nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase, cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men

LÊ HỒNG PHÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP

LÊ HỒNG PHÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM

VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP.HCM - 2012

LÊ HỒNG PHÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM

VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

Chuyên ngành: Hóa Sinh

Cảm ơn NGUYỄN THỊ KIM CHÂU, người luôn hết lòng ủng hộ và giúp đỡ lớn lao

để tôi hoàn thành tốt luận án

Cảm ơn tất cả những thành viên trong nhóm dự án nghiên cứu sản xuất cà phê chất lượng cao nhằm mục đích xuất khẩu

1 Nguyễn Thảo Nguyên

2 Đỗ Đại Nghĩa

3 Nguyễn Thị Minh Trinh

4 Nguyễn Hữu Thái

5 Ngô Tiến Hiễn Vinh

11 Nguyễn Văn Hân

12 Nguyễn Thị Bảo Anh

13 Nguyễn Thị Cẩm Vân

14 Võ Ngọc Thanh

Đã nỗ lực cùng tôi vượt qua nhiều khó khăn và hỗ trợ tôi hoàn tất những nội dung nghiên cứu của luận án

Và cuối cùng cho tôi được cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và đồng nghiệp tại Khoa CNSH ĐH Quốc Tế nơi tôi đang công tác đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án

Tác giả luận án

Lê Hồng Phú

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu

và kết quả trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả Luận án

MỤC LỤC

Lời cam đoan I Mục lục II Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VI Danh mục các bảng VII Danh mục các hình IX

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 7

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÀ PHÊ 7

1.1.1 Sơ lược lịch sử phát triển cây cà phê ở Việt Nam 7

1.1.2 Giá trị kinh tế của cà phê 7

1.1.3 Tình hình sản xuất cà phê 8

1.1.4 Tầm quan trọng của ngành chế biến cà phê ở Việt Nam 8

1.1.5 Những vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu trong chế biến cà phê 8

1.2 TRÁI CÀ PHÊ 10

1.2.1 Cấu tạo trái cà phê 10

1.2 2 Thành phần hóa học 11

1.2.2.1 Thành phần hóa học của vỏ quả 11

1.2.2.2 Thành phần hóa học của lớp nhớt 12

1.3 NHÂN CÀ PHÊ 12

1.3.1 Thành phần hóa học của nhân cà phê 12

1.3.1.1 Carbohydrates 13

1.3.1.2 Hợp chất chứa nitơ 14

1.3.1.3 Acid chlorogenic 17

1.3.1.4 Hương thơm cà phê 18

1.3.1.5 Acid carboxylic 19

1.3.1.6 Các chất khoáng 20

1.3.2 Tính chất vật lý 20

1.4 PECTIN 21

1.4.1 Cấu tạo pectin 21

1.4.2 Tính chất của pectin 22

1.4.2.1 Tính chất làm đông đặc 22

1.4.2.2 Tính tạo gel của pectin 22

1.4.2.3 Tính nhớt của dung dịch pectin 22

1.4.2.4 Pectin ở trái cà phê 23

1.4.3 Ứng dụng 23

1.5 CELLULOSE 23

1.5.1 Cấu tạo 23

1.5.2 Tính chất 24

1.5.3 Ứng dụng 25

1.5.4 Cellulose ở trái cà phê 25

1.6 GIỚI THIỆU CHUNG ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE 25

1.6.1 Pectinase 26

1.6.1.1 Phân loại và cơ chế tác động 26

1.6.1.2 Ứng dụng 27

1.6.1.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme pectinase 27

1.6.2 Cellulase 27

1.6.2.1 Phân loại và cơ chế tác dụng 27

1.6.2.2 Ứng dụng 29

1.6.2.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase 30

1.7 GIỚI THIỆU VI SINH VẬT SINH PECTINASE VÀ CELLULASE ĐƯỢC NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN ÁN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VSV 30

1.7.1 Tổng quan chung về vi sinh vật 30

1.7.2 Phương pháp định danh vi sinh vật 31

1.8 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VIỆC TÁCH VỎ VÀ LÊN MEN CÀ PHÊ 32

1.8.1 Giới thiệu về tách vỏ cà phê 32

1.8.1.1 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trên thế giới 32

1.8.1.2 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trong nước 32

1.8.2 Giới thiệu về lên men cà phê 33

1.8.2.1 Sơ lược lên men cà phê trên thế giới 34

1.8.2.2 Sơ lược lên men cà phê trong nước 38

1.8.3 Tăng năng suất tách vỏ và lớp nhớt của cà phê tươi 39

1.8.4 Nâng cao hiệu suất trích ly cà phê bột 39

1.8.5 Cải thiện chất lượng cảm quan cà phê 39

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 VẬT LIỆU 41

2.1.1 Nhân cà phê 41

2.1.1.1 Giống 41

2.1.1.2 Nguồn gốc 41

2.1.2 Nguồn vi sinh vật nghiên cứu 41

2.1.2.1 Nấm sợi 41

2.1.2.2 Nấm men 41

2.1.2.3 Vi khuẩn 41

2.1.3 Môi trường sử dụng 41

2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 41

2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 41

2.1.3.2 Môi trường nhân giống 42

2.1.3.3 Môi trường giữ giống 42

2.1.4 Hóa chất 42

2.1.4.1 Hóa chất sử dụng cho môi trường 42

2.1.4.2 Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định hoạt tính enzyme 42

2.1.4.3 Hóa chất sử dụng cho các phương pháp xác định thành phần 43

2.1.5 Thiết bị - dụng cụ 43

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 44

2.2.1.1 Phương pháp phân lập giống vi sinh vật từ nhân cà phê 44

2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống (trong điều kiện vô trùng) 44

2.2.1.3 Phương pháp nhân giống 44

2.2.1.4 Phương pháp lên men 44

2.2.1.5 Phương pháp đếm tế bào vi sinh vật trong chế phẩm 45

2.2.2 Phương pháp hóa lý 45

2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm 45

2.2.2.2 Phương pháp trích chất hòa tan 46

2.2.2.3 Phương pháp nghiền 46

2.2.2.4 Phương pháp rây 46

2.2.2.5 Phương pháp ngâm 46

2.2.3 Phương pháp hóa sinh 47

2.2.3.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, pectinase 47

2.2.3.2 Các phương pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê 52

2.2.4 Phương pháp định danh vi sinh vật 60

2.2.4.1 Phương pháp định danh nấm sợi 60

2.2.4.2 Phương pháp định danh vi khuẩn và nấm men 61

2.2.5 Cách bố trí thí nghiệm 62

Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt và thành phần hóa học chủ yếu trong nhân cà phê 65

Thí nghiệm 2: Phân lập và định danh các chủng vi sinh vật từ vỏ, nhân cà phê 65

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính pectinase và cellulase 66

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê 71

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm trong lên men nhằm nâng

cao hiệu suất trích chất hòa tan và chất lượng cà phê 73

Thí nghiệm 6: Lên men cà phê theo cách kết hợp chế phẩm 75

Thí nghiệm 7: Kiểm tra độc tố aflatoxin, hàm lượng caffeine phẩm 75

Thí nghiệm 8: Đánh giá cảm quan 76

Thí nghiệm 9: Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 76

2.2.6 Phương pháp đánh giá cảm quan 76

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 79

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 80

3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU CÓ TRONG CÀ PHÊ 80

3.1.1 Thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt 80

3.1.2 Thành phần hóa học chủ yếu có trong nhân cà phê 80

3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT 82

3.2.1 Phân lập và định danh các chủng nấm sợi trên vỏ, nhân cà phê 82

3.2.2 Phân lập và định danh các chủng nấm men và vi khuẩn trên vỏ, nhân cà phê 86

3.3 NGHIÊN CỨU TẠO CÁC CHẾ PHẨM VSV 89

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 89

3.3.1.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 89

3.3.1.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 94

3.3.1.3 Xác định thời gian tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng nấm sợi 96

3.3.1.4 Xác định nồng độ đường ( o Brix ) của dung dịch malt đến sự sinh tổng hợp enzyme pectinase 101

3.3.1.5 Xác định pH ban đầu dung dịch malt đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 103

43.3.1.6 Ảnh hưởng của lượng muối (NH 4 ) 2 SO 4 bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 105

