Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại Đắk Lắk

Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí

+ Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả năng di động khi còn non. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy. + Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả năng di động và hình thành nang xác.

+ Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả năng di động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [7].

Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu

Trên môi trường đặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất động. Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi qua vết thương ở vỏ rễ. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ thành lông hút tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ.

Theo tính toán của các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha. Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn, bóng, nhầy, không màu. Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển được ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm.

Azorhizobium Là một giống mới được đề nghị với một loài là Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của Sesbania rostrata. Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được phân lập từ Trung Quốc.

Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ đậu

Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đường kính 1àm, dài 2,1 - 3,8àm chuyển động trong mụi trường lỏng bởi một tiờm mao dài ở đầu ( polan flagellum), trong môi trường đặc ở 300C nhiều tiêm mao bên (lateral flagellum) ngắn hơn cũng được thành lập. Một số báo cáo gần đây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins. Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001).

Năng suất của cây lúa có chủng loài Burkholderia vietnamiensis tương đương với năng suất của cây lúa không chủng loài Burkholderia vietnamiensis nhưng có bón phân đạm 25 - 30kg/ha (Van et al, 2000). Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng ở miền nam Việt Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chúng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, rễ tăng 57% diện tích lá tăng 30% năng xuất lúa tăng 13- 22% (La Nguyễn Tường Vi, 2010). Tiến hành chủng vi khuẩn Herpaspirillum seropedicae và giống vi khuẩn Burkholderia vào cây lúa, kết quả cho thấy vi khuẩn có khả năng cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Vera et al., 2000).

Burkholderia cenocepacia là một trong 9 loài của các phức Burkholderia cepacia đã được đánh và khẳng định là một trong số những vi sinh vật đa năng trao đổi chất được biết đến nhiều nhất, đang phát triển trên hơn 200 hợp chất hữu cơ, sửa chữa N2. Những ngiên cứu khảo sát khả năng cố định đạm của Burkholderia cho thấy khi chúng sống cộng sinh trong cây bắp trồng ở Mexico cố định đạm tốt như ở cây mía trồng ở Brazil và Nam Phi (Reis et al., 2004).

Phương pháp nghiên cứu

• Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh
• Phương pháp xác định khả năng cố định N của các chủng vi khuẩn
• Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn

Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm sinh học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994. Sau 60h thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đánh giá hoạt tính cố định đạm của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được dựa trên N tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô.

N tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô của các lô thực nghiệm càng cao hơn so với lô đối chứng, chứng tỏ hoạt tính cố định đạm của chủng vi khuẩn càng mạnh. Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 20ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).

Cũng như những chi tiêu sinh trưởng, tích lũy cholrophyll, N, P..chúng tôi sẽ tuyển chọn các chủng cho phản ứng tốt với các chỉ tiêu trên và tiến hành PCR để xác định sự tồn tại của gen nifH trong các chủng vi khuẩn nội sinh này. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thuận lợi nhất chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc 150 vòng/phút.