Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá

Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT DÙNG PHÕNG TRỊ BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA

(Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei.)

TRÊN CÂY CAO SU

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT DÙNG PHÕNG TRỊ BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA

(Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei.)

TRÊN CÂY CAO SU

TS TRẦN VĂN CẢNH TS PHAN PHƯỚC HIỀN

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2007

iii

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

TS Phan Phước Hiền, ThS Phan Thành Dũng và TS Trần Văn Cảnh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

KS Vũ Thị Quỳnh Chi cùng các cô chú, anh chị cán bộ công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam

Bạn Phạm Ngọc Chinh và bạn Nguyễn Ngọc Thanh Trang đã chia sẻ khó khăn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Phương

iv

TÓM TẮT

NGUYỄN VĂN PHƯƠNG, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 “Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá

Corynespora (Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei.) trên cây cao su”

Bệnh rụng lá Corynespora gây ra bởi nấm C cassiicola đang được xem là bệnh

lá nguy hiểm nhất cho các vùng trồng cao su trên thế giới Ở Việt Nam, bệnh xuất hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999 Hiện nay, bệnh đang trong giai đoạn tích lũy và có thể bùng phát trong tương lai Do đó, công tác phòng trừ bệnh đang rất được quan tâm

Đề tài này thực hiện khảo sát 9 loại thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị nấm

C cassiicola Kết quả đạt được trong các thí nghiệm như sau:

Thí nghiệm in vitro: có 6 loại thuốc cho hiệu quả ức chế nấm cao là: Cyproconazole,

Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole Thuốc Difenoconazole cho hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp, nhưng khi tăng nồng

độ lên cao thì hiệu quả lại tăng rất ít Không có loại thuốc nào ức chế khả năng hình

thành bào tử trên môi trường nhân tạo Ngược lại, một số thuốc Hexaconazole,

Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon

còn làm tăng mật độ bào tử ở các nồng độ ức chế cao Các loại thuốc cũng không ảnh hưởng tới hình thái và tỉ lệ nảy mầm của bào tử

Thí nghiệm trên lá cắt rời: cả 6 loại thuốc thí nghiệm Cyproconazole,

Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole, Propiconazole đều có

hiệu quả giảm mức độ bệnh so với đối chứng Nhưng thuốc Difenoconazole có thời

gian bảo hộ ngắn hơn

Thí nghiệm ngoài đồng: cả 5 loại thuốc Cyproconazole, Flusilazole,

Hexaconazole, Tebuconazole, Propiconazole đều có hiệu quả phòng trị nấm cao Tỉ

lệ khỏi bệnh hoàn toàn tới 65 đến 79%, mức độ bệnh giảm tử 79 đến 87% Trong đó

thuốc Hexaconazole và Flusilazole luôn thể hiện hiệu quả cao nhất ở tất cả các thử

nghiệm

v

SUMMARY

NGUYEN VAN PHUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City Sectember, 2007 “Investigation effect of some pesticides use control of Corynespora leaf

disease (Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei.) of Hevea brasiliensis”

Corynespora leaf fall disease caused by C cassiicola was considered as one of the most serious leaf diseases on rubber tree In Vietnam, the disease was first

detected in August, 1999 At present, the disease is spreading and developing into epidemics in future Because of that, the control of disease has being very considered

Nine pesticides are tested on C cassiicola, the result is mentioned below:

In vitro tests: Six pesticides included Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, and Propiconazole are highly to inhibit the growth of

fungal colonies Difenoconazole is the most effective at the low dose, but its effect

doesn’t increase when its degree of concentration increase All tested fungicides are not able to reduce a number of fungal spores on artificial medium Conversely,

some pesticide as Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole,

Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon even make to increase density spores at the

high dose These pesticides don’t also affect to spore form and percentage of spore germination

Detected leaves tests: Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole,

Tebuconazole and Propiconazole are highly effective to inhibit on disease

development compared to the control Among them, Difenoconazole is less remain

the effectiveness after each application

Field tests: Five fungicides included Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole,

Tebuconazole and Propiconazole are found very effect to control the disease

development Hexaconazole and Flusilazole are showed the most effective to

reduce the disease infection

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 4

2.2 Đặc tính sinh học của nấm C cassiicola trên cây cao su 7

2.2.1 Phân loại học 7

2.2.2 Hình thái khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử và điều kiện nuôi cấy 7

2.2.3 Phổ kí chủ, sự xâm nhiễm của nấm C cassiicola 9

2.3 Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su H brasiliensis Muell Arg 9

2.3.1 Nguyên nhân và triệu chứng 9

2.3.2 Điều kiện phát sinh bệnh 11

2.3.3 Tác hại của bệnh và cách phòng trị 11

2.4 Phòng trị bệnh bằng thuốc bảo vệ thực vật 12

vii

2.4.1 Lịch sử và phân loại thuốc bảo vệ thực vật 12

2.4.2 Triazole - Nhóm thuốc trừ nấm 13

2.4.3 Tình hình sử dụng hóa chất trong kiểm soát bệnh rụng lá Corynespora 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 16

3.2 Đối tượng nghiên cứu 16

3.3 Phương pháp cơ bản 16

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 16

3.3.2 Phân lập 17

3.3.3 Phương pháp nhân số lượng bào tử 18

3.4 Khảo sát hiệu quả sử dụng hóa chất 19

3.4.1 Hoá chất 19

3.4.2 Khảo sát hiệu quả thuốc trên đĩa petri 20

3.4.3 Khảo sát hiệu quả thuốc trên lá bệnh cắt rời 21

3.4.4 Khảo sát hiệu quả thuốc trên vườn gỗ ghép 23

3.5 Xử lý số liệu 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả phân lập mẫu nấm 25

4.2 Khảo sát ảnh hưởng các loại thuốc trên môi trường in vitro 26

4.2.1 Hiệu quả ức chế đường kính khuẩn lạc của các loại thuốc 26

4.2.2 Ảnh hưởng của thuốc đến mật độ, kích thước và tỉ lệ nảy mầm của bào tử 38

4.2.2.1 Sự ảnh hưởng của thuốc đến mật độ bào tử hình thành trên môi trường bị đầu độc 39

4.2.2.2 Sự ảnh hưởng của thuốc đến hình thái bào tử hình thành trên môi trường bị đầu độc 41

4.2.2.3 Sự ảnh hưởng của thuốc đến khả năng nảy mầm của bào tử hình thành trên môi trường bị đầu độc 42

4.3 Kết quả thí nghiệm trên lá cắt rời 44

4.4 Kết quả thí nghiệm ngoài đồng 48

viii

4.4.1 Ảnh hưởng của các loại thuốc đến tỉ lệ nhiễm bệnh 49

4.4.2 Ảnh hưởng của các loại thuốc đến mức độ nhiễm bệnh 51

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BVTV: Bảo vệ thực vật CSB: Chỉ số bệnh Ctv: Cộng tác viên Dvt: Dòng vô tính

