Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây tầm bóp physalis angulata (2017)

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây... Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp

PHYSALIS ANGULATA

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS HOÀNG LÊ TUẤN ANH

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành báo cáo này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS

Hoàng Lê Tuấn Anh, đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình viết luận

văn

Em chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển, các anh, chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc – viện Hóa sinh biển – viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập, tận tình truyền đạt kiến thức và kĩ năng cần thiếtcho em Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu mà còn là hành trang quý giá để em bước vào đời một cách vững chắc

Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong

sự nghiệp cao quý Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Hóa sinh biển luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 4 năm 2017

Phạm Hồng Vân

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận:

“Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây

MỤC LỤC

1 LỜI CẢM ƠN 1

2 LỜI CAM ĐOAN 4

3 MỤC LỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU 6

4 MỞ ĐẦU 7

5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 9

6 CHƯƠNG 2 MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

7 CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM 38

8 CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 42

9 KẾT LUẬN 52

10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

MỤC LỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Tầm bóp………4

Hình 1.2: Các hợp chất Flavonoids ……… 8

Hình 1.3: Các hợp chất Withanolides ………15

Hình 2.1: Mẫu cây Tầm bóp ………… ………28

Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Tầm bóp ………33

Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1…36 Hình 4.1.2: Phổ proton 1H của hợp chất 1………37

Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 ………38

Hình 4.1.4: Phổ HSQC của hợp chất 1 ……… …………38

Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1……… …………39

Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 2.…41 Hình 4.2.2: Phổ proton 1H của hợp chất 2………42

Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2……… ………42

Hình 4.2.4: Phổ HSQC của hợp chất 2………43

Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2……… ………43

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các hợp chất Withanolides………8

Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 và chất tham khảo……….………39

Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo……….………44

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có nhiều điều kiện cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa dạng của

hệ thực vật Từ xưa đến nay, cây cỏ đã xuất hiện trong các bài thuốc dân gian và trong đời sống của con người

Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên là một nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm với mục đích phục vụ, đáp ứng nhu cầu về y tế, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong sinh hoạt của con người

Thiên nhiên không chỉ là nguồn cung cấp các “bài thuốc” quý hiếm mà còn

là nơi lưu trữ các chất dẫn đường để tổng hợp những bài thuốc mới Trong quá trình nghiên cứu các chất phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chế tạo ra những bài thuốc có khả năng phòng, chữa bệnh Trong đó có cây tầm bóp – Loại thực vật được sử dụng như dược liệu quý, sử dụng phổ biến có tác dụng thanh nhiệt, tiêu đờm, chủ trị các chứng bệnh như cảm sốt, yết hầu sưng đau,… là một dược liệu trong bài thuốc dân gian nên cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp:

‘‘Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của

cây tầm bóp (Physalis angulata)’’

Với mục đích nghiên cứu thành phần diclometan từ lá cây tầm bóp và xác

nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Việt Nam Đây là yếu tố quan trọng có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển của nền y học

Nhiệm vụ chính của đề tài là :

1 Thu mẫu cây tầm bóp (Physalis angulata), xử lý mẫu và tạo dịch chiết

2 Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn điclometan từ lá cây tầm bóp

(Physalis angulata)

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

Tên thực vật : Physalis angulata

Tên thường gọi: Tầm bóp (Thù lù canh, bôm bốp, lồng đèn )

Phân loại khoa học

(không phân hạng) Angiospermae

(không phân hạng) Eudicots

Tầm bóp là cây thân thảo hằng niên, mọc hoang quanh năm

Thân: Thân cao 50 - 100 cm, phân nhiều cành Đường kính thân tròn, 1-2

cm

Lá: Lá mọc so le, hình bầu dục, chia thùy hay không, dài 30 - 35mm, rộng

20 - 40mm; cuống lá dài từ 15 - 30mm

Hoa: Hoa mọc đơn độc ở nách lá, có cuống mảnh, dài khoảng 1 cm Đài hình chuông, có lông, chia ra từ phía giữa thành 5 thùy, tràng hoa màu vàng tươi hay màu trắng nhạt, có khi điểm những chấm màu tím ở gốc hoa Đài đồng trưởng bao lấy quả nên có tên là quả lồng đèn

