3.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu nấm đƣợc lấy trên dvt RRIV 4 có vết bệnh đặc trƣng.
Mẫu đƣợc lấy vào buổi sáng sớm khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên lá và chƣa phát tán vào không khí.
Mẫu đƣợc ghi rõ tên dvt lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, lá non hay lá già, vết bệnh đặc trƣng hay không đặc trƣng. Mẫu lá bệnh đƣợc đặt vào hộp có đặt giấy thấm nƣớc để giữ ẩm.
3.3.2. Phân lập
Hóa chất và dụng cụ
Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri (9 cm đƣờng kính), que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, giá đỡ ống nghiệm, becher, kính hiển vi quang học, nồi hấp Tommy, tủ sấy, hộp đựng mẫu, giấy thấm nƣớc, bút lông.
Hóa chất:
Bảng 3.1 Thành phần môi trƣờng PSA, PDA
Thành phần Môi trƣờng PSA (g/l) Môi trƣờng PDA(g/l)
Khoai Tây 100 200
Đƣờng 10 (sucrose) 20 (dextrose)
Agar 15 15
Nƣớc cất Nƣớc cất vừa đủ 1lít Nƣớc cất vừa đủ 1lít
Cách chuẩn bị môi trƣờng PSA:
Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 100 g, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nƣớc cất 2 lần, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nƣớc trong.
Thêm 15 g agar, 10 g đƣờng sucrose và nƣớc cất vừa đủ 1 lít vào dung dịch đã lọc.
Đun sôi trong 3 phút, khuấy đều trong lúc nấu. Sau đó môi trƣờng đƣợc phân vào các bình tam giác đem hấp khử trùng ở 121 C/15 phút.
Phƣơng pháp phân lập
Lá có triệu chứng bệnh đặc trƣng đƣợc đƣa về phòng thí nghiệm, rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần, dùng que cấy nấm đã khử trùng ƣớt và khô, sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy trực tiếp bào tử ngay trên vết bệnh cấy vào đĩa môi trƣờng (5 điểm/đĩa).
Sau hai ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassiicola đƣợc cấy sang đĩa môi trƣờng mới (môi trƣờng PDA) và đặt dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng (26 - 30ºC). Khi nấm phát triển, tiến hành kiểm tra và cấy chuyền sang môi trƣờng mới cho đến khi thu đƣợc nguồn nấm thuần chủng.
Với phƣơng pháp phân lập nhƣ trên, sau khi phân lập các mẫu nấm cần phải đƣợc kiểm tra lại bằng cách quan sát hình thái sợi nấm và bào tử của nấm C. cassiicola
dƣới kính hiển vi.
3.3.3. Phƣơng pháp nhân số lƣợng bào tử
Nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trƣờng nhân tạo, để tạo đƣợc nhiều bào tử có thể áp dụng theo phƣơng pháp sau: (Chee, 1988)
Nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PSA trong điều kiện tối liên tục 24/24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày.
Sau đó sử dụng một tấm lame vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử.
Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24 giờ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau thời gian trên tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm bằng cách soi bào tử dƣới kính hiển vi (đặt bào tử trong giọt nƣớc cất hoặc giọt dung dịch methylene blue). Hình dạng bào tử đƣợc so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971). Các nguồn nấm đƣợc xác định chính xác là nấm C. cassiicola
Các đĩa nấm có bào tử đƣợc cho thêm 20 ml nƣớc cất vô trùng, lắc đều để hoà tan bào tử vào nƣớc. Sau đó đổ dịch bào tử vào bình tam giác qua lƣới lọc, lắc đều sẽ đƣợc dịch bào tử sử dụng cho các thí nghiệm sau (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005).
3.4. Khảo sát hiệu quả sử dụng hóa chất 3.4.1. Hoá chất 3.4.1. Hoá chất
Các thí nghiệm khảo sát đƣợc thực hiện với 9 hóa chất bảo vệ thực vật thuộc nhóm Triazole nhƣ sau:
Bảng 3.2. Các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm Ký hiệu chữ Tên hoạt chất Tên thƣơng mại
Cy Cyproconazole Bonanza 100SL
Di Difenoconazole Score 250EC
Fl Flusilazole Nustar 40EC
He Hexaconazole Anvil 5SC
Ta Triadimenol Bayfidan 250EC
Te Tebuconazole Forlicur 250EW
Ty Triacyclazole Flash 75WP
Pr Propiconazole TilUSA super 250EC
Tf Triadimefon Encoleton 25WP
DC Đối chứng không xử lý thuốc
Cách qui đổi từ nồng độ hoạt chất cần dùng ra nồng độ thƣơng phẩm: Nồng độ hoạt chất cần dùng (% a.i) * 100
% hoạt chất trong thuốc thƣơng phẩm Nồng độ thƣơng phẩm =
3.4.2. Khảo sát hiệu quả thuốc trên đĩa petri
Bố trí thí nghiệm:
Kiểu thí nghiệm: Khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Randomized Complete Block Design).
Số nghiệm thức: 9 hoá chất với 5 nồng độ là: 0,1; 0,5; 2,5; 12,5; 25. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 46 nghiệm thức.
Số đĩa thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 4 đĩa, tổng số 184 đĩa/1 lần lặp lại
Số lần lặp lại: 3 lần
Thời gian thực hiện: từ ngày 22/05/07 đến ngày 22/06/07 Cách thực hiện:
Sử dụng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng nhƣ sau:
Môi trƣờng PDA đƣợc chuẩn bị và khử trùng bằng phƣơng pháp nhiệt ƣớt (autoclave) ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút.
Lƣợng thuốc đƣợc thêm vào môi trƣờng ở nhiệt độ 40 – 50ºC để có nồng độ tƣơng ứng (đổ 9 ml môi trƣờng sau đó thêm 1 ml thuốc).
Lắc đều và để nguội.
Cấy mẫu nấm có đƣờng kính 0,8 cm lấy từ khuẩn lạc đang phát triển (5 ngày tuổi) vào giữa đĩa.
Đánh giá kết quả:
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính khuẩn lạc với khoảng cách 1 ngày 1 lần kể từ ngày cấy nấm. Cách đo đƣờng kính khuẩn lạc:
d = (d1+d2)/2
Đánh giá hiệu lực của thuốc theo phƣơng pháp Finney (1968): Dựa vào chỉ số LD50 (Lethal Dose) là liều lƣợng làm chết 50% cá thể trong quần thể. Từ các nồng độ thí nghiệm và phần trăm ức chế đƣờng kính khuẩn lạc (% giảm so với đối chứng) lập phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính từ đó suy ra chỉ số LD50 của mỗi loại thuốc để đánh giá.
LD50 < 10 mg a.i/l : Rất có hiệu lực. LD50 = 10 – 50 mg a.i/l : Hiệu lực trung bình LD50 = 51 – 125 mg a.i/l : Hiệu lực rất ít LD50 > 125 mg a.i/l : Không có hiệu lực
Khảo sát ảnh hƣởng của hóa chất đến mật độ bào tử, kích thƣớc bào tử và sự nảy mầm của bào tử:
Tính diện tích khuẩn lạc, tiếp theo cho nƣớc cất vào đĩa Petri theo tỷ lệ 1 ml/1cm2
dùng muỗng sắt cào đều trên bề mặt khuẩn lạc để tách bào tử, sau đó lấy 3 giọt dung dịch (mỗi giọt 10 µl) trên 1 đĩa, nhỏ lên lame và đếm số lƣợng bào tử. Từ đó tính ra mật độ bào tử trên cm2 diện tích khuẩn lạc.
Dùng dung dịch trên đo kích thƣớc (dài, rộng) số vách ngăn của bào tử. Đo ngẫu nhiên 10 bào tử trên 1 đĩa Petri (40 bào tử/nghiệm thức/lần lặp lại).
Dùng 0,1 ml dung dịch bào tử nhỏ trên lame, ủ 12 giờ sau đó cho thêm 1 giọt methylene blue (có bổ sung formon để ức chế sự nảy mầm tiếp tục của nấm nhằm thuận tiện trong việc theo dõi), đếm tỷ lệ bào tử nảy mầm và đo chiều dài của ống mầm (germtube) của 20 bào tử trên 1 nghiệm thức.
3.4.3. Khảo sát hiệu quả thuốc trên lá bệnh cắt rời
Bố trí thí nghiệm:
Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Completety Randomized Design).
Số nghiệm thức: chọn 6 thuốc có hiệu quả tốt nhất trong thí nghiệm trên đĩa, mỗi thuốc chọn 3 nồng độ dựa vào chỉ số LD50*100 và LD99. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 19 nghiệm thức.
Số hộp thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 1 hộp plastic có nắp đậy trong suốt (mỗi hộp có 6 lá cao su cắt rời), suy ra tổng số 19 hộp/1lần
Số lần lặp lại: 2 lần trong cùng 1 đợt.
Thời gian thực hiện: từ ngày 23/06/07 đến ngày 08/07/07 Cách thực hiện:
Thu hái lá ở giai đoạn mới ổn định (lá mới chuyển từ màu nâu đỏ sang màu xanh lá mạ) của cùng 1 dvt, không có các triệu chứng nhiễm bệnh, giữ ẩm và đem về phòng thí nghiệm ngay.
Rửa sạch lá bằng nƣớc cất, để ráo rồi đặt úp trên lƣới sắt trong hộp plastic, dƣới có lót sẵn giấy thấm ƣớt để giữ ẩm.
Phun ƣớt đều dung dịch thuốc tƣơng ứng lên các lá. Để lá ráo nƣớc khoảng 1 giờ. Dùng bình phun nhỏ phun ƣớt đều dịch bào tử (đã đƣợc kiểm tra số lƣợng bào tử/ml dung dịch) lên các lá.
Đậy nắp hộp và đặt dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang trong 12 giờ/ngày, nhiệt độ phòng 28 ± 2ºC.
Ghi nhận cấp bệnh vào ngày thứ 1, 3, 5, 7 ngày sau khi lây bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh của Bộ môn BVTV/VNCCSVN nhƣ sau:
Cấp 0: Không bệnh.
Cấp 1: Một vài vết bệnh hoặc đốm nhỏ nhìn kỹ mới thấy. Cấp 2: Các vết bệnh chiếm 1/8 diện tích mẫu lá.
Cấp 4: Các vết bệnh chiếm 1/2 diện tích mẫu lá. Cấp 5: Các vết bệnh chiếm trên 3/4 diện tích mẫu lá. Đánh giá kết quả:
Từ cấp bệnh tính ra tỉ lệ bệnh (TLB) và chỉ số bệnh (CSB) theo công thức. CSB (%) = (a x b) x 100/(n x 5)
Với a: Số cây bị bệnh của mỗi cấp bệnh b: Cấp bệnh tƣơng ứng
5: Cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp n: Tổng số cây điều tra
TLB (%) = m x 100/n Với m: Số cây bị bệnh
n: Tổng số cây điều tra
3.4.4. Khảo sát hiệu quả thuốc trên vƣờn gỗ ghép
Bố trí thí nghiệm:
Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD: Completety Randomized Design). Số nghiệm thức: Từ kết quả 2 thí nghiệm trên chọn ra 5 loại thuốc 1 nồng độ thích hợp. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 6 nghiệm thức.
Bố thí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí 3 lần lặp lại (LLL) trên cùng 1 khu thí nghiệm là Vƣờn Nhân giống RRIV 4 (VNCCSVN) có cùng độ tuổi và mức độ nhiễm bệnh khá tƣơng đồng.