LD50: Liều lƣợng làm chết 50% cá thể (Lethal Dose) LD90: Liều lƣợng làm chết 90% cá thể

LLL: Lần lặp lại

PDA: Potato Dextrose Agar PSA: Potato Saccharose Agar TLB: Tỉ lệ bệnh

VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá trưởng thành 10

Hình 2.2 Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá non và cành 10

Hình 4.1 Khuẩn lạc và bào tử nấm C cassiicola sau khi phân lập 26

Hình 4.2 Bào tử nấm C cassiicola trên lá cao su 26

Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Cyproconazole sau 7 ngày cấy nấm 33

Hình 4.4 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Difenoconazole sau 7 ngày cấy nấm 34

Hình 4.5 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Flusilazole sau 7 ngày cấy nấm 34

Hình 4.6 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Hexaconazole sau 7 ngày cấy nấm 35

Hình 4.7 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Triadimenol sau 7 ngày cấy nấm 35

Hình 4.8 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Tebuconazole sau 7 ngày cấy nấm 36

Hình 4.9 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Triacyclazole sau 7 ngày cấy nấm 36

Hình 4.10 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Propiconazole sau 7 ngày cấy nấm 37

Hình 4.11 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường bị đầu độc thuốc Triadimefon sau 7 ngày cấy nấm 37

Hình 4.12 Bào tử và ống mầm nấm C cassiicola 43

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

TRANG

Bảng 3.1 Thành phần môi trường PSA, PDA 17

Bảng 3.2 Các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm 19

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng 24

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm đến đường kính khuẩn lạc C cassiicola 28

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm đến tốc độ phát triển đường kính khuẩn lạc 31

Bảng 4.3: Phương trình tương quan tuyến tính và chỉ số LD50 của các loại thuốc sau 7 ngày nuôi cấy 32

Bảng 4.4.Sự ảnh hưởng của các loại thuốc lên mật độ, kích thước và tỉ lệ nảy mầm của bào tử 40

Bảng 4.5 Chỉ số bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời 45

Bảng 4.6 Tỉ lệ bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời 48

Bảng 4.7 Nồng độ các thuốc sử dụng trong thí nghiệm ngoài đồng 49

Bảng 4.8 Tỉ lệ bệnh trung bình trước và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng 49

Bảng 4.9 Chỉ số bệnh trung bình trước và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng 51

Biểu đồ 4.1 Chỉ số bệnh trung bình sau 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời 47

Chương 1 MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận lần đầu vào tháng 8 năm 1999, gây hại nặng cho dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372 Hiện nay, số lượng dvt bị nhiễm bệnh tăng lên nhiều và cũng đã xuất hiện tại một số công ty cao su tại Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004) Hiện nay, bệnh đang trong giai đoạn tích lũy và có thể bùng phát trong tương lai (Phan Thành Dũng, 2006) Nguy cơ có thể cao hơn nữa, do sự phá vỡ tính kháng của chủng nấm đối với các dvt ngày càng nhanh, sự thay đổi khí hậu thất thường cũng như sự trao đổi thương mại các sản phẩm nông nghiệp

đang trên đà tăng nhanh Do đó, việc nghiên cứu về các đặc điểm cũng như các biện pháp phòng trừ hiệu quả bệnh rụng lá Corynespora đang rất được quan tâm hiện

nay Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả một số thuốc

bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora

cassiicola (Berk & Curt.) Wei.) trên cây cao su”

1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích

Mục đích của đề tài là tìm ra những hóa chất bảo vệ thực vật thích hợp cho việc phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora

Từ mục đích trên, nghiên cứu được hiện với mục tiêu cụ thể sau:

Phân lập và nuôi cấy nấm C cassiicola trên môi trường in vitro

Khảo sát hiệu quả hóa chất trên môi trường in vitro, nghiên cứu ảnh hưởng hoá

chất đến khả năng hình thành bào tử, hình thái và khả năng nảy mầm của bào tử Khảo sát hiệu quả hóa chất trên lá cao su cắt rời được lây bệnh bằng bào tử Khảo sát hiệu quả hóa chất trên vườn gỗ ghép đã nhiễm bệnh

1.2.2 Yêu cầu

Hiểu biết căn bản về bệnh cây cao su, bệnh rụng lá Corynespora nhận diện được

triệu chứng đặc trưng của bệnh

Nắm vững quy trình phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm thuốc trong phòng

Hiểu biết về thuốc bảo vệ thực vật và các kỹ thuật liên quan

Nắm vững các thao tác trong phòng thí nghiệm và trên vườn thực nghiệm Vận hành các máy móc thiết bị hiện có, củng cố nắm vững kiến thức đã học

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell Arg

Những cây có nhựa mủ có thể sản xuất ra cao su trên thế giới thuộc vào năm

họ thực vật sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae,

Compositae Nhưng cây cao su thuộc loại H brasiliensis (giống Hevea, họ Euphorbiaceae) là cây duy nhất được chọn để canh tác đại qui mô (Nguyễn Hữu

Trí, 2004)

Cây cao su có nguồn gốc tự nhiên ở vùng rừng lưu vực Amazone, Nam Mỹ, trải rộng từ vĩ tuyến 15 Nam đến vĩ tuyến 16 Bắc và kinh tuyến 46 – 77 Tây, bao gồm các nước Brazil, Bolivia, Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela, French Guiana, Surinam và Guyana Dân địa phương đã dùng mủ cao su để làm các vật dụng chống thấm và có tính đàn hồi như quả bóng đồ chơi thể thao, tấm lợp nhà, túi đựng nước, các hình tượng trong lễ hội tôn giáo…

Cây cao su được người châu Âu biết lần đầu sau chuyến thám hiểm của ông Christopher Columbus đến châu Mỹ năm 1492 Sau đó, một số nhà khoa học châu Âu đã khám phá các đặc tính của mủ cao su: đàn hồi, dẻo, không thấm nước Cao su được sử dụng làm nguyên liệu chế tạo vỏ ruột xe đạp từ 1888 và vỏ ruột xe hơi từ 1895 Những phát minh lưu hoá cao su và hoà trộn mủ cao su với các nguyên liệu khác (bột than, thép, kaolin, đất đỏ…) đã làm các sản phẩm từ mủ cao su ngày càng phong phú, đa dạng, từ đó nhu cầu cao su tăng nhanh

Cho đến cuối thế kỷ 19, cao su thiên nhiên là do Brazil độc quyền cung cấp từ các cây rừng Để giải quyết nhu cầu về cao su ngày càng tăng, nước Anh đã tìm cách trồng cây cao su ở các nước châu Á Năm 1876, Henry Wickham, nhà thực vật

Anh, đã chuyển 70.000 hạt cao su từ Brazil về Anh, sau đó những cây con từ nguồn hạt này được mang sang trồng ở Sri Lanka, Singapore, Malaysia và Indonesia Từ 1883, cây cao su ở Sri Lanka và Malaysia có hạt và làm nguồn giống cung cấp cho nhiều nước châu Á và châu Phi Sau năm 1889, các vườn cao su châu Á bắt đầu sản xuất mủ, nhanh chóng vượt Brazil và đến nay vẫn giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan, Indonesia và Malaysia(Đặng Văn Vinh, 1997).