3.3.1.7 Xác định nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 107

3.3.1.8 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 109

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 110

3.3.2.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 110

3.3.2.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 114

3.3.2.3 Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật 116

3.3.2.4 Tổng kết q uy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 120

3.4 KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN 121

3.4.1 Số lượng tế bào vsv thay đổi theo thời gian bảo quản 122

3.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase thay đổi theo thời gian bảo quản 123

3.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase thay đổi theo thời gian bảo quản 124

3.4.4 Tổng kết khảo sát chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản và sơ bộ hạch toán kinh tế 125

3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH VỎ CÀ PHÊ 125

3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng lượng chế phẩm vsv đến khả năng tách vỏ cà phê tươi 126

3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xử lý đến khả năng tách vỏ cà phê tươi 128

3.5.3 Tổng kết nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê và công nghệ tách vỏ cà phê 129

3.6 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN 129

3.6.1 Ảnh hưởng của thời gian ngâm và độ ẩm cà phê 130

3.6.2 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong nhân cà phê 130

3.6.2.1 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea arabica 131

3.6.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea robusta 131

3.6.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari 132

3.6.3 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan trong nhân cà phê 133

3.6.3.1 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất

hòa tan trong Coffea arabica 133

3.6.3.2 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea robusta 135

3.6.3.3 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari 137

3.6.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong nhân cà phê 139

3.6.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea C arabica của các CPVSV từ nấm sợi 139

3.6.4.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea C C robusta của các CPVSV từ nấm sợi 141

3.6.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari của các CPVSV từ nấm sợi 143

3.6.5 Tổng kết nghiên cứu lên men nhân cà phê và quy trình lên men 145

3.6.6 Nghiên cứu đánh giá cảm quan cà phê 145

3.6.6.1 Đánh giá cảm quan cà phê C arabica 146

3.6.6.2 Đánh giá cảm quan cà phê C robusta 147

3.6.6.3 Đánh giá cảm quan cà phê C chari 147

3.6.7 Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 148

3.6.7.1 Khảo sát nồng độ chất tan bởi lên men kết hợp 149

3.6.7.2 Khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng bởi lên men kết hợp 151

3.6.8 Quy trình tách vỏ và lên men cà phê bởi chế phẩm 153

3.6.8.1 Quy trình tách vỏ bởi chế phẩm vsv 153

3.6.8.2 Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv 154

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 157

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 159

TÀI LIỆU THAM KHẢO 161

PHỤ LỤC 170

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C arabica Coffea arabica Cà phê chè

C chari Coffea chari Cà phê mít

C robusta Coffea robusta Cà phê vối

khoai tây, glucose và thạch

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tỷ lệ các phần cấu tạo quả cà phê 11

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của vỏ quả 11

Bảng 1.3: Thành phần của lớp nhớt 12

Bảng 1.4: Thành phần hóa học của nhân cà phê 13

Bảng 1.5: Thành phần caffeine khan 15

Bảng 1.6: Hàm lượng amino acid tự do trong nhân cà phê 17

Bảng 1.7: Thành phần hương vị cà phê rang 19

Bảng 2.1: Các bước tiến hành đo độ hấp phụ của phản ứng enzyme và phản ứng thử không 49

Bảng 2.2: Dựng đường chuẩn glucose 50

Bảng 2.3: Bảng thực hiện phản ứng màu với antron 55

Bảng 2.4: Bảng điểm đánh giá chất lượng dịch cà phê 78

Bảng 2.5: Kết quả đánh giá chất lượng dịch cà phê thu được dựa theo bảng tổng số điểm 78

Bảng 2.6: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu 79

Bảng 2.7: Kết quả đánh giá chất lượng dịch cà phê thu được dựa theo bảng tổng số điểm 80

Bảng 3.1: Thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt cà phê 80

Bảng 3.2: Các thành phần hóa học chủ yếu trong nhân cà phê 81

Bảng 3.3: Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi phân lập 82

Bảng 3.4: Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm sợi phân lập 83

Bảng 3.5: Kết quả định danh các chủng phân lập được trên cà phê 85

Bảng 3.6: Kết quả xác định hình thái khuẩn lạc các chủng nấm sợi tuyển chọn nghiên cứu 86 Bảng 3.7: Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp pectinase và cellulase (đường kính vòng phân giải) của các chủng vi khuẩn và nấm men phân lập 87

Bảng 3.8: Kết quả định danh các chủng nấm men và vi khuẩn có hoạt tính cellulase và pectinase phân lập được từ cà phê 88

Bảng 3.9: Quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 109

Bảng 3.10: Quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 120

Bảng 3.11: Tên chủng vi sinh vật và tên chế phẩm tạo ra tương ứng 121

Bảng 3.12: Khảo sát chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản 122

Bảng 3.13: Sơ bộ chi phí trên một mẻ tạo chế phẩm 125

Bảng 3.14: Tỷ lệ tách vỏ cà phê 129

Bảng 3.15: Quy trình lên men cho 3 loại cà phê phổ biến ở Việt Nam 145

Bảng 3.16: Kết quả cảm quan trên đối tượng cà phê Arabica 146

Bảng 3.17: Kết quả cảm quan trên đối tượng cà phê Robusta 147

Bảng 3.18: Kết quả cảm quan trên đối tượng cà phê Chari 148

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cà phê vừa thu hoạch 10

Hình 1.2: Cấu tạo bên trong quả cà phê 10

Hình 1.3: Cấu trúc caffeine 12

Hình 1.4: Cấu trúc của trigonelline 16

Hình 1.5: Cấu tạo một đoạn của chuỗi pectin 21

Hình 1.6: Cấu tạo cellulose 24

Hình 1.7: Chế biến theo phương pháp ướt 35

Hình 1.8: Máy xát cà phê tươi 36

Hình 1.9: Các loại độc tố aflatoxin 40

Hình 3.1: Sự thủy giải CMC 85

Sơ đồ 2.1: Quy trình trích chất hòa tan 46

Sơ đồ 2.2: Các bước xây dựng đường chuẩn 49

Sơ đồ 2.3: Các bước xác định hoạt tính pectinase 51

Sơ đồ 2.4: Các bước xác định hàm lượng cellulose 53

Sơ đồ 2.5: Các bước xác định hàm lượng pectin 54

Sơ đồ 2.6: Các bước trích ly dung dịch đường từ mẫu cà phê 56

Sơ đồ 2.7: Các bước xác định hàm lượng đường tổng số hòa tan 57

Sơ đồ 2.8: Các bước xây dựng đường chuẩn glucose 58

Sơ đồ 2.9: Các bước xác định tổng lượng tro 59

Sơ đồ 2.10: Cách bố trí thí nghiệm 64

Sơ đồ 2.11: Quy trình lên men tách vỏ cà phê 72

Sơ đồ 3.1: Quy trình lên men tách vỏ cà phê 153

Sơ đồ 3.2: Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv có nguồn gốc từ nấm sợi 154

Sơ đồ 3.3: Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv có nguồn gốc từ nấm men và vi khuẩn 155

Sơ đồ 3.4: Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv có nguồn gốc từ nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 156

Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ cà rốt/môi trường đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi phân lập 90

Đồ thị 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ cà rốt/ môi trường đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi PTN 91

Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của 3 chủng nấm men 92

Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của 5 chủng vi khuẩn 93

Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi phân lập 95

Đồ thị 3.6: Ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi PTN 96

Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi phân lập 97

Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi PTN 98

Đồ thị 3.9: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

pectinase của 3 chủng nấm men 99

Đồ thị 3.10: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của 5 chủng vi khuẩn 100

Đồ thị 3.11: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường(oBrix) của dung dịch malt đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của 3 chủng nấm men 101

Đồ thị 3.12: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường (oBrix) của dung dịch malt đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của 5 chủng vi khuẩn 102

Đồ thị 3.13: Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của 3 chủng nấm men 103

Đồ thị 3.14: Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của 5 chủng vi khuẩn 104

Đồ thị 3.15: Ảnh hưởng của lượng muối (NH4)2SO4 đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của 3 chủng nấm men 105

Đồ thị 3.16: Ảnh hưởng của lượng muối (NH4)2SO4 đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của 5 chủng vi khuẩn 106

Đồ thị 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôiđến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của 3 chủng nấm men 107