Quả: Quả mọng tròn, nhẵn, lúc non màu xanh, khi chín màu đỏ, có đài cùng lớn với quả, dài 3-4 cm, rộng 2 cm, bao trùm lên ở ngoài như cái túi, hạt nhiều hình thận Ruột quả có nhiều không gian rổng, khi bóp quả vỡ phát ra tiếng “bộp”

Hạt: Quả chứa nhiều hạt nhỏ nhỏ hình thận, hạt có ngoại nhũ khi chín ăn có

vị chua, ngọt Cây ra hoa kết quả quanh năm [1][3]

Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Tầm bóp

1.1.3 Phân bố và sinh thái

Các loài trong Chi Physalis thường là cây thân thảo đứng sống một năm hay

nhiều năm Hầu hết các loài yêu cầu ánh nắng mặt trời đầy đủ và khí hậu khá ấm

áp và chịu nhiệt độ nóng Một số loài rất nhạy cảm với sương giá, nhưng có một

số loài chẳng hạn như loài thù lù Trung Quốc, P alkekengi, chịu đựng được nhiệt

độ rất lạnh và sống được qua mùa đông Các loài trong Chi thù lù có đặc trưng là quả khi chín có màu cam và tương tự về kích thước, hình dạng và cấu trúc giống như quả nhãn lồng (chùm bao) với ruột quả có nhiều ngăn rộng và một số loài có quả ruột đặt giống như quả cà chua, là loại quả ăn được với tên gọi là quả anh đào

đất (Groundcherry)

Ở Việt Nam, cây Tầm bóp không rõ xuất hiện từ lúc nào, nhưng đã từ lâu

nó đã trở thành cây mọc hoang dại trên mọi miền đất nước và được người dân dùng làm rau ăn và dùng làm thuốc trong dân gian để chữa bệnh Thực tế cho thấy cây mọc ở vùng có độ cao so với mặt nước biển ăn bùi và thơm hơn cây mọc ở vùng đồng bằng, đặc biệt là khi cần làm thuốc người ta thường tìm đến cây rau Tầm bóp của các vùng núi cao.[2]

1.1.4 Tính vị và công dụng của cây tầm bóp

Tính vị: Toàn cây có vị đắng, tính mát, không độc Quả có vị chua

Công dụng :

Bộ phận sử dụng làm thuốc là toàn cây có tác dụng kháng khuẩn, chống ung thư, chống đông máu, chống bệnh bạch huyết,chống nấm và vi khuẩn, chống loại nấm nguyên sinh antimycoplasmique, ( loại vi khuẩn không có vách tế bào ), chống co thắt, chống ung bướu, kháng virus, hạ đường máu , hạ huyết áp , điều

hòa miễn dịch ( điều hòa biến đổi một số tế bào miễn nhiễm hoạt động quá mức), kích thích miễn dịch, thường dùng trị cảm sốt, yết hầu sưng đau, ho nhiều đờm, phiền nhiệt nôn nấc

Quả Tầm bóp ăn được và dùng chữa đờm nhiệt sinh ho, thủy thũng và đắp ngoài chữa đinh sang, rễ tươi nấu với tim lợn, chu sa dùng ăn chữa được

Lá cây tầm bóp rất tốt cho dạ dày, do đó ngoài việc dùng tầm bóp làm thuốc chữa bệnh người ta còn dùng thứ cây này như một vị rau ăn hàng ngày Rau tầm bóp ăn hơi đắng nhưng thanh mát dễ ăn

Những người hay lênh đênh sông nước nên ăn quả này thường xuyên

vì lượng Vitamin C và B1, tiền vitamin A trong quả tầm bóp rất cao nên rất tốt cho cơ thể, có thể chữa bệnh Scorbut vì trên biển không có hoa quả Ngoài ra quả tầm bóp còn có thể phòng ngừa các bênh về đường tiết niệu và viêm thận ví dụ sỏi thận, sỏi bàng quang và chữa bệnh gút rất tốt

Ở Ấn Độ, toàn cây được sử dụng làm thuốc lợi tiểu; lá được dùng trị các rối loạn của dạ dày