Năm 1897 đánh dấu sự hiện diện của cây cao su ở Việt Nam Công ty cao su đầu tiên được thành lập là Suzannah (Dầu Giây, Long Khánh, Đồng Nai) năm 1907 Tiếp theo sau hàng loạt đồn điền và công ty ra đời, chủ yếu là của người Pháp và tập trung ở Đông Nam Bộ: SIPH, SPTR, CEXO, Michelin,… Một số đồn điền cao su tư nhân Việt Nam cũng được thành lập Đến năm 1920, miền Đông Nam Bộ có khoảng 7.000 ha và sản lượng 3.000 tấn

Cây cao su được đưa vào trồng ở Tây Nguyên từ năm 1923 và phát triển mạnh trong giai đoạn 1960 – 1962, trên những vùng đất có cao trình 400 – 600 m, sau đó ngưng vì chiến tranh Trong thời kỳ trước 1975, để có nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp miền Bắc, cây cao su đã được trồng vượt trên vĩ tuyến 17ºBắc (Quảng Trị, Quảng Bình, Nghệ An, Thanh Hoá, Phú Thọ) trong giai đoạn 1958 – 1963 từ nguồn giống từ Trung Quốc, diện tích đã lên tới khoảng 6.000 ha Đến năm 1976, Việt Nam còn gần 76.000 ha, tập trung ở Đông Nam Bộ khoảng 69.500 ha, 3.482 ha ở Tây Nguyên và 3.636 ha ở các tỉnh duyên hải miền Trung và khu Bốn cũ

Sau năm 1975, cây cao su được tiếp tục phát triển chủ yếu ở Đông Nam Bộ tại các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh và Bà Rịa Từ năm 1977, Tây Nguyên bắt đầu lại chương trình trồng mới cao su, đầu tiên do các nông trường quân đội, sau năm 1985 do các công ty quốc doanh và tư nhân đã tham gia trồng cao su từ năm 1992 đến nay Ở miền Trung, sau năm 1984, cây cao su được phát triển ở Quảng Trị, Quảng Bình trong các công ty quốc doanh (Trần Thị Thuý Hoa, 2006).

Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều ngành công nghiệp Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông – lâm – công nghiệp Trong những năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng được nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác v.v Tính đến cuối năm 2006, diện tích cao su cả nước đã đạt gần 511.900 ha với sản lượng 546.900 tấn, năng suất bình quân đạt 1.370 kg/ha/năm Riêng các diện tích do Tập đoàn Cao su Việt Nam quản lý đạt năng suất bình quân là 1,86 tấn/ha/năm, đứng đầu trên thế giới Năm 2006, toàn Ngành cao su xuất khẩu 707.895 tấn đạt kim ngạch xuất khẩu gần 1,3 tỷ USD, là nông sản đứng thứ 2 về kim ngạch xuất khẩu sau lúa (Tập đoàn Cao su Việt Nam, 2007) Trong tương lai khi nghị định thư Kyoto được thông qua thì việc bán hạn ngạch về khí thải sẽ mang lại cho người trồng cao su thêm một khoản thu nhập đáng kể (Trần Văn Cảnh, 2006)

Cùng với sự phát triển mạnh cây cao su thì những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng đáng kể Một phần do việc chọn lọc theo hướng sản lượng cao, sinh trưởng nhanh đã làm thất thoát gen kháng bệnh Mặt khác, do tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi và diễn biến phức tạp Thêm vào đó, việc phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh – phát triển mạnh về cả chủng loại cũng như mức độ bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và hiệu quả kinh tế của nó, thiệt hại đến sản lượng và gia tăng chi phí sản xuất Hiện nay, cao su được phát triển mạnh dưới dạng tiểu điền, nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống của những người trồng cao su

Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế Đến năm 2003, Phan Thành Dũng và cộng tác viên (ctv) cho biết có 8 loại bệnh cao su chính gây ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và sản lượng cây cao su trong nước, trong đó có 4 loại bệnh lá, 2 bệnh thân cành, 1 bệnh mặt cạo và 1 bệnh rễ Đáng kể trong các loại trên, bệnh rụng lá

Corynespora là bệnh mới xuất hiện năm 1999 và đang có chiều hướng mở rộng phạm vi gây hại cho các dvt cao su mới (Phan Thành Dũng, 2004)

2.2 Đặc tính sinh học của nấm C cassiicola trên cây cao su

2.2.1 Phân loại học

Bệnh rụng lá Corynespora được ghi nhận xuất hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (châu Phi) năm 1949 Năm 1954, Wei tổng hợp và đặt

tên nấm gây bệnh là Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei Theo nghiên cứu

phân loại gần đây nhất (Kirk và Paul, 2004 – trích dẫn bởi Lê Văn Huy, 2006) thì

nấm C cassiicola được phân loại như sau:

Giới nấm (Fungi)

Ngành (Phylum): Ascomycota Lớp (Class): Ascomycetes Bộ (Order): Pleosporales

Họ (Family): Corynesporascaceae Giống (Genus): Corynespora

(Nguồn: http://www.SpeciesFungorum.org/)

2.2.2 Hình thái khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử và điều kiện nuôi cấy

Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu Khuẩn lạc biến thiên rất lớn về tốc độ sinh trưởng, hình thái, độ dày, độ mịn và màu sắc khuẩn lạc cho dù được phân lập từ một bào tử duy nhất (Dung, 1995) Trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PSA (Potato Sucrose Agar) khuẩn lạc có màu xám đến nâu (Liyanage & Jayasinghe, 1988)

Về hình thái và hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng như trong môi trường nhân tạo có sự biến thiên rất lớn Bào tử trên lá có màu nâu nhạt với dạng hình lưỡi liềm hay thẳng chứa nhiều vách ngăn Chiều dài biến thiên lớn (22 – 300 m), đôi

khi đạt 700 m Chiều rộng biến thiên từ 5 – 10 m Bào tử dạng đơn, đôi khi dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là hilum Bào tử phát tán nhờ gió và hạt mưa, phóng thích vào ban ngày, và tại Việt Nam cao điểm từ 8 – 11 giờ sáng Sau thời gian mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất do nấm cần ẩm độ cao để hình thành bào tử (Phan Thành Dũng, 2004; Ellis và Holiday, 1971)

Trên vết bệnh, số lượng bào tử có khi lên đến 1.200 bào tử/cm2 Nấm

C cassiicola rất ít hình bào tử trên môi trường nhân tạo, số lượng bào tử cũng thay

đổi tùy dvt Có dvt sản xuất trên 100.000 bào tử trên 1 đĩa petri trong khi chủng khác lại không tạo bào tử (Liyanage và Jayasinghe, 1986) Nếu dùng các biện pháp kích thích như: để tối liên tục 3 ngày, sau đó chiếu sáng liên tục 3 ngày bằng ánh sáng huỳnh quang hay chiếu sáng bằng tia cực tím trong thời gian ngắn.v.v sẽ làm tăng số lượng bào tử (Chee, 1988)

Dưới điều kiện tối ưu: phạm vi nhiệt độ từ 25 – 30oC, ẩm độ 100% bào tử nảy mầm trong 3 giờ (Liyanage và Jayasinghe, 1988) và phát triển ống mầm ở vị trí nằm giữa hai vách, nhưng phổ biến nhất ở hai đầu của bào tử Nhiệt độ từ 15 – 20oC, bào tử nảy mầm sau 12 giờ và khi nhiệt độ trên 35 – 40oC bào tử không nảy mầm được Ẩm độ trên 96% và nếu không có nước tự do hiện diện thì bào tử vẫn có thể nảy mầm được nhưng thời gian ủ bệnh kéo dài hơn 24 giờ

Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh cũng như trong đất với thời gian kéo dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 tháng (Phan Thành Dũng, 2004)

Điều kiện nuôi cấy:

Nấm có thể nuôi cấy trên nhiều môi trường khác nhau, với pH thay đổi tùy môi trường: PDA (pH: 6,8 – 7), PSA (pH: 6,8 – 7,0): Rose Ben Agar (pH: 5,5); Czapek Dox Agar (pH: 6,8 – 7,2); Corn Meal Agar (pH: 6,8 – 7,0) Richard’s medium (pH: 5,4) Tuy nhiên môi trường PDA là môi trường tối ưu cho sự phát triển của nấm,

môi trường PSA hay dịch chiết cao su + dextrose + agar là hai môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành bào tử (Liyanage và cộng sự, 1986)

2.2.3 Phổ kí chủ, sự xâm nhiễm của nấm C cassiicola

Nấm C cassiicola có phổ kí chủ rộng, gồm khoảng 150 loài ký chủ thuộc các

nhóm cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây ngũ cốc, cây rau màu và nhiều loại cây cảnh khác Chúng phân bố trên 80 nước, ở nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và gây hại trên tất cả bộ phận của cây từ lá tới rễ Tuy nhiên,

nấm C cassiicola trên cây cao su là ký sinh chuyên biệt (Phan Thành Dũng, 2004)

Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra men cellulozase giúp phân hủy màng tế bào Sau khi bào tử nảy mầm, chúng mọc sâu vào vị trí vách ngăn của các tế bào dậu, sau đó khuẩn ty phân nhánh xâm nhiễm vào tế bào và hình thành bào tử 96 giờ sau đó Trong quá trình sinh

trưởng nấm tiết ra độc tố cassiicolin (CC toxin) chứa các amino acid, hợp chất này

rất độc cho cao su cho nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ gây rụng lá (Phan Thành Dũng, 2004) Đây là loại độc tính chuyên biệt, có tác động đến hiện tượng chết mô lá, vỏ và kích thích lá hình thành tầng rời, hậu quả là gây rụng lá

2.3 Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su H brasiliensis Muell Arg

2.3.1 Nguyên nhân và triệu chứng

Bệnh do nấm C cassiicola gây nên, nấm có khả năng gây hại cho cả lá già và lá

non cũng như cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác nhau (Phan Thành Dũng, 2004)

Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xương cá dọc theo gân lá, vết bệnh lan rộng nếu điều kiện thuận lợi, gây chết từng phần lá do sự phá hủy của lục lạp, sau đó lá đổi màu vàng cam và rụng từng lá một

Trên lá non vết bệnh hình tròn màu xám đến nâu với quầng màu vàng xung quanh, có khi hình thành lỗ thủng Lá quăn và biến dạng, sau đó rụng toàn bộ

Hình 2.1 Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá trưởng thành Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN

Hình 2.2 Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá non và cành Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN

Trên chồi và cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, đôi khi nấm bệnh cũng gây hại chồi đã hóa nâu Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây Nếu dùng dao cắt bỏ lớp vỏ ngoài sẽ xuất hiện những sọc đen ăn sâu trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh Trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chét bị rụng khi còn xanh mặc dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá

2.3.2 Điều kiện phát sinh bệnh

Có ba yếu tố dẫn đến sư phát sinh bệnh trên cây cao su gồm:

a Dòng vô tính cao su mẫn cảm : tính mẫn của của các dvt cao su thì tùy thuộc vào điều kiện từng nước cũng như giai đoạn phát triển Như dvt RRIC 103 trước đây được xem là kháng bệnh ở Indonesia nhưng đột nhiên trở nên nhiễm nặng Trong khi dvt PB 260 là dvt có triển vọng về sản lượng và kháng bệnh tại Malaysia, Indonesia, nhưng bị hại rất nặng tại Cameroon và Châu Phi Dòng vô tính RRIM 725 mẫn cảm ở giai đoạn cây con nhưng kháng khi trưởng thành (Darussamin và Pawirosoemardjo, 1996)

b Nấm hình thành nòi mới: nấm dễ thích nghi với điều kiện môi trường để hình thành nòi mới, vượt qua tính kháng của một số dvt, cũng như đáp ứng khác nhau với thuốc trị bệnh Nòi mới hình thành gồm ba yếu tố sau: đáp ứng với điều kiện địa lí, đáp ứng với cây ký chủ khác, đáp ứng với dvt cao su, trong đó yếu tố đầu và cuối có vai trò quan trọng đến mức độ gây hại của nấm với cao su từng vùng

c Môi trường thuận lợi cho nấm bệnh cao su phát triển: cũng như nhiều loại

bệnh khác, sự phát dịch, lây lan và tác hại của C cassiicola có liên quan đến các

yếu tố môi trường như độ ẩm, nhiệt độ, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất (CFC/INRO A Proposal, 1999) RRIM 600 nhiễm bệnh nặng tại Johore (Malaysia), nhưng không bị bệnh ở vùng có mùa khô kéo dài như Kedah và Pelis (Darussamin và Pawirosoemardjo, 1996) Một số ghi nhận cho rằng, ở độ cao trên 300 m thì cao su ít bị bệnh hơn (Jaysinghe, 2000)

