Bố trí thí nghiệm:
Kiểu thí nghiệm: Khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Randomized Complete Block Design).
Số nghiệm thức: 9 hoá chất với 5 nồng độ là: 0,1; 0,5; 2,5; 12,5; 25. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 46 nghiệm thức.
Số đĩa thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 4 đĩa, tổng số 184 đĩa/1 lần lặp lại
Số lần lặp lại: 3 lần
Thời gian thực hiện: từ ngày 22/05/07 đến ngày 22/06/07 Cách thực hiện:
Sử dụng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng nhƣ sau:
Môi trƣờng PDA đƣợc chuẩn bị và khử trùng bằng phƣơng pháp nhiệt ƣớt (autoclave) ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút.
Lƣợng thuốc đƣợc thêm vào môi trƣờng ở nhiệt độ 40 – 50ºC để có nồng độ tƣơng ứng (đổ 9 ml môi trƣờng sau đó thêm 1 ml thuốc).
Lắc đều và để nguội.
Cấy mẫu nấm có đƣờng kính 0,8 cm lấy từ khuẩn lạc đang phát triển (5 ngày tuổi) vào giữa đĩa.
Đánh giá kết quả:
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính khuẩn lạc với khoảng cách 1 ngày 1 lần kể từ ngày cấy nấm. Cách đo đƣờng kính khuẩn lạc:
d = (d1+d2)/2
Đánh giá hiệu lực của thuốc theo phƣơng pháp Finney (1968): Dựa vào chỉ số LD50 (Lethal Dose) là liều lƣợng làm chết 50% cá thể trong quần thể. Từ các nồng độ thí nghiệm và phần trăm ức chế đƣờng kính khuẩn lạc (% giảm so với đối chứng) lập phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính từ đó suy ra chỉ số LD50 của mỗi loại thuốc để đánh giá.
LD50 < 10 mg a.i/l : Rất có hiệu lực. LD50 = 10 – 50 mg a.i/l : Hiệu lực trung bình LD50 = 51 – 125 mg a.i/l : Hiệu lực rất ít LD50 > 125 mg a.i/l : Không có hiệu lực
Khảo sát ảnh hƣởng của hóa chất đến mật độ bào tử, kích thƣớc bào tử và sự nảy mầm của bào tử:
Tính diện tích khuẩn lạc, tiếp theo cho nƣớc cất vào đĩa Petri theo tỷ lệ 1 ml/1cm2
dùng muỗng sắt cào đều trên bề mặt khuẩn lạc để tách bào tử, sau đó lấy 3 giọt dung dịch (mỗi giọt 10 µl) trên 1 đĩa, nhỏ lên lame và đếm số lƣợng bào tử. Từ đó tính ra mật độ bào tử trên cm2 diện tích khuẩn lạc.
Dùng dung dịch trên đo kích thƣớc (dài, rộng) số vách ngăn của bào tử. Đo ngẫu nhiên 10 bào tử trên 1 đĩa Petri (40 bào tử/nghiệm thức/lần lặp lại).
Dùng 0,1 ml dung dịch bào tử nhỏ trên lame, ủ 12 giờ sau đó cho thêm 1 giọt methylene blue (có bổ sung formon để ức chế sự nảy mầm tiếp tục của nấm nhằm thuận tiện trong việc theo dõi), đếm tỷ lệ bào tử nảy mầm và đo chiều dài của ống mầm (germtube) của 20 bào tử trên 1 nghiệm thức.