Ở Africa, họ ăn lá cây đã được nấu chín hoặc dùng như một tấm băng

để băng các vết thương bị nhiễm trùng

1.1.5 Thành phần hóa học

Theo nghiên cứu của Chothani và Vaghasiya chỉ ra rắng quả tầm bóp có chứa 61,4% nước trái cây và 76,7% độ ẩm Nó cũng chứa đường, tannin, khoáng chất, protein, pectin và một lượng vitamin tốt cho cơ thể (24,45 mg / 100 ml nước trái cây) Hạt giống gồm 2 phần là dầu và protein Phần dầu có chứa axit béo, tức

là palmitic, stearic, oleic, linoleic và chứa một lượng nhỏ axit béo hexadecen và axit béo hydroxyl [19]

Thành phần khi chiết dịch cây cho thấy, cây có chứa một số hợp chất loại Flavonoid và Withanolides Ngoài ra còn có chlorogenic acid, cholin, xocarpanolid, myricetin, phygrin [20]

1.1.5.1 Các hợp chất Flavonoids

Nghiên cứu về thành phần Physalis angulata đã phân lập được 6 hợp chất

(1-6): Myricetin 3-O-neohesperidoside (1) [13], Luteolin-7-O d-glucopyranoside (2) [14], Quercetin (3), Querc444etin 3-O-methyl ether (4), Kaempferol 7-O- rhamnoside (5), Isoquercetrin (6) [7]

Phân lập được 33 hợp chất (7-39) từ thành phần Physalis angulata

Hình 1.3: Các hợp chất Withanolides 1.1.6 Hoạt tính sinh học

- Hoạt tính chống viêm , giảm đau và hạ sốt : Theo nghiên cứu Murad và các cộng sự đã nghiên cứu về chiết xuất thô và phân đoạn chloroform của các cây

thuộc chi Physalis cho thấy khả năng chống viêm giảm đau rất tốt Khả năng hạ

sốt của chiết xuất thô và phận đoạn chloroform không đáng kể [13]

- Hoạt tính gây độc tế bào: Kheng Leong Ooi, Tengku Sifzizul Tengku Muhammad, Shaida Fariza Sulaiman thử nghiệm độc tính của physalin F cho thấy hiệu quả ức chế đáng kể phụ thuộc vào liều lên tế bào T-47D với giá trị EC50 thấp hơn (3,60 μg / ml) so với chiết xuất thô Phân tích biểu hiện mRNA cho thấy sự đồng điều chế gen c-myc và caspase-3-apoptotic trong các tế bào đã được điều trị với mức biểu hiện tại 9 và 12 giờ điều trị Cơ chế gây độc này được khẳng định lại bởi quá trình phân mảnh DNA và phosphatidylserine bên ngoài.[ 15]

- Hoạt tính “in vitro”: Theo nghiên cứu của Kashima và các cộng sự chỉ ra rằng các chiết xuất dầu thô của cả hai bộ phận trên không và rễ từ dịch chiết của

(37)

(38)

tại Nhật có một số nghiên cứu chú trọng đến các hoạt tính “in vitro” chống lại các siêu vi khuẩn bại liệt, Herpes simplex I, sởi, ban hồng, trái rạ và cả HIV-I (do ức chế sao chép ngược)

- Hoạt tính chống ung thư: Nghiên cứu tại Viện khảo cứu các hợp chất thiên nhiên thuộc ĐH y khoa Kaohsiung (Thượng Hải) về hoạt tính chống ung thư gan

của Physalis angulata ghi nhận các dịch chiết toàn cây bằng nước và bằng ethanol

được đánh giá về hoạt tính chống ung thư gan trên các dòng tế bào Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 ghi nhận hoạt tính chống ung thư do gây ra hiện tượng tế bào tự hủy (apoptosis) phối hợp với những rối loạn chức năng của các mitochondria nơi màng tế bào bị ung thư Tác dụng diệt bào này không xảy ra nơi các tế bào gan lành mạnh

- Nghiên cứu tại khoa vi trùng và miễn dịch học, ĐH y khoa quốc gia Cheng

Kung (Thượng Hải) ghi nhận các dịch chiết từ Physalis angulata có những hoạt

tính điều hòa hệ miễn dịch như cải thiện đáp ứng blastogenesis (lý thuyết cho rằng các đặc điểm di truyền được chuyển từ cha mẹ sang con cái bằng mầm nguyên sinh); kích hoạt các tế bào T; gia tăng đáp ứng kháng thể… [5]