2.3.3 Tác hại của bệnh và cách phòng trị

Tác hại

Mức nguy hại của bệnh tùy thuộc vào mức độ kháng của dvt và giai đoạn tuổi Tùy theo sự tương thích giữa ký sinh, ký chủ và môi trường Bệnh gây hại quanh năm vào mọi giai đoạn sinh trưởng của cây cao su

Ở cây con trong giai đoạn kiến thiết cơ bản, bệnh xuất hiện quanh năm gây rụng lá, làm chậm sự phát triển, cuối cùng gây chết cây Ở cây cao su trưởng thành mẫn cảm với bệnh có thể gây giảm 20 – 25% sản lượng Do bệnh có khả năng gây hại cho mọi lứa tuổi cây và xuất hiện quanh năm nên việc sử dụng dvt kháng bệnh là biện pháp khả thi nhất

2.4 Phòng trị bệnh bằng thuốc bảo vệ thực vật 2.4.1 Lịch sử và phân loại thuốc bảo vệ thực vật

Thuốc bảo vệ thực vật được biết vào thời cổ đại, khi người La Mã biết dùng hơi lưu huỳnh để trừ côn trùng và muối để trừ cỏ Vào thế kỷ thứ 9, người Trung

Hoa sử dụng arsenic hòa trong nước diệt trừ côn trùng Đầu thế kỷ 19, pyrethrin và

rotenone chiết xuất từ cây cúc dại và cây thuốc cá cũng được dùng trừ nhiều loại

côn trùng Hỗn hợp Paris xanh gồm CuSO4 và arsenic dùng trừ bọ cánh cứng Colorado khoai tây năm 1865 Ngày nay, với sự phát triển nhanh chóng của ngành hoá học, đã có rất nhiều loại hóa chất ra đời để đáp ứng nhu cầu bảo vệ thực vật của con người (Phan Thành Dũng, 2004)

Có nhiều cách phân loại thuốc bảo vệ thực vật, nhưng thường phân loại theo đối tượng phòng trừ như: Thuốc trừ sâu, trừ bệnh, trừ cỏ, trừ chuột, trừ nhện, trừ ốc sên, thuốc điều tiết sinh trưởng cây trồng, Trong mỗi nhóm trên, thường phân ra các nhóm nhỏ hơn theo gốc hóa học Như thuốc trừ bệnh gồm có 2 nhóm lớn là nhóm vô cơ và nhóm hữu cơ Nhóm vô cơ như nhóm đồng, nhóm lưu huỳnh, nhóm

thủy ngân Nhóm hữu cơ như nhóm lân hữu cơ, nhóm Carbamate, nhóm

Dithiocarbamate, nhóm Triazole Ngoài ra còn có nhóm Dicarboximit, nhóm thuốc

sinh học (Phạm Văn Biên và ctv, 2006)

2.4.2 Triazole - Nhóm thuốc trừ nấm

Nhóm thuốc Triazole là những thuốc trừ nấm thế hệ mới nhất, có tính chọn

lọc cao, nội hấp, hiệu lực mạnh, đang được phát triển và sử dụng nhiều Nó là nhóm thuốc có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp ergosterol, liều sử dụng thấp, ít độc với người và gia súc Nó thuộc nhóm chất lưu dẫn, được cây hấp thu qua rễ, thân, lá và dịch chuyển đến các bộ phận khác qua hệ thống bó mạch Thuốc lưu dẫn theo hướng lên và hiếm khi từ trên xuống Các loại thuốc này hiệu quả trong phòng cũng như trị bệnh (Phan Thành Dũng, 2004; Phạm Văn Biên và ctv, 2006)

Cơ chế tác động của thuốc nhóm Triazole là kìm hãm quá trình sinh tổng hợp

ergosterol (thông thường sự phá hoại của vật gây bệnh tăng khi có hàm lượng ergosterol tăng), ngăn cản sự hình thành rễ bám hay giác mút, sự sinh trưởng của tản nấm và sự hình thành bào tử Các thuốc này xâm nhập và dịch chuyển trong cây rất nhanh (Nguyễn Trần Oánh, 1997)

Công thức cấu tạo của gốc Triazole như sau:

Các thuốc nhóm Triazole có tính nội hấp, thuốc nhanh chóng thấm qua bề mặt

và phân bố đều trong lá, lưu dẫn mạnh trực tiếp đến các vết bệnh nơi nấm xâm

nhập Hiệu quả của thuốc kéo dài nhờ vào đặc tính phòng bệnh (ngăn chặn sự xâm nhập của nấm bệnh), trị bệnh (chặn đứng sự tiến triển của nấm bệnh) và diệt triệt để (nấm đã xâm nhập và các bào tử mới) Thuốc đạt hiệu quả phòng trị cao, giảm chi phí công lao động và số lần phun Ví dụ thuốc Opus 75EC là thuốc trừ nấm thế hệ

mới với hoạt chất Epoxiconazole, sản phẩm của Công ty BASF (Cộng hòa Liên

bang Đức) Opus 75EC còn kích thích cơ chế tự kháng bệnh của cây, giúp dưỡng cây xanh lá Thuốc Sumi-Eight 12 là thuốc trừ nấm phổ rộng với hoạt chất

Diniconazole còn có tác dụng dưỡng cây, cây khỏe, bộ lá xanh hơn, tăng khả năng

chống chịu sâu bệnh (http://www.cuctrongtrot.gov.vn/)

2.4.3 Tình hình sử dụng hóa chất trong kiểm soát bệnh rụng lá Corynespora

Sử dụng hóa chất là chiến lược quản lý bệnh có hiệu quả nhanh nhất, nó được áp dụng trong hầu hết các lĩnh vực trồng trọt, được nông dân áp dụng phổ biến và có khả năng đem lại kết quả tốt Mặc dù đã có những báo cáo liên quan đến giá trị và ảnh hưởng xấu của hóa chất bảo vệ thực vật tới môi trường, nông dân vẫn tiếp nhận nó Các phương pháp sinh học trong kiểm soát bệnh, bao gồm cả thao tác di truyền, đã được ủng hộ trong vài thập kỷ qua, nhưng thuốc hóa học vẫn chưa bị loại bỏ trong chương trình quản lý bệnh thực vật Phương pháp kết hợp cả sinh học lẫn hóa học trong quản lý bệnh đang được áp dụng rộng rãi

Để kiểm soát bệnh cho những cây trồng giá trị cao, cung cấp cho các ngành công nghiệp vật liệu như cao su thì hóa chất bảo vệ thực vật vẫn có thể còn được sử dụng trong thời kỳ lâu dài, bởi vì các hóa chất hầu như không nhiễm vào sản phẩm của cây cao su, do đó không ảnh hưởng trực tiếp đến người tiêu dùng