Mỗi nghiệm thức bố trí ngẫu nhiên trong 1 hàng. Trong 1 hàng chọn 10 cây, mỗi cây chọn 4 cành ở 4 hƣớng khác nhau, mỗi cành chọn 5 lá để theo dõi cố định. Mỗi nghiệm thức đƣợc bố trí cách ly nhau 1 hàng (Srinivas và Idicula, 2006).
Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng
LLL 1 LLL 2 LLL 3
DC Te Fl Cy He Pr He Fl Pr Cy DC Te Cy Pr He Te DC Fl
Thời gian thực hiện: từ ngày 09/07/07 đến ngày 02/08/07 Cách thực hiện:
Ghi nhận cấp bệnh 1 ngày trƣớc khi phun đợt đầu (Đợt 1- kiểm trắng)
Thực hiện phun thuốc tƣơng ứng với từng lô quy định. Tiến hành phun làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 7 ngày. Sau 6 ngày trong mỗi đợt phun thì tiến hành ghi nhận cấp bệnh trên các lá đã đánh dấu sẵn.
Đánh giá kết quả:
Dựa vào tỷ lệ bệnh (TLB) và chỉ số bệnh (CSB) của các nghiệm thức so với đối chứng để đi đến kết luận về hiệu quả thuốc.
3.5. Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Statgraphics Ver. 7.0, MSTATC để so sánh hiệu quả sử dụng hóa chất thí nghiệm ở mức α = 0,05 hay LSD (95%) (Least Significant Difference).
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.Kết quả phân lập mẫu nấm
Một trong những kỹ thuật cơ bản trong công tác nghiên cứu bảo vệ thực vật, đặc biệt đối với những loại nấm ký sinh, là phân lập và thuần chủng trong môi trƣờng nhân tạo. Đối với nấm C. cassiicola đƣợc phân lập từ các vị trí nhiễm bệnh, trong đó vết bệnh trên lá thƣờng đƣợc sử dụng là nguồn chính để phân lập. Mục đích của việc phân lập này là định danh đƣợc nấm gây bệnh và tạo nguồn nấm cho những nghiên cứu khác, nhƣ đánh giá hiệu lực của các loại thuốc trừ nấm sẽ đề cập trong những phần tiếp theo.
Sau khi tiến hành cấy mẫu nấm vào đĩa 1 ngày thì khuẩn ty bắt đầu phát triển từ vết cấy, khuẩn lạc sẽ hình thành rõ rệt ở ngày thứ 3. Tiếp theo, khuẩn lạc đƣợc quan sát và định danh theo cán bộ nghiện cứu của bộ môn BVTV, rồi đƣợc cấy chuyền sang đĩa petri mới. Những khuẩn lạc này đƣợc kích thích để hình thành bào tử và quan sát chúng dƣới kính hiển vi dựa trên tài liệu nghiên cứu của các tác giả đã công bố (bào tử màu nâu nhạt với dạng hình lƣỡi liềm hay thẳng chứa nhiều vách ngăn. Chiều dài biến thiên lớn (22 – 300 m). Chiều rộng biến thiên từ 5 – 10 m (Ellis và Holiday, 1971)) nhằm xác định độ chính xác của nấm
C. cassiicola (hình 4.1 và hình 4.2). Sau cùng, nấm đƣợc cấy qua ống nghiệm có chứa môi trƣờng PDA để bảo quản và dùng làm nguồn nấm cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 4.1. Khuẩn lạc và bào tử nấm C. cassiicola sau khi phân lập (vật kính X40)
Hình 4.2. Bào tử nấm C. cassiicola trên lá cao su
Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN.
4.2.Khảo sát ảnh hƣởng các loại thuốc trên môi trƣờng in vitro 4.2.1. Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc của các loại thuốc 4.2.1. Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc của các loại thuốc
Một trong những tác động của thuốc trừ nấm lên một loại nấm ký sinh là khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn lạc. Việc thực hiện thử nghiệm in vitro bằng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng (poisioned food technique) đã chuẩn hoá và đƣợc các nhà nghiên cứu BVTV áp dụng rộng rãi. Phƣơng pháp này không những cho phép đánh giá nhanh hiệu quả của thuốc trừ nấm trên một loại nấm ký sinh, mà còn
có chi phí thấp. Qua thử thuốc bằng phƣơng pháp in vitro xác định đƣợc chỉ số LD50 (liều làm chết 50% cá thể), từ đó xác định đƣợc nồng độ của thuốc khi áp dụng ngoài đồng. Chẳng hạn, nhƣ đối với Validacin 5L nồng độ thuốc có hiệu lực ngoài đồng bằng LD50*100. Phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng đã đƣợc áp dụng trên
C. samonicolor, Phytophthora spp gây bệnh nấm hồng và loét sọc mặt cạo (Huỳnh Hữu Tấn, 1996), trên C. gloeosporioides gây bệnh héo đen đầu lá (Radziah & Omar, 1985 - trích dẫn bởi Nguyễn Đôn Hiệu, 2004).
Đề tài bƣớc đầu sử dụng phƣơng pháp này để đánh giá hiệu lực của một số thuốc trừ nấm gốc Triazole trên C. cassiicola. Tiếp theo, những loại thuốc và nồng độ thích hợp sẽ đƣợc khảo sát trên lá cao su cắt rời trong phòng thí nghiệm (phƣơng pháp in vivo) và từ kết quả này làm cơ sở để chọn đƣợc loại thuốc và nồng độ thích hợp nhất áp dụng ra ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm in vitro đƣợc tiến hành đánh giá tốc độ phát triển của nấm
C. cassiicola bằng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng với các loại thuốc trừ nấm. Những loại thuốc nào có hiệu quả trị nấm tốt thì khuẩn ty sẽ kém phát triển hoặc bị ức chế hoàn toàn so với nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc. Đƣờng kính khuẩn lạc đƣợc theo dõi hàng ngày trong suốt thời gian thí nghiệm, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Theo dõi trên bảng 4.1, ở ngày đầu tiên, thuốc Hexaconazole ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm ở ngay nồng độ thấp là 2,5 ppm. Điều này chứng tỏ
Hexaconazole cho hiệu quả ức chế cao nhất ngay từ những ngày đầu tiên. Các ngày tiếp theo, thuốc Hexaconazole cũng ức chế hoàn toàn sự phát triển khuẩn ty ở các nồng độ 12,5 và 25 ppm.
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến đƣờng kính khuẩn lạc C. cassiicola Thuốc Nồng độ
(ppm-ai)
Đƣờng kính khuẩn lạc trung bình (cm) % Ức chế đƣờng kính khuẩn lạc 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày
Cyproco- nazole 0,1 1,2 2,5 4,1 5,5 27,1 36,6 38,4 36,9 0,5 0,9 1,8 3,0 3,8 44,7 55,6 55,5 55,6 2,5 0,5 1,0 1,6 2,2 65,6 74,8 76,7 74,8 12,5 0,0 0,0 0,3 0,3 100,0 100,0 96,3 96,5 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Difenoco- nazole 0,1 1,0 2,1 3,2 4,3 34,9 49,0 52,1 50,5 0,5 0,9 1,5 2,3 3,1 42,8 64,0 66,4 64,4 2,5 1,0 1,7 2,3 3,0 34,8 58,4 65,1 65,8 12,5 0,9 1,6 2,2 2,6 43,4 60,9 67,4 69,9 25 0,3 1,4 2,0 2,4 83,7 64,7 69,4 72,0 Flusila- zole 0,1 0,9 1,9 3,1 4,2 42,3 52,8 52,3 51,3 0,5 0,8 1,4 2,3 3,1 48,8 65,7 64,3 64,0 2,5 0,5 1,0 1,6 2,1 65,6 75,8 76,1 75,1 12,5 0,0 0,0 0,8 1,1 100,0 100,0 87,3 87,9 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Hexaco- nazole 0,1 0,9 1,9 3,0 4,1 43,2 54,1 54,8 53,0 0,5 0,8 1,3 2,1 2,9 48,8 68,5 68,0 66,3