- Nghiên cứu tại Nhật (khoa dược, ĐH Fukuoka) ghi nhận phần trên mặt đất

của cây Tầm bóp (Physalis angulata) có hoạt tính diệt được một số ký sinh trùng,

đặc biệt nhất là Trypanosoma cruzi - tác nhân gây bệnh Chagas do con Rệp hun lây truyền

- Ngoài ra , cây Tầm bóp còn có một số hoạt tính : chống oxy hóa, chống sốt rét và hoạt tính NF-κB [12]

1.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Chọn dung nôi khả năng hoà tan tối đa các hoạt chất và tối thiểu các tạp chất trong dược liệu

Chất lượng của dung môi

- Dễ thấm và hoà tan chọn lọc (hoà tan nhiều dược chất, ít tạp chất)

- Trơ về mặt hoá học: không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn trong quá trình bảo quản

- Không bị phân huỷ bới nhiệt độ cao và không gây cháy nổ

- Phải bay hơi được khi cần cô đặc dịch chiết

- Không làm thành phẩm có mùi vị đặc biệt

Các dung môi hay được sử dụng

- Những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả, củ…) chủ yếu là clorofoc, metylen clorit và methanol

- Người ta sử dụng dung dịch nước của methanol thay vì dùng nước để chiết dịch thô từ cây

- Axeton có thể tạo thành axetonit nếu 1,2- cis- diol có mặt trong môi trường axit Quá chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit, bazơ để tạo ra những sản phẩm mong muốn

- Dietylete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ Peroxit

của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30

- 40ºC với một vài hóa chất chịu nhiệt để có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.2.2 Quá trình chiết

Các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước Thông thường bình chiết ngâm không sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ sau đó mới lấy chất chiết ra Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được

sẽ không chứa những chất giá trị nữa Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như sau:

- Với các ankaloit , có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng phản ứng tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer,…

- Với các flavonoid thường là những hợp chất màu nên khi dịch chảy ra mà không có màu có nghĩa là đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

- Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde

có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sử dụng phản ứng với

1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ

Sắc ký là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên

1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí

Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …) Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân

tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký Các chất khác nhau sẽ có

ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo

hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký

Ta có định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh có nồng độ n1∞ (nồng độ của dung dịch ) khi nhiệt độ không đổi

n = n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh

N∞ : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên chất hấp phụ nào đó b: Hằng số

C: Nồng độ của chất bị hấp phụ

1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký

• Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh: sắc ký lỏng

và sắc ký khí

• Phân loại theo cơ chế của quá trình tách : Sắc ký hấp phụ, sắc ký phân

bố, sắc ký trao đổi ion và Sắc ký rây phân tử

• Phân loại theo cách hình thành sắc đồ: phương pháp tiền lưu, phương pháp đẩy,phương pháp rửa giải

• Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

1.3.3.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp[1] Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút

N∞ b.C 1+b.C

lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch

1.3.3.2 Sắc ký cột

Đây là phương pháp sắc ký được sử dụng nhiều nhất

Chất hấp phụ (pha tĩnh) bao gồm các loại silicagen (độ hạt khác nhau) Pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion,… chất hấp phụ được nhồi vào cột (chủ yếu là cột thủy tinh, ngoài ra còn có cột kim loại inox) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng lớn thì số đĩa lí thuyết càng nhỏ , khả năng tách càng thấp và ngược lại Có thể điều chỉnh tốc độ chảy tăng lên hoặc giảm đi tùy theo độ hạt chất hấp phụ (Độ hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy cũng giảm đi) Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), giải pháp khi đó để hết hiện tượng tắc người ta phải

sử dụng áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC)

Tỷ lệ L/D rất quan trọng, thể hiện khả năng tách cột (với L- chiều cao cột

và D- Đường kính cột) Nó phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp nhất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Chính nhờ sự khác nhau này mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất

Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp từ 1/5 đến 1/10, còn nếu tách tinh thì tỷ lên này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách