khảo sát về mặt thực vật học và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các dịch chiết từ cây trinh nữ (mimosa pudica l ) và quả lựu (punica granatum l )

Mai Thị Trà Giang VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÂY TRINH NỮ MIMOSA PUDICA L.. Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết từ vỏ quả Lựu theo phương phá

Mai Thị Trà Giang

VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CÁC DỊCH CHIẾT

TỪ CÂY TRINH NỮ (MIMOSA PUDICA L.)

VÀ QUẢ LỰU (PUNICA GRANATUM L.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

PGS.TS TRƯƠNG THỊ ĐẸP PGS.TS NGUYỄN ĐINH NGA

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào

Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Mai Thị Trà Giang

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trương Thị Đẹp, PGS.TS Nguyễn Đinh Nga - người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ trong Hội đồng các cấp đã đọc và góp ý cho luận văn của tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô phòng bộ môn Thực vật, bộ môn Kí sinh trùng của Trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này

Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Mai Thị Trà Giang

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

III ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 2

V PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

VI Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN 3

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ VÀ CÂY LỰU 4

1.1.1 Cây Trinh nữ 4

1.1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.1.3 Phân bố, sinh thái 4

1.1.1.4 Bộ phận dùng 5

1.1.1.5 Thành phần hóa học 5

1.1.1.6 Tính vị, tác dụng 5

1.1.1.7 Công dụng 5

1.1.2 Cây Lựu 6

1.1.2.1 Vị trí phân loại 6

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái 6

1.1.2.3 Phân bố, sinh thái 6

1.1.2.4 Bộ phận dùng 7

1.1.2.7 Công dụng 7

1.2 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY TRINH NỮ VÀ CÂY LỰU 8

1.2.1 Cây Trinh nữ 8

1.2.2 Cây Lựu 9

1.3 CÁC VI KHUẨN VÀ NẤM GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP 10

1.3.1 Staphylococcus aureus 10

1.3.2 MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 11

1.3.3 Streptococcus faecalis 12

1.3.4 Escherichia coli 12

1.3.5 Pseudomonas aeruginosa 12

1.3.6 Candida albicans 13

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 13

1.4.1 Phương pháp chiết lạnh 13

1.4.2 Phương pháp chiết nóng 14

1.4.3 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 14

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT 15

1.5.1 Phương pháp khuếch tán 15

1.5.1.1 Nguyên tắc 15

1.5.1.2 Một số phương pháp thường được sử dụng 15

1.5.2 Phương pháp pha loãng 16

1.5.2.1 Nguyên tắc 16

1.5.2.2 Một số phương pháp thường được sử dụng 16

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm 17

1.5.3.1 Mật độ tế bào 17

1.5.3.2 Môi trường dùng thử và pH của môi trường 17

1.5.3.3 Nhiệt độ và thời gian ủ 17

1.5.3.4 Điểm dừng đọc kết quả 18

2.1.1 Vật liệu khảo sát về thực vật học 19

2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm 19

2.1.3 Môi trường thử nghiệm 19

2.1.4 Nguyên liệu 21

2.1.5 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 21

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM 22

2.2.1 Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học 22

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái 22

2.2.1.2 Đặc điểm giải phẫu 22

2.2.2 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu 23

2.2.2.1 Chiết xuất cao thô 23

2.2.2.2 Thăm dò dung môi chiết xuất 23

2.2.3 Phương pháp tinh chế cao toàn phần 24

2.2.3.1 Phương pháp tinh chế cao toàn phần 1 24

2.2.3.2 Phương pháp tinh chế cao toàn phần 2 24

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của cao dược liệu 25

2.2.4.1 Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm 25

2.2.4.2 Phương pháp khuếch tán 27

2.2.4.3 Phương pháp pha loãng 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC 30

3.1.1 Cây Trinh nữ 30

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái 30

3.1.1.2 Đặc điểm giải phẫu 31

3.1.2 Quả Lựu 39

3.1.2.1 Đặc điểm hình thái 39

3.1.2.2 Đặc điểm giải phẫu 39

3.2.1 Tác động kháng vi sinh vật của cây Trinh nữ 43

3.2.1.1 Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết thô từ cây Trinh nữ 43

3.2.1.2 Thăm dò dung môi chiết xuất toàn cây Trinh nữ 45

3.2.1.3 Tinh chế cao toàn cây Trinh nữ 45

3.2.1.4 Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển S aureus (MIC) của cao chiết cây Trinh nữ 46

3.2.2 Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết từ quả Lựu 48

3.2.2.1 Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết thô từ quả Lựu 48

3.2.2.2 Thăm dò dung môi chiết xuất vỏ quả Lựu 50

3.2.2.3 Tinh chế cao chiết vỏ quả Lựu 50

3.2.2.4 Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) của cao chiết vỏ quả Lựu 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

Chữ viết tắt Chú giải

Trang Bảng 2.1 Bảng đánh giá mức độ của đường kính vòng tác động kháng khuẩn,

Bảng 3.5 MIC của cao chiết cây Trinh nữ tác động trên S aureus 46

Bảng 3.6 Tác động kháng vi sinh vật của cao chiết thô từ quả Lựu 48 Bảng 3.7 Tác động kháng vi sinh vật của cao chiết thô từ vỏ quả Lựu với ethanol

có độ cồn khác nhau 50 Bảng 3.8 Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết từ vỏ quả Lựu theo

phương pháp tinh chế 1 50 Bảng 3.9 Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết vỏ quả Lựu theo phương

pháp tinh chế 2 50 Bảng 3.10 MIC của cao chiết vỏ quả Lựu trên các vi sinh vật thử nghiệm 51

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu 23

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 1 24

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 2 25

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm 26

Hình 2.5 Tác động kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán 28

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình xác định tác động kháng vi sinh vật bằng phương pháp

pha loãng 29

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) 33

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) 34

Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu rễ cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) 35

Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu thân cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) 36

Hình 3.5 Cấu tạo giải phẫu lá chét cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) 37

Hình 3.6 Cấu tạo giải phẫu cuống lá Trinh nữ (Mimosa pudica L.) 38

Hình 3.7 Đặc điểm hình thái quả và hạt Lựu (Punica granatum L.) 40

Hình 3.8 Cấu tạo giải phẫu vỏ quả Lựu (Punica granatum L.) 41

Hình 3.9 Cấu tạo giải phẫu hạt Lựu (Punica granatum L.) 42

Hình 3.10 Kết quả tác động kháng S aureus của cao chiết thô từ cây Trinh nữ và vỏ quả Lựu 44