Đồ thị 3.18: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của 5 chủng vi khuẩn 108

Đồ thị 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ trấu/ môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm sợi phân lập 110

Đồ thị 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ trấu/môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm sợi PTN 111

Đồ thị 3.21: Ảnh hưởng của tỷ lệ trấu/môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của 3 chủng nấm men 112

Đồ thị 3.22: Ảnh hưởng của tỷ lệ trấu/môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của 5 chủng vi khuẩn 113

Đồ thị 3.23: Ảnh hưởng độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm sợi phân lập 114

Đồ thị 3.24: Ảnh hưởng độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm sợi PTN 115

Đồ thị 3.25: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm sợi phân lập 116

Đồ thị 3.26: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm sợi PTN 117

Đồ thị 3.27: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của 3 chủng nấm men 118

Đồ thị 3.28: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của 5 chủng vi khuẩn 119

Đồ thị 3.29: Khảo sát số lượng tế bào vsv của các chế phẩm theo thời gian 123

Đồ thị 3.30: Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase của các chế phẩm theo thời gian 123

Đồ thị 3.31: Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của các chế phẩm theo thời gian 124

Đồ thị 3.32: Biến thiên lượng vỏ tách ra theo thời gian của các chế phẩm từ nấm sợi 128

Đồ thị 3.33: Độ ẩm của 3 loại cà phê theo thời gian ngâm nước 130

Đồ thị 3.34: Ảnh hưởng độ ẩm của hạt cà phê trong lên men bởi chế phẩm từ nấm sợi

đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea arabica 131

Đồ thị 3.35: Ảnh hưởng độ ẩm của hạt cà phê trong lên men bởi chế phẩm từ nấm sợi

đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea robusta 132

Đồ thị 3.36: Ảnh hưởng độ ẩm của hạt cà phê trong lên men bởi chế phẩm từ nấm sợi

đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari 132

Đồ thị 3.37: Ảnh hưởng của lượng CPVSV từ nấm sợi đến khả năng chiết chất hòa tan

trong Coffea arabica 133

Đồ thị 3.38: Ảnh hưởng của lượng CPVSV từ nấm men và vi khuẩn đến khả năng chiết

chất hòa tan trong Coffea arabica 134

Đồ thị 3.39: Ảnh hưởng của lượng CPVSV từ nấm sợi đến khả năng chiết chất hòa tan

trong Coffea robusta 135

Đồ thị 3.40: Ảnh hưởng của lượng CPVSV từ nấm men và vi khuẩn đến khả năng chiết

chất hòa tan trong Coffea robusta 136

Đồ thị 3.41: Ảnh hưởng của lượng CPVSV từ nấm sợi đến khả năng chiết chất hòa tan

trong Coffea chari 137

Đồ thị 3.42: Ảnh hưởng của lượng CPVSV từ nấm men và vi khuẩn đến khả năng chiết

chất hòa tan trong Coffea chari 138

Đồ thị 3.43 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong

Coffea arabica của các chế phẩm vsv từ nấm sợi 139

Đồ thị 3.44: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong

Coffea arabica của các chế phẩm vsv từ nấm men và vi khuẩn 140

Đồ thị 3.45 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong

Coffea robusta của các chế phẩm vsv từ nấm sợi 141

Đồ thị 3.46: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong

Coffea robusta của các chế phẩm vsv từ nấm men và vi khuẩn 142

Đồ thị 3.47: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong

Coffea chari của các chế phẩm vsv từ nấm sợi 143

Đồ thị 3.48: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong

Coffea chari của các chế phẩm vsv từ nấm men và vi khuẩn 144

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ tách vỏ theo lượng chế phẩm vi sinh vật 126 Biểu đồ 3.2: Mức chênh lệch tỷ lệ tách vỏ của mẫu thí nghiệm tăng so với mẫu đối

chứng 127 Biểu đồ 3.3: Khảo sát nồng độ chất tan bởi các chế phẩm đơn và chế phẩm kết hợp 150 Biểu đồ 3.4: Nồng độ chất tan tăng so với mẫu đối chứng bởi các chế phẩm đơn và chế

phẩm kết hợp 151 Biểu đồ 3.5: Nồng độ chất tan tăng so với mẫu đối chứng bởi các chế phẩm đơn và chế

phẩm kết hợp 152

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cà phê đã trở thành một thức uống không thể thiếu mỗi ngày Cà phê

là một loại thức uống cao cấp có giá trị về mặt sinh lý và sức khỏe con người, là đặc sản vùng nhiệt đới [50], [71] Nhu cầu đòi hỏi của người tiêu dùng với các sản phẩm có

cà phê không ngừng tăng lên Công nghiệp sản xuất cà phê ngày càng phát triển mạnh

mẽ, cà phê không chỉ là sản phẩm trong ngành công nghiệp cà phê mà còn là một thành phần không thể thiếu trong các sản phẩm công nghiệp khác như bánh kẹo, thức uống, hay thậm chí các chất trích từ cà phê đã được ứng dụng trong thuốc trị bệnh [76] Thành phần cà phê làm tăng cao chất lượng sản phẩm và thỏa mãn nhu cầu ngày càng

đa dạng của người tiêu dùng

Trên thế giới, ngành công nghiệp sản xuất cà phê hiện nay đang phát triển quy

mô lớn với yêu cầu cao về chất lượng cà phê Ngày nay, cà phê được sản xuất theo hai phương pháp: phương pháp khô và phương pháp ướt Phương pháp khô là phương pháp sản xuất truyền thống trong khi phương pháp ướt hay còn gọi là phương pháp lên men với sự hiện diện của enzyme hay chế phẩm vi sinh vật [55], [59] Phương pháp này khắc phục những nhược điểm của phương pháp khô (thời gian phơi kéo dài, lệ thuộc vào ánh sáng và ẩm độ, dễ bị nhiễm các vi sinh vật gây hại không mong muốn) [75] Đặc biệt, phương pháp chế biến này cho cà phê chất lượng cao Tuy nhiên, phương pháp ướt muốn triển khai tốt đòi hỏi phải có enzyme, cụ thể pectinase và cellulase, cho đến nay các enzyme này chủ yếu là nhập từ nước ngoài với giá cao (650-1.000 USD/thùng 20 L và chỉ dùng để xử lý cho 4 tấn cà phê hạt) Bài toán đặt ra liệu chăng có thể thay thế nguồn enzyme này bằng một nguồn chế phẩm vi sinh vật tương đương tại Việt Nam với chất lượng tương tự nhưng giá thành rẻ hơn

Ngoài ra, thực tế trong chế biến cà phê hiện nay tại Việt Nam, việc sử dụng các phương pháp truyền thống là dùng các hóa chất có tính acid và bazơ mạnh trong quy trình xử lý cà phê được các nhà khoa học cảnh báo dễ sinh các chất độc hại không mong muốn, tích lũy sinh học các chất này có thể gây ra các bệnh nan y như ung bướu hay ung thư Để khắc phục hậu quả này, công nghệ sinh học ngày nay ứng dụng những

chế phẩm sinh học có bản chất hữu cơ tác động đặc hiệu có kiểm soát và thân thiện với con người và môi trường vào quá trình xử lý cà phê [41], [92] Đó là chế phẩm vi sinh

mà bản chất là ứng dụng vsv và những enzyme được hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi sinh vật được sử dụng để xử lý cà phê

