PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6. Phương pháp nghiên cứu
3.6.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn
Cách tiến hành:
1. Trước hết các mẫu đất phải được xử lý trước khi phân lập bằng cách phơi khô ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày, sau đó dùng rây qua sàng có kích thước 2-3mm.
2. Cân 1g đất đã xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, dùng vortex hoà tan đất.
3. Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5 là 2 nồng độ thích hợp để phân lập vi sinh vật trong đất ở Việt Nam.
4. Hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Peptri chứa môi trường thạch Burk’ vô đạm . Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô thì dừng lại.
5. Đặt đĩa thạch trong tủ 300C, phân vi sinh vật từ những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch sau khoảng thời gian 4- 10 ngày [7].
6. Sau khoảng thời gian từ 4 – 6 ngày , ta quan sát hình thái và khả năng phát triển của khuẩn lạc trên môi trường vô đạm, từ đó tách riêng rẽ những khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn cố định đạm, cấy chuyển nhiều lần sang môi trường như trên cho đến khi các khuẩn lạc tách rời và đều so với các khuẩn lạc khác trên môi trường.
7. Tiến hành cấy giữ giống sau khi làm thuần, ta cấy giữ giống vào môi trường Burk’ trong ống thạch nghiêng và bảo quản ở 40C. Mỗi chủng giữ vào 2 ống thạch nghiêng, 1 để cất giữ và một để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [36].
3.6.2.2.Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trên môi trường Ashby thạch đĩa theo phương pháp Koch [9]
Tiến hành cấy các chủng vi khuẩn phân lập được ở trên vào đĩa petri chứa môi trường Ashby thạch. Đưa các đĩa thạch đã được cấy chủng vi khuẩn vào tủ 300C sau 4 - 5 ngày tiến hành quan sát kích thước khuẩn lạc, đo kích thước và chọn ra những chủng có kích thước lớn để thực hiện các bước tiếp theo.
Ngoài ra để xác định khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được bằng phương pháp định lượng đạm tổng số - Kjeldnhl.
Nguyên lý
Đẩy muối amoni ra thể tự do bằng một chất kiềm mạnh hơn amoniac nhưng không quá mạnh (như Mg(OH)2 hay Na2CO3) để tránh ảnh hưởng thực phẩm. Dùng hơi nước kéo amoniac đã được giải phóng ra thể tự do sang bình chuẩn độ và định lượng bằng H2SO4 0,1N với alizainnatri sunfonat làm chỉ thị màu.
Tiến hành
- Trong phương pháp định lượng amoniac, nước sử dụng nhất thiết không được có amoniac hay muối amoni. Do đó trước khi cất kéo amoniac để định lượng phải rửa máy cho thật kỹ để loại amoniac (nếu có).
- Cân hoặc hút chính xác m(g) hoặc V(ml) mẫu, cho vào bình cầu B chứa nước trung tính đã cất kéo hơi nước để rửa máy ở trên cùng với 0,5ml chỉ thị màu.
Cho MgO bột vào tới khi có phản ứng kiềm rõ rệt (màu tím).
Chú ý: Đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra.
Để tránh bọt sủi phồng lên có thể cho thêm vài giọt dầu paraffin hoặc cồn octylic.
- Đun sôi, hơi nước bốc lên ở bình A, qua bình đựng thực phẩm B kéo NH3 theo khi qua ống sinh hàn sẽ đọng lại, rơi xuống bình chuẩn độ D đã đựng sẵn nước trung tính, chỉ thị màu và một lượng xác định (ml) H2SO4 0,1N.
- Cất cho đến khi hơi nước bay ra không còn NH3 nữa. Hơi NH3 bay ra kết hợp với H2SO4 thành (NH4)2SO4. Chuẩn độ H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH 0,1N.
Chú ý: Đầu ra của bộ chưng cất phải nhúng chìm vào dung dịch H2SO4 ở bình tam giác
Tính kết quả
1,7 *(VH2SO4 – VNaOH) Hàm lượng NH3 trong 1000ml = V
3.5.2.4. Phương phá p xác đi ̣nh khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn b ằng phương pháp salkowski (glickman và Dessaux, 1995)
Định lƣợng IAA do vi khuẩn sinh ra
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn và môi rường LGIP lỏng (không N) hoặc Burk’ lỏng
- Cho 15 ml môi trường LGIP (Burk’) vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng dưới nhiệt ướt 121oC trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn gốc, thí nghiệm lắp lại 3 lần.
- Nuôi các dòng khuẩn trên máy lắc 150 vòng/phút, trùm kín các ống nghiệm trong bọc nilon để tránh IAA sinh ra bị phân hủy bởi ánh sáng.
- Định lượng IAA trong các ngày1, 2, 3, 4,5, 6 (sau khi chủng) Phương pháp định lượng:
- Chuẩn bị thuốc thử salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1 lít H2SO4 10,8M.
- Chuẩn bị phosphate buffer 200 ml:
A: KH2PO4 0,136 g/100ml nước cất.
B: K2HPO4 0,174 g/100ml nước cất.
Lấy 39 ml A và 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200 ml, điều chỉnh pH = 7 Đo nồng độ IAA trong dịch khuẩn:
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm nắp đen cho vào các ống eppendorf.
- Ly tâm 5500 vòng/phút trong 5 phút.
- Hút cẩn thận 1 ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống nghiệm.
- Cho 2 ml thuốc thử Salkowski R2 đã pha ở trên vào các ống nghiệm trên.
- Vortex và ủ hỗn hợp trong tối 15 phút dể phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm.
Dựa vào đường chuẩn định lượng nồng đọ IAA của vi khuẩn:
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: cân 0,0016 g IAA tinh khiết hòa tan với 10 ml phosphate buffer được nồng đọ là 160 ug/ml. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 10, 20, 30, 40, 80 ug/ml.
- Kết quả đo quang phổ OD của IAA tinh khiết ở các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 80 ug/ml đực vẽ thành đồ thị đường chuẩn IAA trên Excel trong hệ trục tọa độ Oxy với trục tung là phổ OD có giá trị từ 0 đến 3, trục hoành là nồng đọ IAA có giá trị từ 0 đến 80 ug/ml
- Kết quả đo của các dòng vi khuẩn được thay vào phương trình đường chuẩn , từ đó suy ra được nồng độ IAA của các dòng.
Xử lý số liệu và phân tích thống kê:
Sử dụng phần mềm MS Excel và phần mềm IRRISTAT để xử lý số liệu.