Hình 3.11 Kết quả kháng S aureus của cao tinh chế từ cây Trinh nữ bằng cách tủa qua MeOH 46

Hình 3.12 MIC của cao chiết cây Trinh nữ trên S aureus 47

Hình 3.13 Kết quả tác động kháng S aureus (A) và MRSA (B) của cao chiết thô từ quả Lựu 48

Hình 3.14 Kết quả tác động kháng S faecalis (A) và E coli (B) của cao chiết thô từ vỏ quả Lựu và cây Trinh Nữ 49

Hình 3.15 Kết quả tác động kháng C albicans của cao chiết thô từ vỏ quả Lựu và cây Trinh nữ 49

Hình 3.16 MIC của cao chiết vỏ quả Lựu trên C albicans 52

Hình 3.17 MIC của cao chiết vỏ quả Lựu trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 52

MỞ ĐẦU

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Bước sang thế kỉ 21, thời kì của quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa, thiên tai, dịch bệnh và tệ nạn xã hội xuất hiện ngày càng nhiều đặt ra cho thế giới loài người những thách thức vô cùng to lớn Y học cũng không đứng bên ngoài những thách thức

đó khi xuất hiện nhiều căn bệnh mới lạ, nguy hiểm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống con người Những năm gần đây, sự kháng thuốc ở các vi sinh vật gây bệnh nhiễm đang được các nhà khoa học quan tâm chú ý Đây là một vấn đề rất đáng lo ngại đặc biệt đối với những vùng khí hậu nóng ẩm thuận lợi cho vi khuẩn gây bệnh phát triển như ở Việt Nam

Tình trạng đề kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh; sự biến đổi liên tục của các chủng vi khuẩn, vi rút tạo ra nhiều chủng mới nguy hiểm; các bệnh nhiễm nấm, nhiễm khuẩn cơ hội ngày càng gia tăng ở bệnh nhân bị nhiễm HIV – AIDS, bệnh nhân

cấy ghép cơ quan, bệnh nhân suy giảm miễn dịch do thuốc, do bệnh … Tất cả những

vấn đề trên đã đặt ra một yêu cầu bức thiết là phải thúc đẩy tìm kiếm nguồn kháng sinh

mới nhằm đáp ứng tốt hơn, hiệu quả hơn cho việc điều trị và dự trữ

Tự nhiên là một kho thuốc tiềm tàng của nhân loại với những quan tâm mới nhắm vào các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật So với các kháng sinh tổng hợp, bán tổng hợp thì các chất kháng khuẩn từ thực vật có tiềm năng lớn vì chúng ít bị các vấn đề tác dụng phụ Cao chiết từ thực vật đã được chứng minh có hoạt tính chống lại vi khuẩn, vi nấm và gần đây tác dụng kháng khuẩn của chúng đã được quan tâm và ứng dụng trong nhiều sản phẩm thuốc và mỹ phẩm

Cây Trinh nữ còn gọi là cây Mắc cỡ có tên khoa học là Mimosa pudica L., thuộc

họ Đậu (Fabaceae) Theo y học cổ truyền, lá và rễ có khả năng chống vi khuẩn, trị lậu Cây Trinh nữ thường dùng trị suy nhược thần kinh, viêm phế quản, viêm gan, viêm kết mạc Cây dùng ngoài có khả năng trị chấn thương, viêm mủ da, [4], [10]

Cây Lựu có tên khoa học là Punica granatum L., thuộc họ Lựu (Punicaceae)

Các bộ phận của cây Lựu có khả năng chữa nhiều bệnh Vỏ quả có tác dụng sáp

trường chỉ tả, chỉ huyết, khử trùng Vỏ thân và vỏ rễ có tác dụng khử trùng, trừ sán Trái chống nhiều siêu khuẩn, [9]

Tính tới thời điểm hiện tại, trên thế giới cũng đã có một số công bố về sàng lọc

và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chất chiết từ cây Trinh nữ và cây Lựu Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn chưa có các công bố nào liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm ở cây Trinh nữ và quả Lựu

Chính vì vậy, đề tài "Khảo sát về mặt thực vật học và thử hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm của các dịch chiết từ cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) và quả Lựu (Punica granatum L.)" được thực hiện nhằm mô tả đặc điểm thực vật, khảo sát

hoạt tính kháng vi sinh vật của cao chiết của cây Trinh nữ và quả Lựu

II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Sàng lọc những dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm; góp phần xây dựng thư viện dữ liệu và nghiên cứu cơ bản về các cao chiết có khả năng kháng vi sinh vật có nguồn gốc từ thực vật

III ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1 Trinh nữ (Mimosa pudica L.)

2 Quả Lựu (Punica granatum L.)

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

1 Khảo sát đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Trinh nữ và quả Lựu

2 Xác định bộ phận sử dụng của cây Trinh nữ và quả Lựu cho hoạt tính kháng vi sinh vật

3 Khảo sát dung môi và điều kiện chiết xuất cao Trinh nữ và cao quả Lựu thích hợp

4 Sơ bộ xác định phương pháp tinh chế cao dược liệu và nồng độ tối thiểu ức chế

sự phát triển vi sinh vật thử nghiệm của cao tinh chế

V PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Khảo sát về mặt thực vật học và thử hoạt tính kháng vi sinh vật của cây Trinh nữ

(Mimosa pudica L.) được thu hái tại xã Tân Thông Hội, Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh và

quả Lựu (Punica granatum L.) mua tại nhà vườn thuộc xã Cai Lậy, Tiền Giang,

Tp Hồ Chí Minh trên các chủng vi sinh vật: Staphylococcus aureus, MRSA

(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Streptococcus faecalis, Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans

VI Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN

1 Ý nghĩa khoa học

Áp dụng được một số mô hình khảo sát về thực vật, chiết xuất và xác định tác động kháng vi sinh vật của dược liệu

2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu giúp xác định đặc điểm thực vật học và tác động kháng vi

sinh vật của cây Trinh nữ và quả Lựu

Kết quả nghiên cứu có thể được dùng định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về

tách chiết các hợp chất kháng vi sinh vật có trong cây Trinh nữ và vỏ quả Lựu

Họ: Đậu (Fabaceae) Phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae)

Chi: Trinh nữ (Mimosa) Loài: Mimosa pudica L

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây nhỏ, phân nhánh nhiều, mọc thành bụi lớn, cao 30 – 40 cm Thân cành lòa xòa, uốn éo, có lông và gai hình móc Lá kép lông chim chẵn hai lần, những cuống phụ xếp như hình chân vịt, khẽ đụng vào là cụp lại Mỗi lá mang 15 – 20 đôi lá chét

Hoa màu tím đỏ, nhỏ, tập hợp thành hình đầu, có cuống chung dài, ở nách lá; đài nhỏ hình dấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị 4, rất mảnh; bầu 4 noãn Cụm quả hình ngôi sao, quả thắt lại giữa các hạt, có nhiều lông cứng Quả dài 1 – 2 cm, đốt 2 – 4 [4], [6]

1.1.1.3 Phân bố, sinh thái

Chi Mimosa L có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt

đới châu Mỹ, châu Phi và châu Á Về nguồn gốc chung của loài Trinh nữ (Mimosa

pudica L.) có xuất xứ từ vùng châu Mỹ nhiệt đới Ở Việt Nam, Trinh nữ phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi độ cao dưới 1000 m [4]

Trinh nữ thuộc loại cây thảo sống một năm Ra hoa tháng 6 – 10, có quả từ tháng

10 đến tháng 1 năm sau Cây con mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân; sau 3 tháng sinh trưởng, phát triển nhanh, cây đã có quả già và hoàn thành vòng đời của nó [6] Trinh nữ là cây ưa sáng, thường gặp ven đường, bãi cỏ, bờ đê, các bãi hoang, trên đất khô cằn, chịu úng kém Cây có khả năng chịu được khô hạn và nắng nóng (nhiệt

độ lên tới 38 0C) Trinh nữ ra hoa quả rất nhiều, khi quả già tự mở, hạt phát tán gần vì thế cây thường mọc tập trung thành đám dày đặc [4]

1.1.1.7 Công dụng

Cả cây Trinh nữ được dùng chữa suy nhược thần kinh, mất ngủ, viêm phế quản, viêm kết mạc cấp, viêm gan, viêm dạ dày – ruột, phong thấp tê bại, bệnh gút, sốt, cao huyết áp [8]

Dùng ngoài trị chấn thương, viêm mủ da; lấy cây tươi giã đắp Rễ và hạt chữa hen suyễn và gây nôn Rễ còn chữa sốt rét, kinh nguyệt không đều Lá và rễ chống vi khuẩn; trị lậu Rễ trị ỉa, sạn thận Chống vài siêu khuẩn [10]

Chi: Lựu (Punica) Loài: Punica granatum L

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây nhỏ hay cây nhỡ, cao tới 5 – 6 m Thân thường sần sùi, màu xám, có vỏ mỏng Rễ trụ khỏe, hóa gỗ, dạng con thoi, màu nâu đỏ ở ngoài, màu vàng nhạt ở trong Cành mảnh đôi khi có gai Lá đơn, nguyên, mọc đối nhưng thường tụ họp thành cụm nhiều lá, cuống ngắn, hình mác thuôn, dài 5 – 6 cm, rộng 1 – 2 cm, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; lá kèm rất nhỏ, hình chỉ [5], [9] Hoa mọc đơn độc hoặc tụ họp thành cụm 3 – 4 cái ở ngọn cành Hoa có 5 – 6 lá đài hợp ở gốc; tràng 5 – 6 cánh màu đỏ hoặc vàng, loại trắng là bạch lựu, nhị rất nhiều; bầu có 2 tầng, tầng trên 6 – 7 ô, tầng dưới 3 – 4 ô; noãn nhiều [4]

Quả mọng, có vỏ dày, tròn, phía trên có đài tồn tại, khi chín màu vàng đốm đỏ nâu Quả có vách ngang chia thành 2 tầng, các tầng này lại chia ra các ô chứa nhiều hạt; hạt màu hồng có vỏ ngoài mọng nước [4], [10]

1.1.2.3 Phân bố, sinh thái

Lựu gốc ở Tây Á, được trồng nhiều ở Bắc Phi, hiện nay được trồng rộng rãi khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, đặc biệt ở các nước vùng Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc và Nhật Bản Ở Việt Nam, lựu được trồng nhiều ở các tỉnh phía nam và một số tỉnh ở đồng bằng trung du Bắc Bộ

Lựu có biên độ sinh thái rộng, về mùa đông có thể chịu được nhiệt độ -10 0C và ở nhiệt độ cao đến 40 0C về mùa hè Nhìn chung, cây thích nghi nhất ở khí hậu nóng và

ẩm ở vùng nhiệt đới với nhiệt độ trung bình 24 – 26 0C, sống được trên nhiều loại đất

Lựu là cây ưa sáng, nếu bị che bóng có thể ra nhiều hoa nhưng không đậu quả Cây rụng lá về mùa đông; trồng bằng hạt hoặc bằng cành chiết Ra hoa tháng 5 – 6, có quả tháng 7 – 8 [4], [9]

1.1.2.4 Bộ phận dùng

Vỏ quả, thường gọi là thạch lựu bì Vỏ cây, vỏ rễ, thịt quả cũng được sử dụng

Vỏ thân, vỏ rễ thu hái quanh năm; hoa quả thu hái vào tháng 6 – 7 Đào rễ bóc lấy vỏ,

bỏ lõi, phơi hoặc sấy khô Vỏ quả lấy khi còn tươi, bỏ màng trong, thái mỏng, sấy khô [4], [9]

1.1.2.5 Thành phần hóa học

Vỏ rễ chứa hàm lượng tanin cao (2%) và 0,5 – 0,7% alcaloid toàn phần trong đó

có pelletierin, isopelletierin, methyl pelletierin và pseudo pelletierin Isopelletierin là alcaloid có hoạt tính trị giun cao Vỏ thân cũng chứa pelletierin và các alcaloid khác nhưng hàm lượng thấp hơn Còn có acid betulic và 3 chất base khác Vỏ quả chứa granatin, acid betulic, acid ursolic và isoquercetin Dịch quả chứa acid citric, acid malic và các chất đường glucose, fructose, maltose [4], [9]

1.1.2.6 Tính vị, tác dụng

Vỏ quả có vị chua, chát, tính ấm; có tác dụng sáp trường chỉ tả, chỉ huyết, khử trùng Vỏ thân và vỏ rễ có vị đắng, chát, tính ấm, có độc; có tác dụng khử trùng, trừ sán [9]

1.1.2.7 Công dụng

Vỏ quả được dùng trị tiêu chảy và lỵ ra huyết, tiểu ra máu, băng huyết, bạch đới, đau bụng giun Vỏ thân và vỏ rễ dùng trị giun, đặc biệt đối với sán dây ở người và đối với cả sán của chó Thịt quả được dùng trợ tim, giúp tiêu hóa Dịch quả tươi làm mát,

hạ nhiệt Hạt giúp tiêu hóa Hoa dùng chữa viêm tai đề phòng chảy mủ Trái chống nhiều siêu khuẩn [4], [9]

1.2 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY

TRINH NỮ VÀ CÂY LỰU

1.2.1 Cây Trinh nữ

Rajendran Rekha (2009) đã nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa thực vật và hoạt

tính kháng khuẩn của chất chiết xuất khác nhau (n-hexan, chloroform, ethyl acetate,

methanol và tỉ lệ methanol khác nhau (I đến VIII)) của lá cây Trinh nữ Hoạt tính

kháng khuẩn được đánh giá theo phương pháp pha loãng trong thạch Mueller Hinton

Kết quả cho thấy, nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) của các chất chiết xuất trên các

chủng vi sinh vật thử nghiệm (S aureus, Coagulase Negative Staphylococca, E coli,

K pneumoniae, P aeuroginosa, S typhi, S typhi A, S typhi B, Vibrio, E cocci và

C albicans) được xác định là 133,33 µg/ml Chiết xuất n-hexan và chiết xuất ethyl

acetate có MIC > 133,33 µg/ml Hỗn hợp dung môi chloroform – methanol (50:50) và

chloroform – ethyl acetate (75:25) có MIC là 33,33 µg/ml

Trong lá cây Trinh nữ chứa các hợp chất có thể đã góp phần vào tác động chống vi

khuẩn như: alkaloid, carbohydrate, steroid, flavonoid và glycosides [25]

Suriya J và cộng sự (2012) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất

methanol của lá cây Trinh nữ (Mimosa pudica), Abutilon indicum, Hygrophila spinosa

bằng phương pháp khuếch tán và xác định nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) bằng

phương pháp pha loãng Tác động kháng khuẩn được thực hiện trên các chủng vi

khuẩn: E coli, P aeruginosa, S aureus, B cereus, P vulgaris, E faecalis,

K pneumoniae, Vibrio cholerae, S typhi và S paratyphi Kết quả nghiên cứu cho

thấy: MIC của các chất thử dao động từ 0,2 đến 0,9 mg/ml tuỳ loài vi khuẩn [27]

Arokiyaraj S và cộng sự (2012) phân tích thành phần hoá học và nghiên cứu

hoạt tính kháng vi khuẩn của chiết xuất methanol của lá cây Trinh nữ bằng phương

pháp khuếch tán trên hai vi khuẩn Gram dương (S aureus, B subtilis) và bốn vi khuẩn

Gram âm (E coli, K pneumoniae, P mirabilis, S typhi) Kết quả chỉ ra rằng, cao chiết

methanol của lá cây Trinh nữ cho hiệu quả kháng khuẩn cao (dựa vào đường kính

vòng kháng khuẩn): B subtilis (16 mm), S aureus (15 mm), K pneumoniae (20 mm),

P mirabilis (11 mm), E coli (12 mm), S typhi (14,5 mm) Trong lá cây Trinh nữ chứa

các chất hoá học: flavonoid, alkaloid, glycoside [16]

Tamilarasi T và Ananthi T (2012) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng

nấm của chất chiết ethanol của cây Trinh nữ Nghiên cứu được khảo sát trên các chủng

vi khuẩn (B subtilis, P aeruginosa, K pneumonia) và nấm (A flavus, T rubrum) với

các liều lượng cao thử khác nhau 25, 50, 75, 100 μl/đĩa Hoạt tính kháng khuẩn và

kháng nấm phụ thuộc vào lượng cao thử, liều lượng thử càng cao hoạt tính kháng càng cao thông qua đường kính vòng kháng khuẩn [28]

1.2.2 Cây Lựu

Saad Sabbar Dahham và cộng sự (2010) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của quả Lựu bằng phương pháp khuếch tán Dung môi chiết xuất được

chọn là methanol, tiến hành chiết xuất riêng lẻ theo từng phần: vỏ quả, hạt, dịch nước

và cả quả Các chủng vi khuẩn và nấm được chọn khảo sát: B coagulans, B cereus,

B subtilis, E coli, K pneumonia, S aureus, P aeruginosa, A niger, M indicus,

P citrinum, R oryzae, T reesei Chiết xuất từ vỏ quả cho hoạt tính cao hơn so với các chiết xuất từ các bộ phận khác Trong số các vi khuẩn và nấm được lựa chọn, chất chiết từ Lựu cho hoạt tính cao trên T reesei và A niger [26].

Hegde Chaitra R và cộng sự (2012) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, phân tích thành phần hoá học và tiềm năng chống oxy hóa của các chất chiết xuất từ lá của cây

Lựu Chiết xuất methanol ức chế S aureus, B cereus, S typhi và P mirabilis Trong

khi đó, chiết xuất chloroform, ethyl acetate và chiết xuất dung dịch nước tác dụng ức

chế vừa phải đối với các vi khuẩn thử nghiệm Mặt khác, chỉ có chiết xuất methanol

chứng minh hoạt tính kháng nấm, có khả năng ức chế: A niger, A flavus, T rubrum,

C albicans và Cryptococcus sp Phân tích chiết xuất methanol từ lá cho thấy sự hiện

diện của carbohydrate, đường, sterol, glycosides, phenol, tanin, chất flavonoid, protein

và saponin Tổng số chất tiềm năng chống oxy hóa của các chất chiết xuất methanol và dung dịch nước tương đương là 2,26 mg và 1,06 mg acid ascorbic [19]

Neveen A Hassan và cộng sự (2013) đã thử hoạt tính kháng khuẩn của 32 quả Lựu thu từ bốn vùng khác nhau ở Ai Cập (Assiut, Siwa Oasis, Ismailia and North Saini) Các chất chiết xuất ethanol được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán, trên

các chủng vi khuẩn: Gram âm (E coli, P aeruginosa, X campestris, E cartovora),

Gram dương (S aureus, S faecalis) Theo khảo sát này, các chất chiết xuất ethanol

của quả Lựu có tác dụng ức chế mạnh đối với tất cả các vi sinh vật thử nghiệm Kết

quả cũng cho thấy, cao chiết của các quả Lựu thu được từ Assuit và Bắc Saini có hoạt

tính kháng khuẩn mạnh mẽ [24]

Kannaiyan Moorthy và cộng sự (2013) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và

kháng nấm in vitro và phân tích thành phần hoá học của chiết xuất ethanol từ vỏ quả

Lựu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 21 chủng vi sinh vật (19 loại vi khuẩn và 2

loại nấm) bằng phương pháp khuếch tán, phương pháp pha loãng Chiết xuất ethanol

của vỏ quả cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể: Y enterocolitica (25,8 mm),

S epidermidis (24,6 mm), S enterica (21,2 mm), B cepacia (19,4 mm), S aureus

(19,2 mm), S paratyphi A (18,8 mm), S typhimurium (18,6 mm), E coli (18,4 mm) và

P aeruginosa (18,2 mm) Dựa vào phương pháp pha loãng, nồng độ tối thiểu ức chế

(MIC) của chiết xuất ethanol từ vỏ quả là 512 µg/ml đối với S epidermidis và

Y enterocolitica và 1,024 µg/ml đối với S aureus, S mutans, S paratyphi A,

S typhimurium, S Brunei, P aeruginosa và B cepacia Tác dụng ức chế có thể là do

sự hiện diện của một số các chất chuyển hóa thứ cấp như các hợp chất phenolic,

flavonoid, terpenoid, phytosterol, glycosides và tanin phát hiện trong chiết xuất

ethanol của vỏ quả [21]

1.3 CÁC VI KHUẨN VÀ NẤM GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP

1.3.1 Staphylococcus aureus

S aureus thuộc họ Micrococcaceae có hình cầu Chúng là những cầu khuẩn

Gram dương có kích thước từ 0,8 – 1,0 µm, thường tụ lại với nhau thành từng đám

như chùm nho rất đặc trưng hay thành từng chuỗi ngắn hoặc nằm riêng lẽ Đây là vi

khuẩn không di động, không sinh bào tử, thành vi khuẩn phần lớn là peptidolican [14]

S aureus là loại vi khuẩn hiếu khí, yếm khí tùy nghi, phân bố trong đất nước,

không khí, người Chúng mọc dễ dàng trên nhiều loại môi trường và có thể chịu được

nồng độ muối lên đến 15% Trên mặt thạch, S aureus cho dạng khuẩn lạc S (Smooth)

nhẵn, tròn đường kính 1 – 2 mm, sau ủ 24 giờ ở 37 oC khuẩn lạc thường có màu

vàng chanh [14]

Môi trường chủ yếu của S aureus là da, những tuyến da, các màng nhầy của

động vật máu nóng S aureus là một tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội, khi gặp được

điều kiện thuận lợi trên cơ địa suy giảm miễn dịch thì sẽ gây ra nhiều loại nhiễm trùng, thường gặp trong đường hô hấp và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm tai, viêm xoang, viêm họng, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp, nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ

1.3.2 MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)

MRSA là một trong ba tác nhân vi khuẩn Gram dương thường gặp, gây nhiễm trùng những bệnh nhân ở bệnh viện vì các bệnh như nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi do

thở máy, nhiễm khuẩn da và mô mềm Tuy nhiên, đã có những chủng riêng biệt của

S aureus đề kháng methicillin mắc phải từ cộng đồng (CA-MRSA) gần đây đã được

cảnh báo trong cộng đồng có thể gây nhiễm trùng cho trẻ em, những cá thể khỏe mạnh

mà không tiếp xúc bệnh viện

Nhiễm MRSA gây khó khăn cho điều trị bởi vì MRSA thường kháng các kháng sinh β-lactam phổ rộng bao gồm methicillin và những kháng sinh khác MRSA cũng

có nguy cơ kháng vancomycin, là “thuốc của phương sách cuối cùng” cho việc điều trị

những MRSA kháng đa kháng sinh Hai trường hợp đầu tiên có mức độ cao S aureus

kháng vancomycin được thông báo từ Mỹ năm 2004 [15]

Tại Việt Nam, việc sử dụng kháng sinh bừa bãi và không hợp lí dẫn đến sự gia

tăng đề kháng ở các chủng S aureus Hiện nay, MRSA cũng đang là nguồn lây lan

chính tại các bệnh viện ở Việt Nam

Theo “Báo cáo hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh

thường gặp ở Việt Nam năm 2004”, tỷ lệ S aureus đề kháng oxacillin đã khá cao,

vancomycin còn có tác dụng rất tốt, song nó chỉ nên được dùng khi S aureus kháng

oxacillin

Chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hô hấp

và nhiễm khuẩn huyết Nhưng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột

ở trẻ em [2]

1.3.5 Pseudomonas aeruginosa

P aeruginosa là vi khuẩn Gram âm có dạng thẳng, hai đầu tròn, dài 1 – 5 µm, rộng 0,5 – 1 µm Chúng ít khi có vỏ, có một lông ở một đầu, di động, không sinh bào tử [2]

P aeruginosathường sống ở trong đất, nước, trên da và niêm mạc người và động

vật, có mặt ở mọi nơi trong các bệnh viện Là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị mắc các bệnh ác tính hoặc mạn tính, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện, các vết thương hở,…[5]

Tại chỗ chúng gây viêm có mủ, điển hình là mủ có màu xanh Khi có điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm

tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xương,… Nhiễm khuẩn do P aeruginosa ngày càng

trở nên trầm trọng do sự kháng kháng sinh rất mạnh của vi khuẩn [31]

1.3.6 Candida albicans

C albicans là nấm men nội hoại sinh ở da và niêm mạc người, thường sinh sản

bằng cách nảy chồi Hình dạng tế bào thay đổi từ đơn bào hình bầu dục sang dạng sợi

C albicans thường sống vô hại ở màng nhầy (miệng, ruột, âm đạo) của người và động vật máu nóng Trong một số điều kiện nhất định, vi nấm chuyển sang trạng thái

kí sinh gây bệnh Số lượng vi nấm tăng lên đáng kể, có sự thành lập sợi tơ nấm giả

Sợi nấm giả thường chiếm đa số khi vi nấm kí sinh gây bệnh ở những mô sâu Ở vết thương ngoài da, số lượng nấm men nảy chồi chiếm ưu thế hơn sợi tơ nấm giả [12]

C albicans gây nên các bệnh về da như viêm và được tìm thấy nhiều hơn ở

những bệnh nhân viêm da dị ứng, tuy nhiên C albicans không phải là tác nhân gây

bệnh Trên da, nấm thường xuất hiện nhất là ở các kẽ giữa các ngón tay, ngón chân,

đặc biệt là trong môi trường ẩm ướt Nấm Candida còn thường gặp cả ở trẻ đang bú,

phía ngoài lớp da bị nấm thường bị sần chợt xuất hiện các vết loét tổn thương, ngứa, đau, rát [12]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU

1.4.1 Phương pháp chiết lạnh

Dung môi tinh khiết cho vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ nguyên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn [13]

Nguyên t ắc: chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị phức tạp

Nhược điểm: Lượng dung môi dùng nhiều, mất thời gian

Ngoài ra, có thể chiết xuất dược liệu bằng phương pháp chiết ngấm kiệt Đây là

quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được

liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết Phương pháp này hiệu quả cao hơn nhưng

đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn [3], [11]

1.4.2 Phương pháp chiết nóng

Phương pháp chiết nóng là phương pháp chiết được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi

Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có

nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn [3]

1.4.3 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Phương pháp chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu

hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên t ắc: Dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không

phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực

trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh [13]

Chiết lỏng – lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng

này không hòa tan vào nhau, thường dùng một pha nước và một pha dung môi hữu cơ

Có thể dùng dung môi hữu cơ để chiết nhiều chất dưới dạng phân tử bình thường, các

phân tử phức chelat kim loại và các cặp ion của nhiều ion hữu cơ, gồm có:

• Chiết đơn (chiết 1 lần): thường cho hiệu suất chiết thấp

• Chiết lặp (chiết nhiều lần): hiệu suất chiết cao hơn chiết đơn nhưng tốn

dung môi, thời gian và công sức

• Chiết ngược dòng: hiệu suất chiết rất cao

Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện

Nhược điểm: Dùng nhiều dung môi, ảnh hưởng sức khỏe người phân tích và gây

ô nhiễm môi trường Đôi khi tạo nhũ tương làm sai lệch kết quả [11]

Để khắc phục nhược điểm này, khi dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương, sử

dụng một đũa thủy tinh dài đưa vào trong bình lóng, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát

nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung

dịch nhanh chóng phân thành hai lớp Cũng có thể phá bọt bằng cách ly tâm dung dịch [11], [13]

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT

1.5 1 Phương pháp khuếch tán

1.5 1.1 Nguyên tắc

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một chất được xác định dựa trên sự khuếch tán của chất thử thể hiện qua vòng kháng khuẩn hoặc kháng nấm xung quanh một đĩa giấy đặt trên mặt thạch hoặc một lỗ cắt từ thạch Đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm được dùng để đánh giá hoạt lực của chất thử [17], [20]

Ưu điểm: So với phương pháp pha loãng, phương pháp khuếch tán đơn giản, dễ

thực hiện, giúp phát hiện vi sinh vật kháng thuốc dễ dàng và giá thành rẻ hơn

Nhược điểm: Phương pháp này đòi hỏi phải tìm được dung dịch đệm và môi

trường để chất thử khuếch tán tốt Nếu chất thử khó khuếch tán vào trong bản thạch sẽ làm kết quả không ổn định Mặt khác chưa có tiêu chuẩn đánh giá thống nhất đường

kính vòng vô khuẩn nên kết quả nhận được chỉ mang tính tương đối [20]

NCCLS đã công bố phương pháp đĩa giấy chuẩn NCCLS M18 dùng cho vi khuẩn và NCCLS M44 dùng cho nấm men vào năm 2003

1.5 1.2 Một số phương pháp thường được sử dụng

• Phương pháp đặt đĩa giấy

Dùng đĩa giấy có tẩm chất thử đặt trên bản thạch có tráng sẵn một lớp vi khuẩn hoặc lớp huyền dịch nấm Chất thử sẽ khuếch tán vào bản thạch, nếu có hoạt tính kháng khuẩn hoặc kháng nấm sẽ tạo ra một vòng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hoặc vi nấm này

• Phương pháp ống trụ

Chất thử được đặt trong ống hình trụ, đặt vào bản thạch có tráng sẵn một lớp vi khuẩn hoặc lớp huyền dịch nấm, chất thử sẽ khuếch tán vào trong bản thạch Nếu có tác dụng sẽ ức chế vùng xung quanh nơi đặt chất thử

• Phương pháp đục lỗ

Tương tự như phương pháp trên, bản thạch được đục lỗ để cho chất thử vào

1.5 2 Phương pháp pha loãng

1.5 2.1 Nguyên tắc

Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ thấp đến cao theo cấp số nhân trong môi trường đã cấy vi sinh vật Độ đục của môi trường thử được xác định bằng mắt thường hoặc bằng quang phổ kế, thường được dùng làm điểm dừng khi đọc kết quả Ở những nồng độ chất thử có tác dụng ức chế vi khuẩn, vi nấm, các ống thử trong; khi chất thử không có tác dụng, vi khuẩn, vi nấm phát triển làm môi trường trở nên đục [17], [22]

Kết quả xác định được bằng phương pháp pha loãng mang ý nghĩa định lượng Mức độ ức chế của chất thử nghiệm được xác định qua nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển vi sinh vật của chất thử (MIC: Minimun Inhibitory Concentration) Trị số MIC càng thấp, chất thử càng có tác dụng mạnh

1.5 2.2 Một số phương pháp thường được sử dụng

Phương pháp pha loãng (macrodilution) và phương pháp vi pha loãng (microdilution) theo NCCLS M27-A2 (2002) dùng cho nấm men

Phương pháp pha loãng dùng cho vi khuẩn theo NCCLS M7

Phương pháp chuẩn của NCCLS có thể biến đổi để phù hợp với các đặc điểm phát triển riêng biệt cho từng loại vi khuẩn, vi nấm khác nhau hoặc thuận tiện hơn, kinh tế hơn, dễ thực hiện và nhanh hơn, … với điều kiện phương pháp biến đổi cho kết quả phù hợp với phương pháp chuẩn, có sự liên thông kết quả giữa các phòng thí nghiệm, được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng

• Phương pháp pha loãng trên bản thạch

Chất thử được pha loãng thành một dãy các nồng độ thử trong bản thạch Chấm

vi khuẩn, vi nấm một lượng xác định trên môi trường thạch có sẵn chất thử

Phương pháp này thích hợp với những chất khó tan trong nước; dễ thực hiện nhưng đối với vi nấm thì chỉ thực hiện được trên nấm men vì phân tán được trong bản thạch, còn sợi nấm rất khó phân tán đồng đều

• Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng

Vi khuẩn hoặc vi nấm được cấy vào môi trường lỏng (có chứa chất thử được pha thành dãy nồng độ thử) phù hợp để đạt được nồng độ theo yêu cầu Tuy nhiên chỉ áp dụng được cho chất thử tan được trong môi trường sử dụng

Phương pháp pha loãng được sử dụng để xác định nồng độ tối thiểu ức chế được

sự phát triển của vi sinh vật thử nghiệm

MIC của một chất được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu của chất đó có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hoặc vi nấm từ 80 – 100% (quan sát bằng mắt thường) [17], [22]

1.5 3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

Dù sử dụng phương pháp khuếch tán hay pha loãng, để kết quả thu được đạt độ tin cậy cao và có tính liên thông giữa các phòng thí nghiệm, các điều kiện thí nghiệm

đã được CLSI chuẩn hóa sau đây được tuân theo

1.5 3.2 Môi trường dùng thử và pH của môi trường

Sử dụng môi trường khác nhau sẽ dẫn đến sự thay đổi kết quả thử vì các thành phần trong môi trường có thể tương tác với chất thử, nhất là những môi trường phức hợp pH của môi trường thử cũng ảnh hưởng nhiều đến kết quả thử; pH thấp hơn cho

MIC cao hơn ở phần lớn chất thử Trong điều kiện thí nghiệm, chúng tôi sử dụng môi trường thông dụng cho vi nấm như SDA, vi khuẩn như TSA, MHA

1.5 3.3 Nhiệt độ và thời gian ủ

Thời gian và nhiệt độ ủ ảnh hưởng rõ rệt trên giá trị MIC Thường MIC có khuynh hướng gia tăng khi kéo dài thời gian ủ Khó dự đoán được sự thay đổi kết quả theo sự biến đổi nhiệt độ ủ, nhưng sự thay đổi kết quả được cho là thấp nhất ở 35 0C NCCLS đề nghị sử dụng nhiệt độ ủ ở 35 0C trong 48 giờ cho Candida spp., ủ ở 37 0C

trong 16 – 18 giờ cho S aureus, E coli, S faecalis, MRSA và 24 giờ cho

P aeruginosa

1.5 3.4 Điểm dừng đọc kết quả

Sau thời gian ủ, tùy theo loại vi khuẩn 16 – 18 giờ ở 37 0C, nấm men 2 ngày ở

35 0C – 37 0C thì nồng độ thấp nhất nào của chất thử mà vi khuẩn hay vi nấm không

mọc được (không mọc thành khóm hay không làm đục dung dịch tùy theo môi trường

rắn hay lỏng) thì đó là MIC của chất thử Để đảm bảo số lượng vi khuẩn, vi nấm ở mỗi

lần chấm là như nhau [22]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu khảo sát về thực vật học

• Cây tươi Trinh nữ có đầy đủ rễ, thân, lá, hoa, quả được thu hái tại xã Tân

Thông Hội, huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh

• Quả Lựu tươi được thu mua tại nhà vườn thuộc xã Cai Lậy, tỉnh Tiền

Giang, Tp Hồ Chí Minh

2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm

Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 29213

Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) Streptococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Vi nấm Candida albicans ATCC 10231

2.1.3 Môi trường thử nghiệm

- Tryptic Soy Agar (TSA): môi trường giữ gốc và thử nghiệm vi khuẩn

- Sabouraud dextrose Agar (SDA): môi trường giữ gốc và thử nghiệm C albicans

- Mueller - Hinton Agar (MHA) có bổ sung glucose và xanh metylen: môi trường

thử nghiệm dùng cho C albicans

+ Mueller - Hinton Agar:

• Xanh metylen 100 µl

1 ml dung dịch glucose – xanh metylen cho 20 ml MHA

- Tryptic Soy Broth (TSB): môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm

• Peptone từ casein 15 g

• Peptone từ đậu nành 5 g

• Sodium cloride 5 g

• Nước cất vừa đủ 1000 ml

2.1.4 Nguyên liệu

Nguyên liệu Bộ phận dùng

Trinh nữ

Cây không hoa

Toàn cây trên mặt đất (thân + lá)

Rễ Toàn cây (có rễ)

Cây có hoa

Toàn cây trên mặt đất (thân + lá+ hoa)

Rễ Toàn cây (có rễ) Quả

Hạt

2.1.5 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

• Kính hiển vi quang học Olympus - Nhật

• Kính hiển vi soi nổi Nikon - Nhật

• Máy chụp ảnh Canon ISUX 800 - Nhật

• Lò hấp tiệt trùng Hirayma - Nhật

• Tủ cấy vô trùng Novaspec (AVC-4A1), Esco - Singapore

• Cân phân tích Precisa (XB220A) - Đức

• Máy vortex CLP (3412EU) - Mỹ

• Máy đo quang phổ Novaspec Plus - Singapore

• Bình chiết lắng gạn, Pipet paster

• Hộp Petri, ống nghiệm, ống trụ kim loại

• Các loại Erlen, Becher, Pipet, giấy lọc, phễu, đũa thủy tinh

• Micropipet, que cấy, đèn cồn, bông thấm nước, bông không thấm nước,…

Đối với quả Lựu: Phân tích và mô tả đặc điểm hình thái của vỏ quả và hạt Lựu

2.2.1.2 Đặc điểm giải phẫu

• Phương pháp cắt vi phẫu

- Cầm mẫu vật cần cắt đặt trên bàn, dùng dao lam cắt mẫu thành những lát thật mỏng Khi cắt, dao lam được đặt thẳng góc với mẫu vật

- Vị trí cắt trên mẫu vật thay đổi tùy theo cơ quan:

+ Đối với thân cây: Cắt ở phần lóng, không cắt sát và ngay mấu

+ Đối với phiến lá: Cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng không sát đáy phiến

+ Đối với rễ: Cắt ngang đoạn rễ có đường kính lớn hơn 1 mm

+ Đối với cuống lá: Cắt ở 1/3 phía đáy cuống, chừa phần sát chỗ nối cuống lá

và thân

• Phương pháp nhuộm vi phẫu

- Ngâm vi mẫu trong nước javel đến khi mẫu trắng

- Rửa sạch vi phẫu bằng nước (3 - 4 lần)

- Ngâm vi phẫu đã rửa trong dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút

- Rửa nước để loại bỏ hết acid acetic

- Nhuộm mẫu trong dung dịch thuốc nhuộm (đỏ son phèn - lục iod) khoảng

15 - 20 phút

- Rửa sạch vi phẫu bằng nước

- Ngâm trong nước thường hay trong dung dịch glycerin 50%

- Lên tiêu bản và quan sát

• Quan sát vi phẫu bằng kính hiển vi quang học, mỗi bộ phận quan sát từ

5 - 10 lát cắt Mô tả và chụp hình cấu trúc vi phẫu

2.2.2 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu

2.2.2.1 Chiết xuất cao thô

Dược liệu tươi phơi khô ở nhiệt độ phòng, xay nghiền thành bột Chiết xuất trong ethanol 96% bằng cách ngâm lạnh trong 24 giờ (chiết xuất 2 lần) Dịch chiết được bốc hơi ở 50 0C đến khi còn lại 1/10 thể tích ban đầu để có cao 1:1

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu

2.2.2.2 Thăm dò dung môi chiết xuất

10 g bột dược liệu được chiết xuất với 100 ml ethanol (96%, 70%, 50%, 30%) bằng cách ngâm lạnh trong 24 giờ hoặc đun hồi lưu trong 1 giờ (chiết xuất 2 lần) Dịch chiết được bốc hơi ở 50 0C đến khi còn lại 1/10 thể tích ban đầu để có cao 1:1 Thực hiện chiết song song với 10 g dược liệu khác nhưng dịch chiết được bốc hơi đến cạn, hút ẩm đến khối lượng không đổi (cao toàn phần – cao TP) cân để có khối lượng cao cho 10 g dược liệu

EtOH 96%; ngâm lạnh (chiết xuất 2 lần) Bay hơi ở 50 0C

Dược liệu tươi

Phơi ở nhiệt độ phòng

2.2.3 Phương pháp tinh chế cao toàn phần

2.2.3.1 Phương pháp tinh chế cao toàn phần 1

Dược liệu được chiết với EtOH 70% bằng cách ngâm lạnh Cao EtOH 70% được hòa tan trong EtOH 10%, tiến hành lắc phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực khác nhau n – Hexan, CH2Cl2, EtOAc theo hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 1

Cao TC H : cao tinh chế n-Hexan; Cao TC DCM : cao tinh chế dichloromethan

Cao TC EAc : cao tinh chế ethyl acetate; Cao TC EtOH 10% : cao tinh chế EtOH 10%

2.2.3.2 Phương pháp tinh chế cao toàn phần 2

Chiết xuất dược liệu với EtOH 70% bằng cách ngâm lạnh Tủa cao TPEtOH70%

trong methanol theo hình 2.3

CH2Cl2

Dịch CH2Cl2 EtOH 10%

50 0C Cao TCDCM

EtOAc

Dịch EtOAc

50 0C Cao TCEAc

EtOH 10%

Cao TCEtOH 10%

Khảo sát tác động kháng vi sinh vật

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 2

Cao TC 1 : cao tinh chế 1; Cao TC 2 : cao tinh chế 2

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của cao dược liệu

2.2.4.1 Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm

Vi khuẩn và vi nấm thử nghiệm được cấy hoạt hóa và pha loãng trong môi trường thích hợp để đạt nồng độ 106 CFU/ml đối với C.albicans và 108 CFU/ml đối với vi khuẩn

• Đối với vi khuẩn:

Sau khi được cấy hoạt hóa trên đĩa thạch TSA, ủ ở nhiệt độ 37 0C trong thời gian

18 – 24 giờ, lấy 3 – 5 khuẩn lạc có đường kính ≥ 1 mm để pha thành dịch treo trong dung dịch TSB Phân tán đều bằng máy vortex Ủ dịch treo ở 37 0C trong 4 – 6 giờ để

vi khuẩn tăng sinh Lượng vi khuẩn trong dịch treo được xác định lượng bằng quang phổ kế ở bước sóng 625 nm, mẫu trắng là dung dịch TSB Điều chỉnh dịch treo có giá trị OD = 0,08 – 0,12 (giá trị này tương đương với nồng độ vi khuẩn 1 – 2 x 108 tế bào

vi khuẩn/ml) Tiếp tục pha loãng dịch treo trong dung dịch TSB để đạt nồng độ 106 tế bào vi khuẩn/ml

50 0C

50 0C

Khảo sát tác động kháng vi sinh vật Cao TP EtOH70%

• Đối với C albicans:

Lấy khoảng 5 khóm nấm có đường kính ≥ 1 mm trên đĩa thạch SDA đã cấy hoạt hóa ở 37 0C trong 48 giờ để pha thành dịch treo trong nước muối sinh lý 0,85% có Tween 80 Phân tán đều bằng máy vortex Lượng nấm trong dịch treo được xác định bằng quang phổ kế ở bước sóng 530 nm, mẫu trắng là nước muối sinh lý 0,85% có Tween 80 Điều chỉnh dịch treo có giá trị OD = 0,08 – 0,12 (giá trị này tương đương với nồng độ nấm 1 – 5 x 106 tế bào nấm/ml)

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm

Phương pháp khuếch tán Phương pháp pha loãng

10 6 CFU/ml