Cơ sở khoa học hướng nghiên cứu của đề tài

Tại Việt Nam, cây cà phê có mặt gần 150 năm, từ đó đến nay, sản lượng cà phê

đã tăng gấp 100 lần, đứng thứ hai trong số các nước sản xuất cà phê, đứng đầu về sản

xuất cà phê vối Coffea robusta Xuất khẩu cà phê mỗi năm đã mang lại cho đất nước ta

hàng trăm triệu đô la, thậm chí cả tỉ đô la Mỹ (2,7 tỉ USD năm 2011) Chúng ta vẫn chế biến cà phê chủ yếu theo phương pháp truyền thống cho chất lượng cà phê trung bình Trong một vài năm gần đây, đã có một số công ty mạnh dạn ứng dụng phương pháp mới nhưng quy mô còn nhỏ và chế phẩm ứng dụng chưa nhiều Một thực tế ở nhiều nước (Indonesia, Đài Loan,…) xuất hiện loại cà phê đặc biệt, đó là cà phê “chồn” Loại

cà phê này có chất lượng cao và rất phù hợp với người tiêu dùng cả ở Indonesia và ở Việt Nam Hằng năm, người ta sản xuất ra loại cà phê chồn không nhiều vì phụ thuộc chủ yếu vì sự tham gia chủ yếu của loài chồn hương có ở nông trường cà phê Loài chồn hương này chỉ ăn những trái cà phê chín và khi đi qua hệ tiêu hóa của chúng, nhân cà phê được trải qua giai đoạn lên men [90] Như vậy bản chất của cà phê chồn là nhân cà phê đã được lên men nên chất lượng rất cao Tương tự như vậy ở Đài Loan người ta cho khỉ ăn trái cà phê và nhân cà phê sau khi qua hệ tiêu hóa của khỉ cũng có chất lượng tương đương cà phê chồn Như vậy bản chất sinh học ở đây là một quá trình chuyển hóa tác động bởi enzyme có trong hệ thống tiêu hóa của các động vật Chính vì thế đề tài được đặt ra theo hướng nghiên cứu mới dạng “phỏng sinh học” nhằm tìm ra bản chất sinh hóa và từ đó xây dựng nên kỹ thuật mới nâng cao chất lượng cà phê Đề

tài được xác định là: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzyme

pectinase, cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê theo phương pháp lên men”

Mục tiêu đề tài:

Nghiên cứu tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp pectinase

và cellulase, tìm ra quy trình kỹ thuật lên men để nâng cao khả năng tách vỏ, trích ly chất hòa tan từ cà phê cũng như cải thiện tốt hương và vị nhằm nâng cao chất lượng cà

phê

Những nội dung nghiên cứu của đề tài:

1 Phân lập và thuần hóa các chủng nấm sợi, nấm men và vi khuẩn trong tự nhiên

từ vỏ cà phê

2 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase của những chủng thuần hóa và từ bộ sưu tập có sẵn của PTN và định danh các vi sinh vật

có hoạt tính các enzyme cao

3 Kiểm tra sơ bộ sự sinh tổng hợp độc tố của các chủng vi sinh vật (nếu có, chủng

vi sinh vật sẽ bị loại bỏ vì không thể sử dụng trong chế biến thực phẩm)

4 Nghiên cứu các điều kiện phù hợp để tạo các chế phẩm vsv bao gồm thành phần môi trường, độ ẩm, thời gian, pH ban đầu, nhiệt độ, …

5 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nhằm tăng khả năng tách vỏ của cà phê tươi

6 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men nhằm tăng khả năng trích ly các chất hòa tan như độ ẩm nhân cà phê, tỉ lệ chế phẩm đưa vào lên men, thời gian lên men thông qua chỉ số oBrix sản phẩm sau lên men (thành phần chất hòa tan)

7 Xây dựng quy trình công nghệ lên men cà phê

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Những đóng góp mới của luận án:

- Định danh và thuần hóa hệ các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp pectinase và cellulase từ đối tượng cà phê Việt Nam: Kết quả thu được 7 chủng vsv

từ nguồn phân lập sinh tổng hợp được cả hai enzyme trên Kết quả định danh cho thấy

1 chủng thuộc giống Rhizopus và 6 chủng đều thuộc giống Aspergillus Tuy nhiên, kết

quả lại cho thấy có hai chủng dương tính có sản sinh độc tố aflatoxin, ochratoxin là

Rhizopus oryzae và Aspergillus fumigatus Năm chủng còn lại không sinh độc tố là Aspergillus carbonarius, A japonicus, A flavus, A phoenicis, A tubingensis Ngoài 5

chủng nấm sợi phân lập, đề tài cũng xác định có 5 chủng nấm sợi tại PTN có khả năng sinh tổng hợp pectinase và cellulase cao có thể ứng dụng trong xử lý cà phê Các chủng

nấm sợi này bao gồm Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Trichoderma

longibrachiatum, Trichoderma piluliferum, Trichoderma reesei Phân lập nấm men và

vi khuẩn từ vỏ và nhân cà phê, kết quả thu được 18 chủng Bước đầu khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp pectinase và cellulase cho thấy có 8 chủng có khả năng này Trong đó có 3 chủng nấm men và 5 chủng vi khuẩn Định danh các chủng nấm men bằng kỹ thuật giải trình tự gen 28S rRNA và xác định trên BLAST NCBI và vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA và xác định trên BLAST NCBI Kiểm tra khả năng sinh độc tố của các chủng này bằng phương pháp AOAC 999.07 – 2000 Kết quả

thu được 3 chủng nấm men và 5 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp pectinase, cellulase và không sinh độc tố, có tên Candida tropicalis, Issatchenkia orientalis,

Pichia guilliermonii, Bacillus megaterium D, B subtilis E, B subtilis K, B subtilis N,

B subtilis T Việc phân lập những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp pectinase và

cellulase từ đối tượng cà phê Việt Nam chưa có nghiên cứu trong và ngoài nước đề cập đến cho đến nay

- Tối ưu hóa một số điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật: Đã nghiên cứu các

điều kiện tối ưu để sản xuất 18 chế phẩm như thành phần môi trường, độ ẩm, thời gian

để sinh tổng hợp pectinase và cellulase đối với các chủng nấm sợi, và thành phần môi trường, độ ẩm, thời gian, độ Brix, pH ban đầu và (NH4)2SO4 để sinh tổng hợp pectinase

và cellulase đối với các chủng nấm men và vi khuẩn Những chủng nấm sợi như

Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, T reesei hay các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium, B subtilis đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện để sinh tổng hợp nhiều

loại enzyme và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực lên men, kháng bệnh và cân bằng sinh học trong nông nghiệp cũng như trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Tuy vậy, việc nghiên cứu những chủng vi sinh vật nêu trên đã thích nghi trên đối tượng cà phê là chưa nhiều và kết quả của đề tài góp phần thêm vào sự hiểu biết chung, cụ thể các điều

kiện tối ưu sinh tổng hợp các enzyme này Ở nước ngoài, nghiên cứu về sinh tổng hợp

cellulase của các chủng vsv như Aspergillus phoenicis, Trichoderma longibrachiatum,

Aspergillus flavus đã có một số công trình nhưng ở Việt Nam thì còn hạn chế Đặc biệt,

việc nghiên cứu sinh tổng hợp pectinase ở 3 chủng này chưa được công bố trước đây ở

cả trong nước và nước ngoài Ngoài ra, tính mới đặc biệt thể hiện trong những khảo sát

tối ưu quá trình sinh tổng hợp pectinase và cellulase ở các chủng Trichoderma

piluliferum, Aspergillus carbonarius, Aspergillus japonicus, Aspergillus tubingensis, Candida tropicalis, Pichia guilliermonii, Issatchenkia orientalis Những chủng nấm sợi

và nấm men vừa được nêu chủ yếu được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme phân giải liên kết α-glucosidic Nhưng nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp enzyme thủy phân β-glucosidic là pectinase, cellulase thì chưa được thực hiện cho đến luận án này

- Đã tạo được các chế phẩm có thể ứng dụng quy mô công nghiệp trong việc tách vỏ cà phê: Đã thử nghiệm và thấy rằng có 5 chế phẩm có thể ứng dụng cho tách

vỏ cà phê tươi cụ thể là những chế phẩm được tạo ra từ các chủng nấm sợi sau:

Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Aspergillus phoenicis, Trichoderma reesei, Aspergillus tubingensis Lượng chế phẩm sử dụng từ 5 đến 6% và thời gian lên men

tách vỏ là 9 - 10 giờ tùy từng loại chế phẩm

- Đã tạo được các chế phẩm có thể ứng dụng quy mô công nghiệp trong việc làm tăng chất trích hòa tan và cảm quan tốt về hương và vị: Nghiên cứu tối ưu hóa

các điều kiện lên men các loại cà phê: như độ ẩm nhân cà phê, tỉ lệ chế phẩm đưa vào lên men, thời gian lên men thông qua chỉ số độ Brix sản phẩm sau lên men (thành phần chất hòa tan) Cà phê lên men phải được ngâm trong nước 1,5 giờ để đạt độ ẩm 53-

60%W, để ráo nước và tiến hành lên men với 8 chế phẩm Các chế phẩm biocoffee-1,

biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8, và biocoffee-10 lên men cà phê trong môi trường

rắn ẩm Còn các chế phẩm còn lại Biocoffee-12, Biocoffee-14 và biocoffee-15 tiến hành

lên men trong môi trường lỏng Cà phê lên men đã được tiến hành đánh giá cảm quan

và kết quả cho thấy các loại cà phê lên men đạt điểm cao hơn (tốt và xuất sắc) so với cà phê không lên men (trung bình hoặc dưới trung bình) Cà phê lên men có hương vị đậm

đà, hậu vị tốt Trích ly được nồng độ các chất hòa tan tăng đến 53% so với mẫu đối

chứng khi sử dụng các chế phẩm đơn, đặc biệt nồng độ chất trích hòa tan tăng đến 68% khi sử dụng phối hợp các chế phẩm Khảo sát hàm lượng caffeine trong hạt cà phê sau lên men chế phẩm đơn hoặc phối hợp chế phẩm cũng thu được kết quả ấn tượng, tăng 38% đối với chế phẩm đơn và đặc biệt tăng 46% đối với phối hợp chế phẩm Ngoài ra,

cà phê lên men ở điều kiện thu được chất hòa tan, cũng như caffeine cao hương vị, và các chỉ tiêu cảm quan hình thái màu sắc của cà phê đều đạt, thậm chí chất lượng cảm quan cải thiện khá rõ rệt

- Ý nghĩa thực tiễn của luận án

- Đề tài thành công đã góp phần làm sang tỏ quy trình sản xuất chế phẩm vsv mang hoạt tính pectinase và cellulase và ứng dụng của chúng trong việc tách vỏ và lên men cà phê nhằm tăng hiệu suất trích ly các chất hòa tan và cải thiện hương vị cà phê trong điều kiện Việt Nam Kết quả có thể ứng dụng tại các công ty sản xuất nhân cà phê, đặc biệt có thể ứng dụng tại các công ty sản xuất cà phê hòa tan

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÀ PHÊ

1.1.1 Sơ lược lịch sử phát triển cây cà phê ở Việt Nam

Ở Việt Nam cây cà phê chè (C arabica) xuất hiện vào năm 1857 tại Bố Trạch (Bình Trị Thiên) Sau đó vào năm 1905 thì thực dân Pháp nhập loại cây cà phê vối (C

robusta) và cà phê mít (C chari) trồng ở Hòa Bình, Sơn Tây Mãi đến năm 1920

-1925, sau khi phát hiện các vùng đất bazan phì nhiêu ở Tây Nguyên thì người Pháp bắt đầu khai thác và trồng trọt tại đây 6 , 13

Qua hơn 1 thế kỷ từ ngày trồng thử cây cà phê đầu tiên ở nước ta đến nay cây cà phê đã đứng vững trên một thị trường rộng lớn từ Bắc đến Nam Diện tích trồng cà phê

ở Việt Nam lên đến 500.000 ha, hằng năm cho sản lượng xuất khẩu trên 1,3 triệu tấn Hiện nay giá trị kim ngạch giá trị xuất khẩu của cà phê chỉ đứng sau lúa gạo 13

1.1.2 Giá trị kinh tế của cà phê

Cà phê được trồng và xuất khẩu ở hơn 70 nước đang phát triển ở vành đai nhiệt đới và á nhiệt đới, phần lớn sản phẩm được nhập khẩu và tiêu thụ ở các nước ôn đới và công nghiệp phát triển và mức tiêu thụ cà phê trên thế giới ngày càng cao Giá trị kinh

tế của cà phê rất to lớn:

- Là mặt hàng tiêu thụ nội địa mạnh

- Là mặt hàng buôn bán lớn của thế giới Giá trị xuất khẩu của cà phê lớn hơn nhiều so với ca cao và chè Ở Việt Nam, giá trị xuất khẩu của cà phê chỉ đứng sau gạo 18

- Cà phê ngoài dùng để pha uống thông thường còn là nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp phát triển: bánh, kẹo, rượu, sữa cà phê

- Sản xuất cà phê thu hút nhiều lao động 17

- Sản xuất cà phê làm quan hệ hợp tác quốc tế, thương mại được củng cố, phát triển Việt Nam sau ngày thành lập Hiệp hội cà phê Việt Nam (1/1990) và gia nhập tổ chức cà phê quốc tế (3/1991) đã có quan hệ buôn bán cà phê với nhiều nước châu Âu

và châu Á Những nước Đức, Pháp, Ý cũng thông qua quan hệ buôn bán giúp đỡ Việt Nam về vật tư, thiết bị, và đầu tư vào sản xuất cà phê 3

1.1.3 Tình hình sản xuất cà phê

Cà phê là một nông sản có giá trị và dần được các nước trên thế giới quan tâm Những nước có khả năng trồng trọt những loại cây này luôn tìm cách phát triển diện tích, sản lượng và năng suất vì chúng mang lại một nguồn ngoại tệ lớn Có nhiều giống

cà phê nhưng hiện nay có ba giống: Coffea arabica, C robusta, C chari được trồng

rộng rãi trên thế giới 6 , 17 Hiện nay theo số liệu thống kê của Mỹ, có khoảng 79

nước đang trồng cà phê với diện tích 12 triệu ha Trong đó cà phê chè C arabica chiếm

khoảng 70%, và chiếm 75% tổng sản lượng xuất khẩu cà phê

Diện tích trồng cà phê ở Việt Nam lên đến gần 500.000 ha và tiến đến ổn định diện tích trồng cà phê Cà phê chủ yếu được trồng ở Việt Nam là cà phê vối do ưu thế năng suất bình quân của cà phê Việt Nam cao gấp 3 lần năng suất trung bình trên thế giới và điều kiện thổ nhưỡng đặc biệt thuận lợi của Việt Nam 8

1.1.4 Tầm quan trọng của ngành chế biến cà phê ở Việt Nam

Việt Nam là nước đứng thứ 2 sau Braxin về xuất khẩu cà phê; tuy nhiên, Việt Nam chủ yếu vẫn xuất khẩu cà phê thô, giá thành thấp [21] Cà phê được chế biến theo phương pháp truyền thống có chất lượng trung bình và lệ thuộc rất lớn vào nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên Thế giới đã nghiên cứu chế biến cà phê bằng các công nghệ lên men ngay sau khi thu hoạch nhằm loại bỏ hoàn toàn vỏ và lớp nhớt pectin Điều này làm thay đổi căn bản cảm quan và chất lượng cà phê [6], [21] Tại Việt Nam, có khoảng 20 công ty đang ứng dụng công nghệ lên men ướt nhằm tách vỏ và lớp nhớt cà phê để thu được cà phê đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Tuy nhiên, chế phẩm được sử dụng là enzyme được nhập rất đắt tiền từ nước ngoài Trong xu thế hội nhập đòi hỏi cao về chất lượng, ngành chế biến cần có nhiều nghiên cứu mới để sản xuất cà phê đạt chất lượng thế giới, đòi hỏi nguồn enzyme thay thế rẻ hơn sản xuất tại Việt Nam

1.1.5 Những vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu trong chế biến cà phê

Trong chế biến cà phê tươi, vỏ cà phê có thể được loại bỏ một phần nhờ biện pháp cơ học Tuy nhiên muốn tách bỏ hoàn toàn vỏ cà phê và làm sạch lớp nhớt pectin

là một việc rất khó nếu chỉ sử dụng phương pháp cơ học, vì nhân cà phê sẽ bị bể gãy

hay bị tổn thương Để giải quyết vấn đề này, ngày nay người ta sử dụng phối hợp biện pháp cơ học và biện pháp sinh hóa, mà trong đó enzyme đóng vai trò quan trọng Với bản chất chứa nhiều pectin và cellulose trong vỏ cà phê và đặc biệt trong lớp nhớt, vì vậy pectinase và cellulase là hai enzyme được quan tâm nhiều nhất Hiện nay, hai enzyme này có thể dễ dàng nhập khẩu nhưng giá thành rất cao từ 650-1000 USD/thùng 20l, vì vậy giá thành cà phê cao Tại Việt Nam những enzyme này chưa sản xuất rộng rãi và thương phẩm hóa những enzyme này còn nhiều hạn chế Việt Nam được biết là nơi giàu nguồn vi sinh vật, liệu chăng bằng công nghệ tế bào và công nghệ enzyme có thể sản xuất chế phẩm vi sinh vật hay chế phẩm enzyme để thay thể nguồn ngoại nhập đắt tiền

Trong các dòng sản phẩm cà phê chế biến hiện có thì cà phê hòa tan là một loại sản phẩm mang lại giá trị gia tăng cao (có thể tăng 45% giá trị so với tiêu thụ nhân cà phê) Trên thế giới cà phê hòa tan đang bị các tập đoàn sản xuất nổi tiếng ở Anh, Hà Lan, Đức và Ý chi phối Tại nước ta đến nay chỉ mới có 3 doanh nghiệp đầu tư sản xuất

cà phê hòa tan gồm: Nestlé Việt Nam, Vinacafe Biên Hòa và Công ty TNHH An Thái (Đắc Lắc), với công suất khoảng 3.500 tấn sản phẩm/năm Sản phẩm cà phê của Công

ty Việt Nam được các đơn vị xuất khẩu cà phê trong nước đặt mua khoảng 80%, xuất sang một số nước như Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan

Cà phê hòa tan 100% nguyên chất, dạng bột là nguyên liệu cần thiết cho nhiều dòng sản phẩm, trong đó phải kể đến các loại bánh kẹo, thực phẩm, rượu, sữa cà phê

Cà phê hòa tan “3 in 1” và “4 in 1” đang khá thông dụng trên thị trường Thông thường, để sản xuất được 1 kg cà phê bột hòa tan ta cần từ 3 - 3,2 kg nguyên liệu nhân

cà phê, gần đây một số công nghệ thế giới đã tăng lên đáng kể là 1 kg cà phê bột hòa tan/ 2,4 kg cà phê thường Vấn đề ở đây, trong điều kiện Việt Nam, những nghiên cứu nhằm tăng cường khả năng trích ly chất hòa tan vẫn còn hạn chế, chưa được nghiên cứu nhiều

Lên men cà phê để tăng cường trích ly các chất hòa tan có thể từ nguồn nguyên liệu ban đầu từ nhân cà phê ướt hay nhân cà phê khô, quá trình này làm thay đổi căn bản sinh hóa cà phê, đặc biệt sự tác động của pectinase và cellulase làm tăng cường chất trích hòa tan Cơ sở khoa học của việc này là do vách tế bào của nhân cà phê bị

nới lỏng hay phá vỡ, nhờ đó các chất trích hòa tan được giải phóng ra ngoài Vấn đề cốt lõi là có sản xuất được các chế phẩm enzyme hay chế phẩm vi sinh vật đủ mạnh để trích hoàn toàn các chất hòa tan từ nhân cà phê Đồng thời ở thời điểm thu được chất tan nhiều nhất, cà phê còn giữ nguyên hay tăng cảm quan về trạng thái, hương và vị hay không

1.2 TRÁI CÀ PHÊ

1.2.1 Cấu tạo trái cà phê

Hình 1.1: Cà phê vừa thu hoạch Hình 1.2: Cấu tạo bên trong quả cà phê

Trái cà phê thuộc loại quả thịt, gồm có những thành phần: vỏ quả, lớp thịt, lớp nhớt, lớp vỏ trấu, lớp vỏ lụa, nhân 7 , 21

Lớp vỏ quả: là lớp vỏ ngoài, mềm có màu vàng hay đỏ Vỏ quả cà phê chè mềm hơn vối và mít Trong vỏ quả có vết của alkaloid, tannin, caffeine, các loại enzyme Trong

vì vậy trở ngại cho việc phơi sấy khô và bảo quản nhân cà phê [98]

Lớp vỏ trấu: bao bọc quanh nhân, có màu trắng ngà, cứng, nhiều chất xơ Vỏ trấu cà phê chè mỏng, dễ đập vỡ hơn vỏ trấu của cà phê vối và mít Thành phần chính của vỏ trấu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose và đường [43], [79]

Lớp vỏ lụa: bọc sát nhân, rất mỏng, mềm, có màu sắc và đặc tính khác nhau tùy mỗi loại cà phê: vỏ lụa cà phê chè màu trắng bạc, dễ bong ra khỏi hạt trong quá trình chế biến Vỏ lụa

cà phê vối màu nâu nhạt, vỏ lụa cà phê mít màu vàng bám sát vào nhân [43]

Nhân: ở trong cùng, là phần chính của trái, mỗi trái thường có hai nhân, có khi một hay ba nhân Lớp tế bào phần ngoài của nhân cứng có những tế bào nhỏ, trong đó có chứa những chất dầu Phía trong là những tế bào lớn và mềm hơn

Bảng 1.1: Tỷ lệ các phần cấu tạo quả cà phê [43 ]

1.2.2.1 Thành phần hóa học của vỏ quả

Là chất altoxian trong đó có các vết của alkaloid, tannin, caffeine và các loại men,

1.3.1 Thành phần hóa học của nhân cà phê

Nhân cà phê có một thành phần hóa học rất phức tạp Khi trái cà phê chín đƣợc hái, hạt chứa chừng 48 - 50% ẩm và 50 - 52% chất khô [43], [94] Các thành phần chủ yếu của nhân cà phê gồm:

Bảng 1.4: Thành phần hóa học của nhân cà phê [43]

Polysaccharide: chiếm hơn 50% tổng lượng carbohydrate ở cà phê C C

arabica và 30 - 40% ở cà phê C robusta Polysaccharide dự trữ chính là -mannan

nằm trong lớp vách tế bào cùng với những phân tử cellulose, lignin, pectin, hemicellulose Những polysaccharide thường còn nằm trong bã cà phê sau khi pha Polysaccharide khi bị thủy phân sẽ cho ra lượng mannose >> galactose >> glucose >> arabinose [116]

Carbohydrate có phân tử khối nhỏ, tan trong nước: nhiều nhất là mono, di, oligosaccharide Dạng thông thường nhất là sucrose chiếm khoảng 8% Một số ít raffinose, stachyose, ribose, mannose, galactose Hàm lượng những đường khử, có ý nghĩa trong việc tạo màu cho nước cà phê, vị caramel giảm đi trong quá trình tồn trữ ở nhiệt độ cao gây ra sự biến màu làm giảm chất lượng cà phê [43], [76

C.Caffeine tinh khiết dạng tinh thể trắng hình kim màu trắng, không mùi, vị hơi đắng Caffeine tan trong nước và chloroform Hàm lượng caffeine trong nhân cà phê chiếm một tỷ lệ cao (0,9 - 2,6%) 32 , 71 ,[96]

Hình 1.3: Cấu trúc caffeine

- Caffeine huy động calcium, làm giảm ngưỡng kích động trong cơ bắp (bắp thịt)

và ngăn chặn sự tái lập calcium

- Caffeine ức chế phosphodiesterase từ sự gián phân AMP vòng

- Caffein hoạt động như một chất đối kháng adenosine 71

Trái với định kiến ngày xưa người ta nhận ra caffeine đóng vai trò rất ít trong vị đắng của thức uống cà phê Theo Belitz (1975) và Panghorn (1982) công bố tỷ lệ mà caffeine gây đắng không hơn 10% Belitz (1975) còn đề nghị rằng chính những hợp chất dị vòng là nguyên nhân gây đắng cho cà phê [43]

Trong một tách cà phê chế biến theo tiêu chuẩn quốc tế 8g cà phê trong 170 ml nước, lượng caffeine trung bình từ 40 -160 mg 43

b Trigonelline

Là N-methyl betaine của acid pyridine-3-carboxylic Đây là một alkaloid tan trong nước, cồn nóng, chloroform, ether, có công thức C7H7O2N Trigonelline chứa 10,2% N Hàm lượng trigonelline trong nhân cà phê khoảng 0,3 - 1,2% 43 ,[59],[104]

Hình 1.4: Cấu trúc của trigonelline

c Protein và amino acid

Hàm lượng protein trong cà phê C arabica là 9,2% chất khô, trong cà phê C

robusta là 9,5% Protein trong nhân cà phê gồm những chất hòa tan trong nước (trong

đó albumin khoảng 50%) và chất không hòa tan trong nước Protein và amino acid đóng vai trò quan trọng trong hình thành hương vị cà phê 48 , [61]

Amino acid không khác nhau nhiều ở C arabica và C robusta Trong quá trình

tích trữ, do sự tăng cao nhiệt độ, có sự phân giải protein tạo ra các peptide và amino acid tự do ở phản ứng hóa nâu không enzyme với đường Sự thủy giải tạo ra các polypeptit và các acid amin kết hợp với đường khử theo phản ứng melanoidin tạo màu nâu và giảm độ ngọt của cà phê Quá trình rang làm giảm lượng amino acid Chúng tham gia vào các chất tạo hương thơm, là do chúng có khả năng ngưng tụ với đường khử tạo những sản phẩm có mùi thơm 67 , [68],[69]

Bảng 1.6: Hàm lượng amino acid tự do trong nhân cà phê (% chất khô) [43 ]

hơn Trong cà phê còn có: acid caffeoyl quinic (CQA), acid dicaffeoyl quinic (DCQA), acid feruloyl quinic (FQA) và acid caffeoylferuloyl quinic (CFQA) 46 , 49 , [33]

Hàm lượng CGA (CGA các hợp chất phenol ) khá cao, ở C arabica là 5%

và ở C robusta đến 10% trong nhân cà phê sống CGA có thể kết hợp caffeine theo

tỷ lệ 1:1 hay 2:1 Rang cà phê làm giảm lượng CGA đi rất nhiều Chế biến cà phê hòa tan khử caffeine cũng làm giảm lượng CGA, acid quinic là sản phẩm của CGA trong quá trình rang Những sản phẩm chính từ acid quinic: catechol, quinol, pyrogallol và 1, 2, 4-trihydroxyl benzen 96

1.3.1.4 Hương thơm cà phê

Có trên 700 hợp chất gồm 47 nhóm bay hơi Sự tạo hương thơm cà phê là do:

sự biến đổi về cấu trúc hợp chất, giảm thành phần (protein phenol, protein những hợp chất chứa S), tổng hợp nên nhiều chất (phản ứng của nhóm carbonyl với nucleophile có O2, N hay S) 24 , [44], [58], [81]

Một số hợp chất ảnh hưởng đến mùi cà phê rang: phenol, guaicol, quinol, catechol, pyrogallol, furfuryl-2-methanethiol, methylsulfide, methyl pyrazine, pyridine [65],[70]

Thành phần cấu tạo của cà phê thay đổi tùy giống loài Những thay đổi này khó giải thích được và có liên quan đến các phẩm chất về vị và mùi của cà phê rang [37],[44] Hương cà phê là được tạo nên từ nhiều chất, có thể trình bày bảng 1.7 Các đặc tính của cà phê tùy thuộc giống, đất canh tác, khí hậu, cao độ và tập quán

canh tác Cà phê Robusta không thơm bằng cà phê Arabica Còn cà phê Chari thì

chát và gắt hơn nhiều 46 , 60

Bảng 1.7: Thành phần hương vị cà phê rang [76]

Acid béo giữ vai trò trong việc tạo nên chất lượng cà phê cũng như dịch cà phê

vì acid béo thô điển hình là dầu được phân bố trong tế bào chất của nội mô Có 80 - 90% lipid ở dạng triglyceride với acid béo chưa bão hòa và bão hòa: acid linoleic, palmitic, oleic, lignoceric, stearic Trong nhóm lipid còn có vài thành phần không xà phòng hóa 46

Sự ôi hóa xảy ra trong quá trình tồn trữ hạt ít ảnh hưởng đến chất lượng cà phê rang vì khi rang lipid mất đi nhiều do nhiệt độ cao [88]

Một số diterpene là ester của các acid béo bão hòa palmitic, arachidic… Các terpene rất nhạy cảm với acid, nhiệt và ánh sáng Hàm lượng diterpene giảm trong quá trình tồn trữ, rang là do tạo ra các terpene bay hơi, naphthalene, quinoline Dầu sterol gồm: sitosterol, stigmasterol, campesterol Diterpene glucose tan trong nước và methanol Với sự hiện diện của aglycone trong nhân nhân cà phê cho thấy những hợp chất này có thể bị ảnh hưởng do -glucosidase trong quá trình tồn trữ hạt

Các acid hiện diện trong cà phê góp phần tạo ra hương vị đặc trưng và ngưỡng của nó trong dịch cà phê thấp hơn 10 ppm

Trong nhân cà phê hàm lượng các acid không hữu cơ bay hơi như: acid malic, acid citric, acid oxalic, acid tartaric không quá 2%

Trong cà phê rang có hơn 30 loại acid béo được nhận biết, trong đó có khoảng

15 loại acid không bay hơi (C1-C10), còn lại là acid béo bay hơi 76

1.3.1.6 Các chất khoáng

Thành phần khoáng khoảng 3 - 5%, chủ yếu là K, Mg, P, Cl…và một ít Al, Fe,

I, S gây ảnh hưởng không tốt đến mùi cà phê rang Cà phê tốt là cà phê có hàm lượng

khoáng thấp 76

1.3.2 Tính chất vật lý

Các nhân cà phê C robusta, C arabica và vài giống cà phê khác có thể phân biệt nhờ các đặc tính hình thái Nhân cà phê C arabica lớn hơn và tỷ số chiều dài/chiều rộng ( ) cũng lớn hơn hạt C robusta Chiều dài hạt Arabica biến thiên trong khoảng 8

- 12mm và chiều rộng từ 6 - 8mm, tỷ số thường là 1,3 - 1,5 Nhân cà phê C robusta nhỏ và tròn hơn hạt C arabica, chiều dài thường là 6 - 8mm, chiều rộng 6 - 7mm, tỷ số trong khoảng 1,0 - 1,5 Còn nhân cà phê C chari lớn và dài hơn hết với tỷ số từ 1,9

- 2,0

Khối lượng một hạt nhân cà phê biến thiên từ dưới 100 mg đến trên 200 mg Tỷ trọng hạt cà phê trong khoảng 1,15 - 1,42 6 ,[13]

1.4 PECTIN

“Pectin” là từ bắt nguồn từ tiếng Hy lạp là “pektos” có nghĩa là chắc, cứng để chỉ định một chất keo có nhiều ở thực vật, có tính chất tạo gel ở điều kiện nhất định Trong thực vật, pectin có nhiều ở quả, củ và thân cây với hàm lượng khác nhau Ví dụ: trong táo pectin có từ 1,5 - 3,5%, chanh 2,5 - 4% Người ta thường thấy hai dạng tồn tại của pectin là protopectin không tan là phức chất giữa pectin với những thành phần khác như cellulose, hemicellulose làm nên cấu trúc vách tế bào và pectin tan có trong thành phần dịch bào thực vật [16],[95] Thí nghiệm tách chiết pectin từ nước chiết thực vật thành công năm 1825, do nhà khoa học pháp J Braconnot thực hiện

1.4.1 Cấu tạo pectin

Pectin là polysaccharide cấu tạo chủ yếu là một mạch chính, gồm các gốc acid D–galacturonic, liên kết nhau bằng liên kết 1,4 – O - glucosidic, còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic, dạng tổng quát là:

Hình 1.5: Cấu tạo một đoạn của chuỗi pectin

Trong thực tế không phải bao giờ tất cả các nhóm (-COOH) ở C6 của đường galactose cũng bị methyl hóa, mà đôi khi một số nhóm (-COOH) bị decaboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm (-COOH) được thay thế -H bằng kim loại Người ta cho rằng protopectin là hợp chất giữa pectin với galactan hay tinh bột 38 , 103

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng:

o Pectin hòa tan: là ester methylic của acid polygalacturonic

o Acid pectinic: là acid polygalacturonic có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hóa bằng methanol

o Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước Trong thành phần có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+, các gốc acid phosphoric, acid acetic và đường Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng

pectin hòa tan 38 , [39]

1.4.2 Tính chất của pectin

Pectin thương phẩm là chất bột trắng xám hoặc vàng nhạt, tan trong dung dịch đường, không tan trong nước và dung môi hữu cơ khác 16 Ở trạng thái dung dịch, pectin có những đặc tính công nghệ: làm chất đông đặc, chất ổn định cấu trúc, chất tạo gel

1.4.2.1 Tính chất làm đông đặc

Đây là tính chất đặc biệt của pectin, dung dịch pectin bị đông đặc bởi một số loại men đặc biệt: chẳng hạn pectase có trong dung dịch của cà rốt Dưới tác dụng của pectase, pectin sẽ biến thành acid pectinic, tan trong kiềm, các muối tan, riêng pectate không tan 24 Trong khi đó pectinase có trong lúa đại mạch có tác dụng ngược với pectase cà rốt, tức là làm cho pectin không đông đặc nữa, ngoài ra nó có thể hòa tan kết tủa vốn đã bị pectase làm đông đặc

1.4.2.2 Tính tạo gel của pectin

Đây là tính chất quan trọng nhất của pectin Về bản chất, hiện tượng tạo gel chính là sự tạo thành mạng lưới không gian gồm các vùng có cấu tạo mạng chặt chẽ chứa pha lỏng ở bên trong Những vùng này được hình thành bởi sự xếp chồng các đoạn mạch homogalacturonic thông qua liên kết hydro khi các sợi pectin xích lại gần nhau do sự tác dụng của sự giảm độ tích điện hay hydrat hóa 52 Khả năng tạo gel của pectin phụ thuộc chủ yếu vào hai yếu tố: chiều dài chuỗi pectin và mức độ methyl hóa

1.4.2.3 Tính nhớt của dung dịch pectin

Một trong những tính chất quan trọng của dung dịch pectin là khi khuếch tán trong nước sẽ tạo độ nhớt Độ nhớt của dung dịch pectin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ pectin, nhiệt độ, độ cứng của nước, sự có mặt của các chất điện phân trong môi trường Ngoài ra, trọng lượng phân tử và độ este hóa của pectin cũng ảnh hưởng đến độ nhớt do ở trạng thái dung dịch 24 , trong các phân tử pectin có điện tích

âm nên chúng có khả năng đẩy nhau làm giãn mạch, do đó làm tăng độ nhớt [52]

1.4.2.4 Pectin ở trái cà phê

Pectin chiếm khoảng 4% trong vỏ quả tuy nhiên pectin là một thành phần chủ yếu trong lớp nhớt và chiếm đến 33% Trong nhân cà phê pectin là một thành phần trong thành vách tế bào, chúng đóng vai trò quan trọng trong cấu tạo thành tế bào như là một chất kết dính [43]

1.4.3 Ứng dụng

Ý nghĩa thực tế của các pectin có chỉ số metoxyl thấp là nó cho phép chế biến mứt quả đông mà không cần thêm đường hoặc tạo thịt đông có độ cứng bền ngay ở khí hậu nhiệt đới 24

1.5 CELLULOSE

Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ 40 - 50% 28 Cellulose là một trong những sản phẩm bậc nhất, quan trọng nhất mà thực vật tổng hợp nên Các nghiên cứu phân đoạn trong các điều kiện lạnh cho thấy chúng tồn tại dạng sợi trong màng tế bào thực vật và vi sinh vật [84]

1.5.1 Cấu tạo

Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị -D-glucose được nối với nhau qua liên kết -D-1, 4-glucosidic Dùng phương pháp phân tích tia Rơnghen người ta chứng minh rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi Các dạng sợi của cellulose lại gắn với nhau nhờ các liên kết hydro tạo nên cấu trúc mixen của cellulose Trong phân tử cellulose có nhiều nhóm hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydro của chúng dễ được thay thế bởi một số gốc hóa học ví dụ như gốc methyl (-CH3) hình thành nên các dẫn xuất ether hoặc ester của cellulose [12], 24

Hình 1.6 : Cấu tạo cellulose

1.5.2 Tính chất

Cellulose có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 2.500.000 Da Cellulose thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững Nó không tan trong nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40 - 50oC nhờ các enzyme thủy phân cellulose, được gọi chung là cellulase [18], 24

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí lẫn yếm khí Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là β-glucose Tuy nhiên, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và thường không triệt để

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20 - 40% trọng lượng khô) là một loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl Do bản chất không kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân Cellulose còn liên kết chặt chẽ với lignin (10-25% trọng lượng khô) Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) cellulose tồn tại ở trạng thái một polymer gần tinh khiết [98]

Liên kết hydro

Liên kết C1-C4

Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, rượu bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy, bột giấy

1.5.3 Ứng dụng

Nhiều dẫn xuất của cellulose có ý nghĩa rất quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp, ví dụ như nitrocellulose, acetylcellulose trong kỹ nghệ sợi nhân tạo, kỹ nghệ chất nổ, chất dẻo Cellulose được dùng làm giấy, dệt vải 19

1.5.4 Cellulose ở trái cà phê

Cellulose hiện diện khắp nơi từ cấu tạo vỏ ngoài cho đến các lớp bên trong cũng như nhân cà phê Trong vỏ quả chúng chiếm từ 13-27% tùy loại cà phê, lớp nhớt tuy thành phần không nhiều như pectin nhưng chúng cũng tham gia khoảng 17% và nhân

cà phê cũng chứa rất nhiều cellulose Thành phần này thay đổi từ trái non đến trái già, đặc biệt ở những trái già chín cellulose có thể chiếm đến 18% Đây là thành phần tạo nên sự rắn chắc trong cấu trúc của trái cà phê và rất khó bị phá vỡ [43]

1.6 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTINASE VÀ CELLULASE

Enzyme là những chất xúc tác có bản chất protein có vai trò cực kỳ quan trọng trong việc tham gia xúc tác các phản ứng sinh hóa, chiếm tới 80 - 90% thành phần protein trong tế bào sinh vật [2],[56] Tính chất ưu việt của enzyme có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất, trong khoảng thời gian ngắn [83] Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme từ tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật Ngày nay, phần lớn các enzyme được thu nhận từ các tế bào vi sinh vật [25] Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật đã phát triển với tốc độ rất mạnh mẽ từ thế kỷ 17 đến nay và đạt được những thành tựu đáng kể 23 Hiện nay, người ta đã phát hiện trên 3500 enzyme khác nhau, nhưng chỉ có khoảng 140 enzyme có thể thương mại được Hiện nay hằng năm thương mại của các enzyme công nghiệp trên thế giới đạt 1 tỉ USD 23 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme bao gồm giống vi sinh vật, nhiệt độ, môi trường, cấu tử môi trường dinh dưỡng Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme áp dụng hai phương pháp chủ yếu là phương pháp phương pháp nuôi bề sâu và nuôi bề mặt

1.6.1 Pectinase

1.6.1.1 Phân loại và cơ chế tác động

Pectinase là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin thành các hợp phần khác nhau Các pectinase chia thành hai nhóm chủ yếu: [20]

Pectimethylesterase (Pectinhydrolase) (mã số EC 3.1.1.11)

Là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết ester trong phân tử pectin hay acid pectinic (các acid polygalacturonic được ester hóa nhờ rượu metylic ở mức thấp) khi toàn bộ các nhóm methoxyl đều bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là methanol và các acid polygalacturonic

Polygalacturonase (polygalacturonit-glucanohydrolase) (mã số EC 3.2.1.15):

Là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết 1,4-glucosidic trong phân tử pectin

Có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau:

- Polymethyl galacturonase tác dụng chủ yếu lên các ester methylic của các acid

polygalacturonic Các enzyme này được chia thành hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glucosidic bị cắt đứt dưới sự xúc tác của enzyme ở đầu hay giữa mạch như:

+ Endoglucosidase-polymethylgalacturonase T: xúc tác sự thủy phân các liên kết glucosidic nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được ester hóa ở mức độ cao Hoạt tính của enzyme này bị giảm khi có mặt enzyme pectinesterase trong môi trường

+ Exo-glucosidase-polymetylgalacturonase III: xúc tác sự thủy phân các liên kết glucosidic ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu từ đầu không khử Enzyme này có ái lực với gốc acid galacturonic đã meyoxyl hóa

- Polygalacturonase: là các enzyme tác dụng chủ yếu lên các acid pectic (các

acid polygalacturonic không bị ester hóa ) và acid pectinic (các acid polygalacturonic

bị ester hóa ở mức độ thấp ) Các enzyme này được chia thành hai nhóm nhờ từng vị trí liên kết glucosidic bị cắt đứt: