2.1. Cơ sở khoa học
2.1.4. Một số vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp auxin
Azospirillum là loài vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ, vùng đất xung quang rễ, thân và lá của cây trồng [59]. Azospirillum sp. thuộc giống Rhodosprillales, Gram âm, sống tự do. Azospirillum sp. có khả năng cố định nitơ từ không khí, tổng hợp IAA, hòa tan lân dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác [42]. Hiện nay có 13 loài Azosprillum sp. là A. brasilense và A. lipoferrum [84], A.
amazonense [67], A. halopraeferens [75], A. irakense [62], A. largomobile [50], A.
doeberinerae [52], A. oryae [91], A. melinis [72], A. canadenis và A. zeae [70], A.
rugosum [92], và gần đây nhất là A. picis [65].
Sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum ở một số loại hoa màu
Bảng 2.2. Sự hiện diện của vi khuẩn Azosprillum ở một số loại hoa màu Loài Azopirillum Loại rau màu Sự hiện diện/các bộ
phận của cây
Azospirillum brasilense
Ngũ cốc Rễ, thân , hạt
Cỏ Rễ, thân
Mía Rễ, thân , lá
Cây cỏ dầu Rễ, thân, trái
Azospirillum lipoferum
Ngũ cốc Rễ, thân , hạt, nhựa
nguyên
Cỏ Rễ, lá
Mía Rễ, thân , lá
Cây có củ Củ, rễ
Cây cọ dầu Rễ, thân , lá
Azospirillum amazonense
Ngũ cốc Rễ, thân, hạt
Mía Rễ, thân
Cây cọ dầu Rễ, thân, trái
Azospirillum ỉakense Lúa Rễ
(Nguồn : Dobereiner et al.,1995)
Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài Azospirillum được mô tả.
Chỳng là những vi khuẩn Gram õm hỡnh quờ hay chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5 àm và chiều dài 2,0 – 3,0 àm, tăng trưởng tốt ở 300C và pH từ 6 – 7 [40], chiờn mao cú vành lông rung với những bước sóng ngắn được dùng khi di chuyển và một chiên mao dùng để bơi lội trong môi trường lỏng. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 35 -370C. Khuẩn lạc trên môi trường agar – khoai tây có màu hồng nhạt hoặc đậm.
Theo Dobereiner và Pedrosa ( 1987) thì Azospirillum lipoferum có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện hiếu khí và yếm khí nhưng thích hợp trong điều kiện vi hiếu khí với sự có hoặc không có đạm trong môi trường. Trong quá trình sống Azospirillum lipoferum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như
Indole – 3 acetic acid (IAA), Indole – 3 butyric acid (IBA), Abscisic acid (ABA) và cytokynine. Khi chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum lipoferum vào cây bắp có thể tăng năng suất 6,6 lần so với đối chứng và tiết kiệm được 90 kg N/ha [30].
2.1.4.2. Gluconacetobacter diazotrophicus
Vi khuẩn gluconacetobacter thuộc họ Acetobacteraceae, gram âm, hiếu khí bắt buộc, có khả năng chống chịu với acid, nồng độ muối và đường cao [43]. Hiện nay có 4 loại Gluconacetobacter đã được phân lập: Gluconacetobacter diazotrophicus trên cây mía, Gluconacetobacter johannae và Gluconacetobacter azotocaptans trên cây cà phê và Gluconacetobacter liquefaciens có trong vùng rễ của những cánh đồng lúa có mưa acid xuất hiện.
Năm 1988, Cavancante và Dobereiner phân lập được vi khuẩn cố định đạm trong rễ, thân mía đường trồng tại Brazil và sau này đặt tên là Gluconacetobacter diazotropphicus. Loài vi khuẩn này có khả năng cố định đạm sinh học, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng, tổng hợp auxin và gibberellin, hòa tan lân khó tan.
Gluconacetobacter diazotropphicus là một vi khuẩn gram âm hiếu khí, chịu được môi trường acid phù hợp cho các loại đất phèn, tế bào có dạng que ngắn thẳng.
Dưới kính hiển vi điện tử vi khuẩn này ở dạng tế bào đơn, đôi hoặc dầy dài do các tế bào nối lại mà không có nội bào tử. Vi khuẩn này phát triển ở nồng độ sucrose cao (10%) và pH thấp, đặc biệt có khả năng cố định đạm dưới điều kiện ít oxy.
Nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn là sucrose 10% nhưng ở nồng độ cao hơn 30% nó vẫn phát triển được. Bởi vì sucrose không được vận chuyển hoặc hấp thu bởi Gluconacetobacter diazotropphicus nên vi khuẩn sẽ tự tạo ra enzyme ngoại bào, có thể thủy phân sucrose thành fructose và glucose. Những nguồn carbon và nitơ khác giúp cho sự phát triển của vi khuẩn như glucose, gluconate, fructose, mannitol, galactose, sodium gluconate, các acid amin như glutamate, serine, phospho và histidine. Tuy nhiên những chất như : cellulose, tinh bột, meso – erythritol và methanol 1% là những chất không tốt cho sự phát triển của chúng dù ở nồng độ thấp. Acid hữu cơ như succinate, acid dicarboxylic, đặc biệt là acid 2 – keto gluconic có trong cây mía giúp cho sự phát triển của vi khuẩn này. Vi khuẩn có thể dùng acid hữu cơ làm nguồn carbon và có khả năng
cố định đạm cao với pH tối ưu là 5,5 tuy nhiên pH vẫn có thể thay đổi tùy theo nguồn carbon.
Gần đây, Luna và ctv (2000) [66] cho biết sinh khối của Gluconacetobacter diazotropphicus trong điều kiện cố định đạm sẽ thấp hơn 30% so với trong điều kiện không cố định đạm. Vi khuẩn không có ảnh hưởng ức chế của nitrate trong môi trường cố định đạm thậm chí có thể dùng kết hợp với phospho. Hiện tượng này là do sự có mặt của enzyme nitrate reductase trong Gluconacetobacter diazotropphicus. Reis và Dobereiner (1998) [51] cho biết nitrogenase của loài vi sinh vật này được bảo vệ chống lại sự ức chế của O2 ở nồng độ sucrose cao, nhưng lại dễ bị ức chế khi nồng độ sucrose là 1%. Vừa qua người ta đã phân lập được dòng vi khuẩn Gluconacetobacter mới từ lúa mà có thể chịu đựng đến 15mM nitrate trong môi trường nuôi cấy, điều này rất hữu ích cho những thí nghiệm về phân vi sinh trong điều kiện nitơ không kiểm soát được. Ngoài ra Gluconacetobacter diazotropphicus có thể chịu đựng được các loại kháng sinh khác như : ampiciline, erythromicine và roxithromycine.
Ngoài khả năng cố định đạm, người ta còn phát hiện khả năng tạo ra kích thích tố tăng trưởng (Phytohormone) như Indole – 3- acetic acid (IAA), hòa tan lân và kẽm của vi khuẩn này. Việc sản xuất ra các kích thích tố tăng trưởng giúp cho cây tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng và giúp cây phát triển nhanh những enzyme như ACC deaminnase làm tăng sức đề kháng cho cây là nhân tố chính cho sự kích thích phát triển ở cây của vi khuản Gluconacetobacter diazotropphicus sống trong bộ rễ. Các chất như phospho, kẽm,...mặc dù chỉ cần một lượng nhỏ cho cây nhưng nó rất cần thiết cho sự phát triển của cây. Ở trong đất chúng tồn tại dưới dạng bất hoạt động, mà ở thể này cây không thể sử dụng được. Vì vậy nhiệm vụ của những dòng vi khuẩn hòa tan lân là chuyển phospho và kẽm thành những dạng hoạt động mà cây có thể hấp thụ dễ dàng, đây là một khả năng đặc biệt quan trọng, mang lại lợi ích cho nền nông nghiệp đã được tìm thấy ở Gluconacetobacter diazotropphicus [18].
2.1.4.3. Pseudomonas stutzeri
Pseudomonas stutzeri thuộc giới Bacteria; Ngành: Proteobacteria; Lớp:
Gamma proteobacteria; Bộ: Pseudomonadaceae; Giống: Pseudomonas; Loài:
Pseudomonas stutzeri [93].
Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi (trong đất, trong nước, thực vật, một số làm hư hỏng thực phẩm) và đa dạng nhiều chủng loại [74]. Một số nghiên cứu đã chứng minh những loài thuộc giống vi khuẩn Pseudomonas sp. có khả năng cố định đạm như Pseudomonas stutzeri, P. diminuta, P. fluorescens, P. paucimonilis, P. pseudoflava, P. putida, P. saccharophila, P.
vesicularis [48]. một số dòng vi khuẩn Pseudomonas cũng có khả năng hòa tan lân như Pseudomonas fluorescens, P. putida, P. chlororaphis [47].
Pseudomonas stutzeri thuộc vi khuẩn gram õm, hỡnh que, dài 1 - 3àm, rộng 0,5àm [60] là loài cú khả năng chuyển động, di chuyển bằng chiờn mao đỉnh.
Chúng được phân lập lần đầu tiên bởi Buri và Stutzer, có tên gọi Bacillus denitrificans II sau đó đổi tên thành Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen [88].
Pseudomonas stutzeri có môi trường phân bố rộng, là loài có tính đa dạng sinh học cao, sống được trong những điều kiện sinh thái khác nhau [64], sống trong đất, ao nuôi, đầm lầy, biển [77],[76],[81], các hóa chất làm giấy và trong các mẫu bệnh lý [77]. Gần đây, vi khuẩn Pseudomonas stutzeri còn được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo [83].
Bennasar et al.,(1998) [41] đã chứng minh dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả năng khử nitrate thành khí nitơ nhờ các gene nirS, nosZ, norB.
Ngoài khả năng khử đạm, một số dòng Pseudomonas stutzeri còn mang gene nifH có khả năng cố định đạm [64].
Các khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri được mô tả là không đồng nhất và có tính kiên định. Các dòng được phân lập có khuẩn lạc nhăn nheo, hơi đỏ, nâu, không vàng. Đặc tính điển hình là cứng, khô, gắn kết chặt [76].
2.1.4.4. Burkholderia vietnamiensis
Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kớnh khoảng 1àm, chỳng cú thể di chuyển nhờ cỏc chiờn mao ở đầu [44]. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong
môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất [44]. Trong môi trường nuôi cấy tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính 2-4mm, tròn, phẳng hoặc dài [44],[45]. Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây rồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong nhiều vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như bắp, mía, cà phê, lúa [78]. Vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở khóm, chuối [90].Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia [69] bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, rễ cây, kích thích các giai đoạn phát triển của cây [49], [71].
Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền nam Việt Nam [86]. Thí nghiệm ở lúa cho thấy loài Burkholderia vietnamiensis
Sau 14 ngày chủng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30%, năng suất lúa tăng 13 – 22% [87]. Thí nghiệm cũng cho thấy lúa được chủng vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis cho năng suất tương đương với lúa trồng ngoài đồng bón phân đạm 25 – 30kg N/ha [87].
2.1.4.5. Klebsiella pneumoniae
Các dòng vi khuẩn Klebsiella được nghiên cứu nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc.
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ – Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, hình que, ít di chuyển, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số sống nội sinh trong cây trồng [94].
Klebsiella pneumoniae là vi khuẩn Gram âm, hình que. Sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí trên môi trường bán đặc, chúng phát triển thành lớp màng mỏng cách mặt môi trường nuôi cấy khoảng 0,5 – 1cm. Đối với những dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Nfb, khi tăng trưởng chúng làm biến đổi màu của bromothymol blue trên môi trường từ màu xanh lá cây ( trung tính, pH = 6,8) sang màu xanh dương đậm của môi trường kiềm.