Trong các vùng trồng cao su như Ấn Độ, việc sử dụng hóa chất để kiểm soát

bệnh đã được thực hiện gần một thế kỷ Bệnh nấm hồng gây bởi Corticium

salmonicolor và bệnh rụng lá mùa mưa gây bởi Phytophthora spp được kiểm soát

bởi thuốc trừ nấm đã được đề ra và áp dụng rộng rãi ngay từ năm 1910 ở Ấn Độ và Sri Lanka

Kiểm soát bằng thuốc hóa học với bệnh rụng lá Corynespora đã được giới thiệu khi bệnh xuất hiện lần đầu tiên trên vườn ươm ở Ấn Độ khoảng năm 1958 Việc phun hỗn hợp Bordeaux (1%) hay Zineb (0,24%) với lượng phun 2 lần trong 3 tuần, trong suốt khoảng thời gian của mùa bệnh đã được đề ra để kiểm soát bệnh

Cả 2 loại thuốc trừ nấm tiếp xúc và lưu dẫn đều được thử nghiệm rộng rãi trong

phòng thí nghiệm và ngoài vườn ươm Trong các thử nghiệm in vitro chỉ ra rằng

Carbendazim ức chế mầm bệnh phát triển hoàn toàn ở nồng độ 25 ppm a.i Trong

thí nghiệm trên vườn ươm Mancozeb (0,2%), Carbendazim (0,5%) và tổ hợp

Metalaxyl + Mancozeb (0,2%) đều có hiệu quả phòng trị bệnh (Manju, 2006)

Các loại thuốc đã được báo cáo có hiệu quả phòng trị nấm C cassiicola là: Nhóm thuốc tiếp xúc như: Bordeaux, Mancozeb, Captafol, Chlorothalonil Nhóm thuốc lưu dẫn như: Carbendazim, Tridemorph, Hexaconazole

Các thuốc hỗn hợp như: Metalaxyl + Mancozeb (0,2%), Benomyl và Thiram,

Copperoxychloride (21%) + Mancozeb (20%), Propineb (56%) + Oxadixyl (10%), Mancozeb (63%) + Carbendazim (12%), Hexaconazole + Captan, Difenoconazole

cũng được báo cáo có hiệu quả phòng trị bệnh (Srinivas và Idicula, 2006)

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nấm C cassiicola được phân lập từ lá cao su thuộc dvt RRIV 4 có biểu

hiện các triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora

3.3 Phương pháp cơ bản 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu nấm được lấy trên dvt RRIV 4 có vết bệnh đặc trưng

Mẫu được lấy vào buổi sáng sớm khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên lá và chưa phát tán vào không khí

Mẫu được ghi rõ tên dvt lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, lá non hay lá già, vết bệnh đặc trưng hay không đặc trưng Mẫu lá bệnh được đặt vào hộp có đặt giấy thấm nước để giữ ẩm

3.3.2 Phân lập

Hóa chất và dụng cụ

Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri (9 cm đường kính), que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, giá đỡ ống nghiệm, becher, kính hiển vi quang học, nồi hấp Tommy, tủ sấy, hộp đựng mẫu, giấy thấm nước, bút lông

Hóa chất:

Bảng 3.1 Thành phần môi trường PSA, PDA

Thành phần Môi trường PSA (g/l) Môi trường PDA(g/l)

Nước cất Nước cất vừa đủ 1lít Nước cất vừa đủ 1lít

Cách chuẩn bị môi trường PSA:

Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 100 g, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nước cất 2 lần, đun sôi trong 30 phút Lọc lấy nước trong

Thêm 15 g agar, 10 g đường sucrose và nước cất vừa đủ 1 lít vào dung dịch đã lọc

Đun sôi trong 3 phút, khuấy đều trong lúc nấu Sau đó môi trường được phân vào các bình tam giác đem hấp khử trùng ở 121 C/15 phút

Môi trường PDA được thực hiện tương tự như môi trường PSA

Phương pháp phân lập

Lá có triệu chứng bệnh đặc trưng được đưa về phòng thí nghiệm, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, dùng que cấy nấm đã khử trùng ướt và khô, sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy trực tiếp bào tử ngay trên vết bệnh cấy vào đĩa môi trường (5 điểm/đĩa)

Sau hai ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C cassiicola được cấy sang đĩa

môi trường mới (môi trường PDA) và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng (26 - 30ºC) Khi nấm phát triển, tiến hành kiểm tra và cấy chuyền sang môi trường mới cho đến khi thu được nguồn nấm thuần chủng

Với phương pháp phân lập như trên, sau khi phân lập các mẫu nấm cần phải được

kiểm tra lại bằng cách quan sát hình thái sợi nấm và bào tử của nấm C cassiicola

dưới kính hiển vi

3.3.3 Phương pháp nhân số lượng bào tử

Nấm C cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trường nhân tạo, để tạo được nhiều

bào tử có thể áp dụng theo phương pháp sau: (Chee, 1988)

Nuôi cấy nấm trên môi trường PSA trong điều kiện tối liên tục 24/24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày

Sau đó sử dụng một tấm lame vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử

Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24 giờ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Sau thời gian trên tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm bằng cách soi bào tử dưới kính hiển vi (đặt bào tử trong giọt nước cất hoặc giọt dung dịch methylene blue) Hình dạng bào tử được so sánh với những mô tả của Ellis và

Holiday (1971) Các nguồn nấm được xác định chính xác là nấm C cassiicola

sẽ được sử dụng vào những phân tích tiếp theo

Các đĩa nấm có bào tử được cho thêm 20 ml nước cất vô trùng, lắc đều để hoà tan bào tử vào nước Sau đó đổ dịch bào tử vào bình tam giác qua lưới lọc, lắc đều sẽ được dịch bào tử sử dụng cho các thí nghiệm sau (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005)

3.4 Khảo sát hiệu quả sử dụng hóa chất 3.4.1 Hoá chất

Các thí nghiệm khảo sát được thực hiện với 9 hóa chất bảo vệ thực vật thuộc

nhóm Triazole như sau:

Bảng 3.2 Các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm Ký hiệu chữ Tên hoạt chất Tên thương mại

Cách qui đổi từ nồng độ hoạt chất cần dùng ra nồng độ thương phẩm: Nồng độ hoạt chất cần dùng (% a.i) * 100

% hoạt chất trong thuốc thương phẩm Nồng độ thương phẩm =

3.4.2 Khảo sát hiệu quả thuốc trên đĩa petri

Sử dụng phương pháp đầu độc môi trường như sau:

Môi trường PDA được chuẩn bị và khử trùng bằng phương pháp nhiệt ướt (autoclave) ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút

Lượng thuốc được thêm vào môi trường ở nhiệt độ 40 – 50ºC để có nồng độ tương ứng (đổ 9 ml môi trường sau đó thêm 1 ml thuốc)

Đánh giá hiệu lực của thuốc theo phương pháp Finney (1968): Dựa vào chỉ số LD50 (Lethal Dose) là liều lượng làm chết 50% cá thể trong quần thể Từ các nồng độ thí nghiệm và phần trăm ức chế đường kính khuẩn lạc (% giảm so với đối chứng) lập phương trình tương quan tuyến tính từ đó suy ra chỉ số LD50 của mỗi loại thuốc để đánh giá

LD50 < 10 mg a.i/l : Rất có hiệu lực LD50 = 10 – 50 mg a.i/l : Hiệu lực trung bình LD50 = 51 – 125 mg a.i/l : Hiệu lực rất ít LD50 > 125 mg a.i/l : Không có hiệu lực

Khảo sát ảnh hưởng của hóa chất đến mật độ bào tử, kích thước bào tử và sự nảy mầm của bào tử:

Tính diện tích khuẩn lạc, tiếp theo cho nước cất vào đĩa Petri theo tỷ lệ 1 ml/1cm2

dùng muỗng sắt cào đều trên bề mặt khuẩn lạc để tách bào tử, sau đó lấy 3 giọt dung dịch (mỗi giọt 10 µl) trên 1 đĩa, nhỏ lên lame và đếm số lượng bào tử Từ đó tính ra mật độ bào tử trên cm2 diện tích khuẩn lạc

Dùng dung dịch trên đo kích thước (dài, rộng) số vách ngăn của bào tử Đo ngẫu nhiên 10 bào tử trên 1 đĩa Petri (40 bào tử/nghiệm thức/lần lặp lại)

Dùng 0,1 ml dung dịch bào tử nhỏ trên lame, ủ 12 giờ sau đó cho thêm 1 giọt methylene blue (có bổ sung formon để ức chế sự nảy mầm tiếp tục của nấm nhằm thuận tiện trong việc theo dõi), đếm tỷ lệ bào tử nảy mầm và đo chiều dài của ống mầm (germtube) của 20 bào tử trên 1 nghiệm thức

3.4.3 Khảo sát hiệu quả thuốc trên lá bệnh cắt rời

Bố trí thí nghiệm:

Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Completety Randomized Design)

Số nghiệm thức: chọn 6 thuốc có hiệu quả tốt nhất trong thí nghiệm trên đĩa, mỗi thuốc chọn 3 nồng độ dựa vào chỉ số LD50*100 và LD99 Cộng với 1 đối chứng có tổng số 19 nghiệm thức

Số hộp thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 1 hộp plastic có nắp đậy trong suốt (mỗi hộp có 6 lá cao su cắt rời), suy ra tổng số 19 hộp/1lần

Rửa sạch lá bằng nước cất, để ráo rồi đặt úp trên lưới sắt trong hộp plastic, dưới có lót sẵn giấy thấm ướt để giữ ẩm

Phun ướt đều dung dịch thuốc tương ứng lên các lá Để lá ráo nước khoảng 1 giờ Dùng bình phun nhỏ phun ướt đều dịch bào tử (đã được kiểm tra số lượng bào tử/ml dung dịch) lên các lá

Đậy nắp hộp và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang trong 12 giờ/ngày, nhiệt độ phòng 28 ± 2ºC

Ghi nhận cấp bệnh vào ngày thứ 1, 3, 5, 7 ngày sau khi lây bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh của Bộ môn BVTV/VNCCSVN như sau:

Cấp 4: Các vết bệnh chiếm 1/2 diện tích mẫu lá Cấp 5: Các vết bệnh chiếm trên 3/4 diện tích mẫu lá Đánh giá kết quả:

Từ cấp bệnh tính ra tỉ lệ bệnh (TLB) và chỉ số bệnh (CSB) theo công thức CSB (%) = (a x b) x 100/(n x 5)

Với a: Số cây bị bệnh của mỗi cấp bệnh b: Cấp bệnh tương ứng

5: Cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp n: Tổng số cây điều tra

TLB (%) = m x 100/n Với m: Số cây bị bệnh

n: Tổng số cây điều tra

3.4.4 Khảo sát hiệu quả thuốc trên vườn gỗ ghép

Bố trí thí nghiệm:

Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD: Completety Randomized Design) Số nghiệm thức: Từ kết quả 2 thí nghiệm trên chọn ra 5 loại thuốc 1 nồng độ thích hợp Cộng với 1 đối chứng có tổng số 6 nghiệm thức

Bố thí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp lại (LLL) trên cùng 1 khu thí nghiệm là Vườn Nhân giống RRIV 4 (VNCCSVN) có cùng độ tuổi và mức độ nhiễm bệnh khá tương đồng

Mỗi nghiệm thức bố trí ngẫu nhiên trong 1 hàng Trong 1 hàng chọn 10 cây, mỗi cây chọn 4 cành ở 4 hướng khác nhau, mỗi cành chọn 5 lá để theo dõi cố định Mỗi nghiệm thức được bố trí cách ly nhau 1 hàng (Srinivas và Idicula, 2006)

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng

DC Te Fl Cy He Pr He Fl Pr Cy DC Te Cy Pr He Te DC Fl

Thời gian thực hiện: từ ngày 09/07/07 đến ngày 02/08/07 Cách thực hiện:

Ghi nhận cấp bệnh 1 ngày trước khi phun đợt đầu (Đợt 1- kiểm trắng)

Thực hiện phun thuốc tương ứng với từng lô quy định Tiến hành phun làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 7 ngày Sau 6 ngày trong mỗi đợt phun thì tiến hành ghi nhận cấp bệnh trên các lá đã đánh dấu sẵn

Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập mẫu nấm

Một trong những kỹ thuật cơ bản trong công tác nghiên cứu bảo vệ thực vật, đặc biệt đối với những loại nấm ký sinh, là phân lập và thuần chủng trong môi trường

nhân tạo Đối với nấm C cassiicola được phân lập từ các vị trí nhiễm bệnh, trong

đó vết bệnh trên lá thường được sử dụng là nguồn chính để phân lập Mục đích của việc phân lập này là định danh được nấm gây bệnh và tạo nguồn nấm cho những nghiên cứu khác, như đánh giá hiệu lực của các loại thuốc trừ nấm sẽ đề cập trong những phần tiếp theo.

Sau khi tiến hành cấy mẫu nấm vào đĩa 1 ngày thì khuẩn ty bắt đầu phát triển từ vết cấy, khuẩn lạc sẽ hình thành rõ rệt ở ngày thứ 3 Tiếp theo, khuẩn lạc được quan sát và định danh theo cán bộ nghiện cứu của bộ môn BVTV, rồi được cấy chuyền sang đĩa petri mới Những khuẩn lạc này được kích thích để hình thành bào tử và quan sát chúng dưới kính hiển vi dựa trên tài liệu nghiên cứu của các tác giả đã công bố (bào tử màu nâu nhạt với dạng hình lưỡi liềm hay thẳng chứa nhiều vách ngăn Chiều dài biến thiên lớn (22 – 300 m) Chiều rộng biến thiên từ 5 – 10 m (Ellis và Holiday, 1971)) nhằm xác định độ chính xác của nấm

C cassiicola (hình 4.1 và hình 4.2) Sau cùng, nấm được cấy qua ống nghiệm có

chứa môi trường PDA để bảo quản và dùng làm nguồn nấm cho các thí nghiệm tiếp theo

Hình 4.1 Khuẩn lạc và bào tử nấm C cassiicola sau khi phân lập (vật kính X40)

Hình 4.2 Bào tử nấm C cassiicola trên lá cao su

Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN

4.2 Khảo sát ảnh hưởng các loại thuốc trên môi trường in vitro

4.2.1 Hiệu quả ức chế đường kính khuẩn lạc của các loại thuốc

Một trong những tác động của thuốc trừ nấm lên một loại nấm ký sinh là khả

năng ức chế sự phát triển của khuẩn lạc Việc thực hiện thử nghiệm in vitro bằng

phương pháp đầu độc môi trường (poisioned food technique) đã chuẩn hoá và được các nhà nghiên cứu BVTV áp dụng rộng rãi Phương pháp này không những cho phép đánh giá nhanh hiệu quả của thuốc trừ nấm trên một loại nấm ký sinh, mà còn

có chi phí thấp Qua thử thuốc bằng phương pháp in vitro xác định được chỉ số LD50

(liều làm chết 50% cá thể), từ đó xác định được nồng độ của thuốc khi áp dụng ngoài đồng Chẳng hạn, như đối với Validacin 5L nồng độ thuốc có hiệu lực ngoài đồng bằng LD50*100 Phương pháp đầu độc môi trường đã được áp dụng trên

C samonicolor, Phytophthora spp gây bệnh nấm hồng và loét sọc mặt cạo (Huỳnh

Hữu Tấn, 1996), trên C gloeosporioides gây bệnh héo đen đầu lá (Radziah &

Omar, 1985 - trích dẫn bởi Nguyễn Đôn Hiệu, 2004)

Đề tài bước đầu sử dụng phương pháp này để đánh giá hiệu lực của một số thuốc

trừ nấm gốc Triazole trên C cassiicola Tiếp theo, những loại thuốc và nồng độ

thích hợp sẽ được khảo sát trên lá cao su cắt rời trong phòng thí nghiệm (phương

pháp in vivo) và từ kết quả này làm cơ sở để chọn được loại thuốc và nồng độ thích

hợp nhất áp dụng ra ngoài đồng ruộng

Thí nghiệm in vitro được tiến hành đánh giá tốc độ phát triển của nấm

C cassiicola bằng phương pháp đầu độc môi trường với các loại thuốc trừ nấm

Những loại thuốc nào có hiệu quả trị nấm tốt thì khuẩn ty sẽ kém phát triển hoặc bị ức chế hoàn toàn so với nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc Đường kính khuẩn lạc được theo dõi hàng ngày trong suốt thời gian thí nghiệm, kết quả được trình bày ở bảng 4.1

Theo dõi trên bảng 4.1, ở ngày đầu tiên, thuốc Hexaconazole ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm ở ngay nồng độ thấp là 2,5 ppm Điều này chứng tỏ

Hexaconazole cho hiệu quả ức chế cao nhất ngay từ những ngày đầu tiên Các ngày

tiếp theo, thuốc Hexaconazole cũng ức chế hoàn toàn sự phát triển khuẩn ty ở các

nồng độ 12,5 và 25 ppm

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm đến đường kính khuẩn lạc C cassiicola

Thuốc Nồng độ (ppm-ai)

Đường kính khuẩn lạc trung bình (cm) % Ức chế đường kính khuẩn lạc 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày

nazole

Thuốc Cyproconazole và Flusilazole nồng độ 25 ppm cũng có hiệu quả ức chế

100% ở tất cả các ngày theo dõi, nhưng ở nồng độ 12,5 ppm thì các thuốc này chỉ cho

hiệu quả ức chế 100% ở những ngày đầu, đến ngày thứ 5 thì khuẩn ty đã mọc lan xuống môi trường mới Có lẽ ở nồng độ đó chưa đủ sức diệt hoàn toàn khuẩn ty nên

chúng đã bắt đầu thích nghi được với môi trường bị đầu độc

Các thuốc Propiconazole và Triadimenol nồng độ 12,5 và 25 ppm; thuốc

Tebuconazole nồng độ 25 ppm thì chỉ cho hiệu quả ức chế 100% ở ngày đầu tiên, ở

các ngày tiếp theo khuẩn ty đã có thể phát triển xuống môi trường

Thuốc Difenoconazole, Triadimefon và Triacyclazole đều không cho thấy hiệu

quả ức chế 100% kể cả ở nồng độ cao nhất là 25 ppm

Hiệu quả ức chế đường kính khuẩn lạc so với đối chứng (không xử lý thuốc) của các loại thuốc được xử lý thống kê theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố là thuốc và nồng độ, kết quả được nêu trong phụ lục 1.1 Bảng Anova ở các phụ bảng 1.1.1, phụ bảng 1.1.2, phụ bảng 1.1.3 và phụ bảng 1.1.4 đều cho thấy có sự khác biệt rất nhiều giữa các loại thuốc cũng như giữa các nồng độ với nhau, đồng thời sự tương tác giữa thuốc và nồng độ là rất có ý nghĩa (P = 0,0000 < 0.001)

Khi so sánh phân hạng các loại thuốc, cho thấy thuốc Hexaconazole và Flusilazole luôn có hiệu quả ức chế cao nhất ở tất cả các ngày theo dõi Thuốc Cyproconazole có hiệu quả tương đương Flusilazole, nhưng kém hơn Hexaconazole và cao hơn các

thuốc khác

Thuốc Difenoconazole có hiệu quả ức chế kém ở những ngày đầu (kém hơn thuốc

Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole; phụ bảng 1.1.1), nhưng hiệu quả tăng

dần cho đến ngày thứ 5 và thứ 7 thì hiệu quả ức chế cao hơn thuốc Triadimenol và

Tebuconazole

Thuốc Propiconazole hầu như không thể hiện sự khác biệt so với các thuốc

Difenoconazole, Tebuconazole, Triadimenol Chỉ đến ngày thứ 7 thuốc Propiconazole mới cho thấy hiệu quả cao hơn Triadimenol Còn thuốc Triadimenol

và Tebuconazole không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa