNA

Vacxin DNA được sản xuất dựa vào kỹ thuật DNA tái tổ hợp, vacxin này chứa gen mã hóa cho kháng nguyên bề mặt của nhiều loại vi sinh vật gây bệnh Trong thủy sản, vacxin DNA được tập trung nghiên cứu là vacxin phòng các bệnh virus (Gudding và ctv., 1999)

2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin 2.3.3.1 Trên thế giới

Vacxin cho cá được dùng thử vào những năm 30 của thế kỷ trước để nâng cao sức đề kháng cho cá chống lại dịch bệnh chủ yếu là trên đối tượng cá hồi Tuy nhiên, tới những năm 1970, do sự gia tăng các nông trại cá đặc biệt là các nông trại cá nước mặn, thì vacxin được chú trọng phát triển hơn nhằm ngăn ngừa, kiểm soát bệnh và vacxin đã được thương mại hóa từ thời gian này Lý do dùng vacxin là do điều trị hóa trị liệu tốn nhiều chi phí, hiệu quả của thuốc kháng sinh chỉ trong thời gian ngắn, nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh và đồng thời với những hiểu biết rõ ràng hơn về hệ thống miễn dịch của cá và về yếu tố độc lực chuyên biệt của mầm bệnh cá, những điều đó thúc đẩy sự nghiên cứu và sản xuất vacxin Đầu tiên là

những nghiên cứu về hệ thống đáp ứng miễn dịch của cá với các vi khuẩn Vibrio

anguillarum, Pseudomonas punctata, Bacterium salmonicida Hiện nay, vacxin

thương mại cho năm vi khuẩn: Y ruckeri, V anguillarum, V orrdalii, A

salmonicida và V salmonicida gây ra bệnh Vibriosis của cá vùng lạnh, vacxin này

chống lại các mầm bệnh do vi khuẩn Y ruckeri, V anguillarum, V orrdalii sản xuất

bởi Công ty Colorado, Wildlife Vaccines, Inc., được cho phép bởi USDA (United States Department of Agriculture) năm 1976 Mặc dù khi đó thành phần kháng nguyên kích thích sinh kháng thể của vacxin không được biết rõ, nhưng vacxin này vẫn được dùng phổ biến Vacxin có hiệu quả với nhiều đường sử dụng khác nhau nhưng được cấp phép cho phương pháp ngâm do có thể gây miễn dịch cho một lượng lớn cá nhỏ, không phải thao tác nhiều dẫn đến giá lao động thấp và tránh

được stress cho cá Đến 1981, vacxin kháng A salmonicida cũng được sản xuất bởi công ty trên, vacxin này ở ba hình thức: chỉ có một kháng nguyên A salmonicida, kháng nguyên A salmonicida với Y ruckeri, hoặc với V anguillarum và V orrdalii Mặc dù, vacxin này được đánh giá là có hiệu quả chống lại A salmonicida , nhưng

chúng lại không được thương mại hoá do tâm lý của người tiêu dùng vì vacxin này dùng phương pháp tiêm Nhưng những năm sau đó vacxin này nhanh chóng được sử dụng do xuất hiện bệnh furunculosis gây thiệt hại lớn cho các nông trại cá hồi ở Scotland và Na Uy Nền công nghiệp nuôi cá hồi ở đây tạo ra một thị trường đầy tiềm năng để sản xuất vacxin, và thực tế có một số lượng lớn công ty sản xuất vacxin ra đời ngay cả ở Bắc Mỹ và Âu châu Hiện tại, vacxin không đủ sức để kiểm

soát hai mầm bệnh quan trọng đặc biệt ở cá hồi: bệnh trên thận do Renibaterium

salmoninarum, bệnh nhiễm trùng máu rickettsial do Piscirickettsia salmoni Thêm

vào đó, vacxin cần phải chống lại ít nhất tám bệnh trên cá vây tia mà quan trọng là

bệnh xuất huyết đường ruột trên cá nheo do Ed ictaluri, bệnh nhiễm khuẩn cầu ruột ở các loài cá nước mặn do Enterococcus seriolicida và bệnh pasteurellosis do

Pasteurella piscida (Evelyn, 1997)

2.3.3.2 Tại Việt Nam

Ở nước ta, vacxin cho cá vẫn chưa được sử dụng, bước đầu chỉ có những nghiên cứu rải rác nhưng vẫn chưa được ứng dụng trong thực tế nghề nuôi cá Năm 2000, tập đoàn Intervet Nobio - Hà Lan có phối hợp với Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đánh giá khảo nghiệm bốn sản phẩm vacxin trên tôm sú nhưng kết quả cho thấy vacxin này không hiệu quả nên vẫn chưa được sử dụng (Lê Minh Hải và ctv., 2000) Ngoài ra còn có sự hợp tác nghiên cứu giữa công ty sản xuất

vacxin Pharma - Na Uy và tập đoàn Bayer trên cá tra và cá biển, nhưng cho đến nay vẫn chưa có thông tin cụ thể nào

2.3.4 Các phương pháp sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá 2.3.4.1 Tiêm

Cá thuộc nhóm động vật có xương sống có hệ miễn dịch giống hệ phòng vệ của động vật hữu nhũ và chim Cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu điều quan trọng trong việc phòng thủ chống lại mầm bệnh xâm nhiễm Các yếu tố bên ngoài có thể làm thay đổi kết quả miễn dịch của cá khi tiêm như liều lượng kháng nguyên, nhiệt độ, hoặc cá bị stress do cầm nắm Nhược điểm của phương pháp tiêm là không tránh được yếu tố stress cho cá, làm gia tăng mức corticosteroid hiện diện trong máu của cá hồi trong suốt giờ đầu và sau khi tiêm vacxin Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này là kích thích đáp ứng miễn dịch hoặc tạo ra miễn dịch bảo hộ trong môi trường tối ưu, cá đáp ứng nhanh với sự thay đổi của môi trường gây ra stress (Muiswinkel và Wiegertjes, 1997)

2.3.4.2 Ngâm

Ngâm là phương pháp thiết thực và hiệu quả nhất khi phòng bệnh cho cá với số lượng lớn, mặc dù cơ chế chính xác của hấp thụ kháng nguyên và bảo hộ vẫn chưa được rõ Phương pháp này bao gồm các kỹ thuật như phun, ngâm trực tiếp, tắm Các yếu tố ảnh hưởng tới việc hấp thụ kháng nguyên khi ngâm vacxin gồm có: nồng độ vacxin, thời gian ngâm, cỡ cá, stress, độ pH, nồng độ muối trong dung dịch vacxin, nhiệt độ nước, chất gây mê, chất bổ trợ được sử dụng và trạng thái kháng nguyên (hạt hoặc dạng hòa tan) Hầu hết các thử nghiệm về ngâm vacxin, kết quả cho thấy, kháng thể sinh ra không được phát hiện trong huyết thanh, ngay khi có sự xuất hiện thì cũng không có liên quan tới việc bảo hộ (Nakanishi và Ototake, 1997)

2.3.4.3 Cho ăn

Phương pháp cho ăn đơn giản là kháng nguyên trộn với thức ăn, thực hiện dễ dàng trên số lượng lớn cá ở tất cả các kích cỡ, tiết kiệm thời gian, công sức và tránh gây sốc cho cá Tuy nhiên, cấp vacxin bằng cách cho ăn đòi hỏi số lượng lớn kháng

nguyên và không xác định được liều lượng chính xác cho mỗi cá Nói chung, kết quả bảo hộ của phương pháp này yếu và trong thời gian ngắn (Quentel và Vigneulle, 1997)

2.3.5 Giới thiệu sơ lược về chất bổ trợ 2.3.5.1 Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ

Cơ chế tác động của chất bổ trợ dùng trong vacxin được giải thích như sau: + Chất bổ trợ có tác dụng gây viêm, kích thích quá trình thực bào, giúp quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra mạnh hơn

+ Các chất bổ trợ hấp thu kháng nguyên và thải kháng nguyên từ từ ra từ chỗ tiêm

+ Chất bổ trợ còn có tác dụng lên tế bào lympho T hỗ trợ

2.3.5.2 Các loại chất bổ trợ thông dụng

Chất bổ trợ kết hợp với kháng nguyên làm tăng cường hiệu quả của đáp ứng miễn dịch cho cá Chất bổ trợ Freund hoàn toàn và không hoàn toàn, dầu khoáng và lipopolysaccharide đã được sử dụng để tăng cường khả năng sản xuất kháng thể

Hiện nay, chất bổ trợ dầu khoáng được sử dụng có hiệu quả với vacxin được

chế tạo từ kháng nguyên Aeromonas salmonicide và vacxin đa giá có sự kết hợp 3 kháng nguyên Vibrio spp., Yersinia sp., A Salmonicide Chất bổ trợ này có tác dụng

giữ kháng nguyên lại dưới dạng hạt và sau đó giải phóng kháng nguyên từ từ ngay vùng bụng (Anderson, 1997) Theo nghiên cứu của Tyler và Klesius (1994), chất bổ

trợ nhũ dầu tiêm vào xoang bụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed ictaluri và có thể gây ra một số phản ứng phụ

Sự kết hợp giữa kháng nguyên và chất bổ trợ phèn chua bằng phương pháp

truyền thống khác nhau được sử dụng cho A salmonicide, Y ruckeri với kết quả

khác nhau Theo Udey và Fryer (1984), hỗn hợp phèn chua đã được sử dụng làm

chất bổ trợ với vacxin kháng Vibrioisis bằng phương pháp ngâm giúp gia tăng tiếp

thu kháng nguyên, nên được xem là có ý nghĩa trong việc gia tăng đáp ứng miễn

dịch cho cá Tuy nhiên, các nghiên cứu về sử dụng chất này để làm chất bổ trợ trong các loại vacxin cho cá hiện vẫn còn ít (Trích dẫn Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Từ tháng 3 đến tháng đầu tháng 6 năm 2007 tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ, Viện NC NTTS II

Từ cuối tháng 6 đến đầu tháng 8 năm 2007 tại Phòng vi khuẩn, Phòng sinh học phân tử thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện NC NTTS II

3.2 Vật liệu, Dụng cụ, Hóa chất 3.2.1 Vật liệu

1/ Mẫu cá giống

Cá giống gồm 966 con khoảng hai tháng tuổi, sạch bệnh, có kích cỡ từ 40 – 60 g được sản xuất và nuôi trong môi trường tốt nhất tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thuỷ Sản Nước Ngọt Nam Bộ (trực thuộc Viện NC NTTS II)

2/ Vi khuẩn

Ba chủng vi khuẩn Ed ictaluri phân lập tại ba địa điểm khác nhau xảy ra vào

thời điểm dịch bệnh, cá thu mẫu có những dấu hiệu bệnh tích điển hình như bơi lờ đờ, bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây; bên trong gan, thận, lách có nhiều đốm trắng nhỏ

Trong đó chủng vi khuẩn EI151 đã được phân lập, định danh (test sinh hoá, PCR) và xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá thí nghiệm là 22.500 tbvk/cá

tbvk/cá)

Bảng 3 1 Ba chủng vi khuẩn Ed ictaluri phân lập ở các thời điểm khác nhau

Phân lập từ gan cá tra (57 – 60g) Cá bỏ ăn, mang bị trắng; bên trong máu có màu hồng nhạt, gan có đốm, thận không sưng

Các thiết bị - dụng cụ cho gây nhiễm thực nghiệm: Bể xi măng, Máy sục khí;

Các bể kính dung tích 200L, vợt, lưới, xô, Cân phân tích, Bơm tiêm, Kéo, Kẹp, Ðèn cồn

Các thiết bị - dụng cụ cho phân tích mẫu: Kính hiển vi; Tủ lạnh; Máy lắc

(Stuart Scientific); Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen); Đĩa petri; Que cấy; Bình tam giác; Ống nghiệm; Ðĩa microplate 96 giếng (dạng hình chữ "U"); Pipetman và pipette

3.2.3 Hoá chất

- Dung dịch formalin 36 %; Dung dịch formol 0,4 % (Merck)

- Các chất bổ trợ: Montanide ISA 70 M-PG (Seppic, Pháp); Phèn chua (Merck, Mỹ)

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường nước thịt (NAVETCO); Môi trường

thạch máu (gồm môi trường tổng hợp thương mại và 7% máu cừu)

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị cá

Vệ sinh bể, bắt cá vào bể từ năm đến bảy ngày trước khi làm thí nghiệm Cá trước khi đưa vào bể phải được cân và đo để chọn đàn cá tương đối đồng nhất khi làm thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện nhiệt độ môi trường nước khoảng 28 -

vào lúc 6h và 17h, mỗi tuần thay bông lọc một lần cho máy lọc nước

3.3.2 Chuẩn bị vacxin

Nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn từ các ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu

lẻ cho vào bình cầu chứa 250 ml nước thịt dinh dưỡng, nuôi cấy trên máy lắc trong

khuẩn

Bất hoạt vi khuẩn: Vô hoạt huyền dịch này bằng dung dịch formol với tỉ lệ

hay không, ta cấy vi khuẩn mới bất hoạt lên môi trường thạch máu, nếu vi khuẩn không mọc, ta kết luận vi khuẩn đã bị bất hoạt

Thêm chất bổ trợ: Trộn dung dịch chất bổ trợ (theo hướng dẫn của nhà sản

, 109 và 3x109 tế bào vi khuẩn (TBVK)

3.3.3 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn sống

Vi khuẩn từ ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu, nuôi cấy từ 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC

Chọn khuẩn lạc to, đẹp, đứng riêng lẻ cho vào bình tam giác chứa 100 ml

CFU/ml) Ở độ pha loãng 10-2 thì

Xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống:

dịch có độ pha loãng như sau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 tương ứng với các kí hiệu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6

Từ mỗi độ pha loãng trên hút 20 µl nhỏ giọt lên đĩa thạch máu 7% (lặp lại hai lần), để khô rồi ủ ở 30°C trong 2 ngày

3.3.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm

Cá được thuần trong bể kiếng từ bảy đến 10 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm Gây nhiễm cho cá bằng cách tiêm vào xoang bụng Tiêm cá với thể tích cố định là 0,2 ml/cá Khi tiêm cá được gây mê bằng thuốc gây mê Ethylenglycol monophenylether nồng độ 0,17 ppm trong 2 – 3 phút Dùng kim tiêm 1 ml tiêm trực

(Hình 3.1)

Hình 3 1 Thao tác tiêm cá 3.3.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm

Sau khi gây nhiễm cá, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm thì chứng tỏ cá bị sốc do tiêm Theo dõi biểu hiện cá sau hai đến ba ngày gây nhiễm: cá bơi lờ đờ, bơi không định hướng, cá bỏ ăn, gầy yếu, ngoài ra xem cá có xuất huyết các vây và gốc vây; xuất huyết hậu môn, hốc mắt, mắt đỏ, viêm loét chỗ tiêm, Khi cá chết, giải phẫu cá có những biểu hiện xuất huyết nội tạng dẫn tới chảy máu xoang bụng, ruột chứa dịch vàng, xoang bụng chứa dịch trắng xem biểu hiện của các cơ quan bên trong như thận trước và sau, gan, lách sưng, nhũn, thâm đen, có mủ

3.3.6 Phương pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn 1/ Thu mẫu máu:

Dùng kim tiêm 1 ml tiêm vào động mạch chủ lưng, hướng kim nghiêng so với cá 30o, khi kim tiêm đụng xương cá thì dừng lại, đưa mũi kim lệch về phía

bụng, rút nhẹ pittông cho máu chảy lên (Hình 3.2) Lấy 0,6 ml máu/con cho vào eppendorf để lắng tách lớp, để qua đêm ở 4oC, rồi lấy phần huyết thanh cho vào

Hình 3 2 Thao tác lấy máu cá 2/ Thu mẫu vi khuẩn:

Khi cá lờ đờ, sắp chết, mổ khám và chọn những cá có dấu hiệu bệnh tích điển hình Tiến hành lấy mẫu vi khuẩn bằng cách dùng kéo vô trùng cắt phần thận

thí nghiệm để tiến hành phân lập, định danh vi khuẩn (Hình 3.3)

Hình 3 3 Thao tác lấy mẫu vi khuẩn trên thận

3.3.7 Phương pháp vi ngưng kết xác định hiệu giá kháng thể

Nguyên tắc: Phản ứng vi ngưng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên và

kháng thể đặc hiệu thể hiện dưới dạng các hạt nhìn thấy được Phản ứng này được thực hiện trên phiến nhựa 96 giếng Pha loãng dung dịch kích thích ngay trên các dãy vi giếng của phiến nhựa bằng dung dịch đệm PBS có 0,6% BSA, cho đồng nhất thể tích huyền dịch kháng nguyên, trộn đều để yên ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm Sau đó quan sát trực tiếp hoặc bằng kính lúp: nếu có mạng ngưng kết bao phủ đáy là phản ứng dương tính (+), ngược lại nếu kháng nguyên tụ xuống đáy giếng thành một lớp màu trắng là phản ứng âm tính (-)

Phương pháp:

+ Chuẩn bị kháng thể: huyết thanh được xử lí bằng cách đun cách thủy 56oC/32 phút để bất hoạt bổ thể

+ Chuẩn bị kháng nguyên: vi khuẩn từ ống thạch nghiêng đã nuôi cấy 36 -

Pha loãng 50 µl huyền dịch vi khuẩn sống bằng nước muối sinh lí 0,85% NaCl có 0,5 % formaline, nồng độ vi khuẩn bây giờ khoảng 108 - 109 tbvk/ml

Các bước tiến hành:

- Hút 50 µl dung dịch PBS 0,6% BSA vào các giếng từ hai đến 12 (Hình 3.4) - Giếng thứ nhất, gồm 90 µl dung dịch PBS 0,6% BSA và 10 µl huyết thanh, độ

pha loãng của huyết thanh là 1:10, trộn đều

- Sau đó, hút 50 µl dung dịch từ giếng thứ nhất chuyển lần lượt qua các giếng đến giếng 11 thì bỏ dung dịch này (không cho qua giếng 12 là giếng đối chứng) Như thế ta đã pha loãng bậc hai liên tiếp huyết thanh từ độ pha loãng đầu tiên Giếng 12 chỉ có 50 µl PBS 0,6% BSA (không có huyết thanh)

- Cho 50 µl huyền dịch vi khuẩn vào các giếng Gõ nhẹ bốn cạnh của phiến nhựa

đêm ở 4oC

3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu

Mục tiêu của thí nghiệm này là nhằm xác định khả năng sử dụng của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG của Seppic

- Bố trí sử dụng ba loại vacxin A, B, C tương ứng với chủng vi khuẩn kí hiệu lần lượt là Ei-23, Ei-151, Ei-338 (Bảng 3.2) Mỗi loại vacxin gồm bốn nghiệm thức, ba nghiệm thức sử dụng vacxin ứng với ba nồng độ 108, 109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức đối chứng sử dụng nước muối sinh lí Mỗi nghiệm thức tương ứng với hai bể, gồm 42 cá thí nghiệm Tổng số là 24 bể, 504 cá, trọng lượng trung bình của cá là 43,39 g

- Thời gian thí nghiệm: Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lượt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin và tiêm nước muối sinh lí cho các nghiệm thức đối