Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro và tác động bảo vệ gan in vivo của cao chiết cồn 70% từ quả vả (ficus auriculata l )

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO VÀ TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN IN VIVO CỦA CAO CHIẾT CỒN 70% TỪ QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA L.) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: KHOA DƯỢC, ĐH Y DƯỢC TP HCM Chủ trì nhiệm vụ: PGS TS HUỲNH NGỌC TRINH Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 i ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA IN VITRO VÀ TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN IN VIVO CỦA CAO CHIẾT CỒN 70% TỪ QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA L.) (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ) Cơ quan chủ quản Chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) (ký tên) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) i MỤC LỤC MỤC LỤC III CHƢƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 2.1 CÂY VẢ FICUS AURICULATA L .2 2.1.1 Thực vật học 2.1.2 Vị trí phân loại 2.1.3 Thành phần hóa thực vật 2.1.4 Tác dụng dƣợc lý .4 2.1.5 Công dụng y học cổ truyền 2.2 GỐC TỰ DO 2.3 THỬ NGHIỆM IN VITRO VỀ KHẢ NĂNG ĐÁNH BẮT GỐC TỰ DO DPPH .7 2.4 CARBON TETRACLORID (CCL4) .7 2.4.1 Sơ lƣợc CCl4 [4] 2.4.2 Cơ chế gây độc CCl4[4], [33] .8 2.4.3 Một số mơ hình chuột nhắt trắng bị gây độc CCl4 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .10 3.1.1 Động vật thử nghiệm .10 3.1.2 Hóa chất, dung mơi 10 3.1.3 Cao toàn phần Vả .10 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.2.1 Khảo sát tác động chống oxy hóa in vitro .11 3.2.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao toàn phần Vả .11 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .15 4.1 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO 15 4.2 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN IN VIVO 15 4.2.1 Nồng độ ALT AST .15 4.2.2 Nồng độ MDA VÀ GSH 16 4.3 BÀN LUẬN 17 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 22 5.1 KẾT LUẬN 22 5.2 ĐỀ NGHỊ .22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 CHƢƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Vả với tên khoa học Ficus auriculata L Moraceae loài quen thuộc nƣớc ta, Vả phận dùng đ đƣợc sử dụng rộng r i Quả Vả không thực phẩm giàu dinh dƣỡng mà vị thuốc cổ truyền hiệu với nhiều công dụng nhƣ nhiệt, giải độc, tiêu đờm, lợi tiểu, nhuận tràng, điều hòa nhu động ruột, chữa kiết lỵ, táo bón, trị giun, chữa tỳ hƣ, tiêu chảy lâu ngày, tiêu hóa kém,…[2], [3], [25] Gần có nghiên cứu cho thấy Vả có tác dụng hạ cholesterol, ổn định đƣờng huyết, ngăn ngừa bệnh tim mạch ung thƣ [8], [20], [35], [12] Tuy nhiên, chƣa có nhiều nghiên cứu Việt Nam công bố chi tiết tác dụng dƣợc lý Vả, nên việc khai thác đƣa vào sử dụng giống tiềm cịn nhiều hạn chế Để góp phần tìm kiếm thêm nguyên liệu làm thuốc khám phá tác dụng dƣợc lý thuốc dân gian, dựa theo thơng tin tìm hiểu, chúng tơi tiến hành đề tài “Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro tác động bảo vệ gan in vivo cao chiết cồn 70% từ vả (Ficus auriculata L.) ” với mục tiêu sau: + Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro phản ứng với thuốc thử DPPH + Đánh giá tác động bảo vệ gan in vivo mơ hình gây tổn thƣơng gan carbon tetraclorid CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CÂY VẢ FICUS AURICULATA L 2.1.1 Thực vật học Tên khoa học: Ficus auriculata Loureiro Tên đồng nghĩa: Covellia macrophylla Miq., Ficus macrocarpa H Lév & Vaniot, Ficus macrophylla Roxb., Ficus regia Miq., Ficus roxburghii Wall Ex Miq., Ficus sclerocarpa Griff Tên Tiếng Việt: Cây Vả, Vả, Mác ngoa (Tày) [2], [25] Đặc điểm hình thái Cây to, cao – 10 m, tán tỏa rộng Cành mập có lơng cứng thƣa Lá to, mọc so le, phiến dài mềm, hình gần trịn, dài 15 – 35 cm, rộng 11 – 30 cm, gốc hình tim, đầu tù có mũi nhọn, mặt nhẵn, mặt dƣới có lơng mịn gân, gân – gốc lá, mép khít khơng đều; cuống dài, to, có nhiều lơng thƣa; kèm màu đỏ, có lơng [2], [25] Cụm hoa mọc gốc thân cành già, hình cầu; hoa đực xếp xung quanh lỗ cụm hoa, dài không đều, hàn liền gốc, nhị đỉnh gốc; hoa gốc cụm hoa, đài hàn liền bao kín bầu lúc non, bầu thuôn gốc [2], [25].Quả phức to nắm tay, hình cầu dẹt, phần phẳng loe to, lõm giữa, phần cuống thn nhỏ dần, chín màu đỏ nâu sẫm, thịt mềm, mặt ngồi có lơng nhỏ mịn, bên có dịch đƣờng sánh nhƣ kẹo, ăn đƣợc Hình 2.1 Một số hình ảnh lồi Ficus auriculata L 2.1.2 Vị trí phân loại Vị trí lồi Ficus auriculata Loureirothuộc họ Dâu tằm (Moraceae) theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín A L Takhtajan cơng bố năm 1987 đ sửa đổi năm 2009 [36] nhƣ sau: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliophyta) Phân lớp Sau Sau (Hamamelididae) Bộ Gai (Urticale) Họ Dâu tằm (Moraceae) Chi Chi Chi Artocarpu Ficus L Morus … Lồi Ficus auriculata Lour Hình 2.2 Sơ đồ phân loại thực vật học loài Ficus auriculata L 2.1.3 Thành phần hóa thực vật Năm 2011, El-Fishawy cộng đ phân lập định danh đƣợc hợp chất có loài Ficus auriculataL bao gồm: acid betulinic (1), lupeol (2), stigmasterol (3), bergapten (4), scopoletin (5), β-sitosterol-3-O-β-glucopyranoside (6), myricetin (7) quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (8)[20], [38] Vào năm 2014, từ cao phân đoạn ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat thân Ficus auriculata L., Shao cộng đ phân lập định danh đƣợc hợp chất lactone hợp chất lactone có cấu trúc tƣơng tự đ đƣợc biết đến [35] (3R,4R)-4-hydroxy-de-O-methyllasiodiplodin(9), 6-oxolasiodiplodin (10), ficusines A-C (11-13), (R)-(+)lasiodiplodin (14), (+)-(R)-de-O-methyllasiodiplodin (15), (3R,6S)-6-hydrolasiodiplodin (16) [16] Tuy nhiên chƣa có cơng trình nghiên cứu khảo sát thành phần hóa thực vật loài Ficus auriculata L Việt Nam 2.1.4 Tác dụng dƣợc lý 2.1.4.1 Chống đái tháo đƣờng Nghiên cứu Ahlam El-Fishawy cộng năm 2011 tác dụng chống đái tháo đƣờng của Ficus auriculata L mơ hình chuột mắc bệnh đái tháo đƣờng gây alloxan cho thấy dịch chiết ethanol 70% từ Ficus auriculata L làm giảm 8,2% nồng độ glucose máu chuột mắc bệnh đái tháo đƣờng (liều 500 mg/kg) so với giá trị trƣớc điều trị [20] Kết nghiên cứu Thingbaijam cộng năm 2013 đ cho thấy dịch chiết methanol từ Ficus auriculata L (300 mg/kg b.w 600 mg/kg b.w) làm giảm glucose máu chuột bị đái tháo đƣờng gây streptozotocin [37] Nghiên cứu Nguyễn Linh Nhâm cộng năm 2015 sàng lọc in vitro tác dụng ức chế α-glucosidase số loài thuộc họ dâu tằm (Moraceae), cho thấy cao cồn toàn phần thân Vả (Ficus auriculata L.) có tác dụng ức chế 90% hoạt tính enzyme α-glucosidase nồng độ 0,01 mg/ml Các cao phân đoạn CHCl3, EtOAc, MeOH đƣợc tách phân bố từ cao cồn tồn phần có IC50 lần lƣợt 2,365 µg/ml, 0,162 µg/ml, 4,2 µg/ml [8] 2.1.4.2 Giảm lipid máu Theo nghiên cứu năm 2013 đƣợc thực Rosalind Thingbaijam cộng sự, dịch chiết methanol từ Ficus auriculata L (300 mg/kg b.w 600 mg/kg b.w) có tác dụng làm giảm cholesterol, TG, LDL-C, VLDL-C tăng nồng độ HDL-C [37] 2.1.4.3 Hoạt tính chống oxy hóa Theo nghiên cứu Gaire cộng vào năm 2011 cho thấy khả đánh bắt gốc tự DPPH dịch chiết chloroform methanol từ vỏ thân Vả (Ficus auriculata L.) 85% dịch chiết n-hexan 42% [23] Nghiên cứu năm 2011 Ahlam El-Fishawy cộng cịn chứng minh hoạt tính chống oxy hóa cao Ficus auriculataL [20] 2.1.4.4 Kháng khuẩn – Kháng viêm Nghiên cứu Bhakta P Gaire cộng đ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ba loài E.coli, S.aureus Bacillus subtilis dịch chiết n-hexan, clorofome, methanol từ vỏ thân Ficus auriculata Kết cho thấy dịch chiết methanol tác động ức chế vi khuẩn E coli mạnh nhƣng yếu S aureus Trong dịch chiết n-hexane lại có hoạt tính kháng khuẩn cao S aureus Trên Bacillus subtilis, dịch chiết từ Ficus auriculata L thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh so với dịch chiết từ [23] Hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào diện hợp chất sterols triterpenoids nhƣ acid betulinic, lupeol, stigmasterol β-sitosterol-3-O-β-Dglucoside [32] phụ thuộc vào diện tannin vỏ Ficus auriculata L [23] Bên cạnh đó, dịch chiết từ Ficus auriculata L liều 500 mg/kg thể rõ tác dụng kháng viêm mô hình gây phù bàn chân chuột carrageenan [20] 2.1.4.5 Ức chế tăng sinh tế bào Năm 2014, Shao cộng đ phân lập đƣợc hợp chất có vịng lactone (R)-(+)lasiodiplodin, (+)-(R)-de-O-methyllasiodiplodin Ficus auriculata L Chúng có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào tạo xƣơng chuột mơ hình in vitro [35] 2.1.5 Công dụng y học cổ truyền Trong dân gian, Vả đƣợc dùng trị kiết lỵ, trĩ, táo bón Nhựa dùng bơi trị mũi có nhiều mụn đỏ Để chữa suy nhƣợc, ăn, gầy yếu, dùng Vả vừa chín tới, phơi nắng sấy khơ, lấy 500 g khô cắt nhỏ, ngâm với lít rƣợu trắng 10 – 20 ngày Ngày uống lần trƣớc bữa ăn trƣớc lúc ngủ, lần chén nhỏ [2] 2.2 GỐC TỰ DO Gốc tự nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử có hay nhiều electron khơng ghép đơi lớp ngồi Gốc tự tồn độc lập, nhiên, thời gian tồn chúng thƣờng ngắn (khoảng phần triệu đến phần nghìn giây) Các electron có lƣợng cao, bền nên dễ dàng tham gia phản ứng hóa học nhƣ phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng polymer hóa,…[40] Các gốc tự gồm dẫn xuất dạng khử oxy nitơ phân tử (Reactive Oxygen Species – ROS Reactive Nitrogen Species – RNS) ROS RNS đƣợc chia thành hai nhóm gốc tự dẫn xuất khơng phải gốc tự – tiền chất gốc tự ROS RNS gây tổn thƣơng thay đổi giá trị sinh học đại phân tử sinh học nhƣ ADN, protein lipid [17] Trong đó, gốc superoxid O2•‒ gốc tự quan trọng tế bào Từ gốc O2•‒ nhiều gốc tự phân tử khác oxy có khả phản ứng cao đƣợc tạo nhƣ: HO• (gốc hydroxyl), H2O2 (hydroperoxyd), 1O2 (oxy đơn bội), LO• (gốc lipoxyd), LOO• (gốc lipoperoxyd), RO• (alkoxyd), LOOH [13] Trong tế bào, gốc tự đƣợc sinh phản ứng chuyển nhƣờng điện tử Những phản ứng đƣợc thực enzym không enzym, thông qua oxy hóa khử ion kim loại chuyển tiếp Ngoài ra, tác nhân ngoại sinh nhƣ điều kiện sống bị nhiễm, stress, khói thuốc, xạ làm gốc tự gia tăng Trong thể tồn cân gốc tự chất chống oxy hóa Đó trạng thái cân nội môi Nếu gia tăng mức kéo dài nguyên nhân bên hay bên ngồi tế bào, s dẫn đến tình trạng cân tham gia phản ứng với nhóm –SH cầu nối methylen acid béo chƣa no Trong điều kiện có oxy s tạo thành peroxyd gây peroxyd hóa lipid Sản phẩm cuối aldehyd mạch ngắn nguyên nhân gây viêm, hoại tử gan Các phản ứng đƣợc theo dõi việc đo lƣờng dien liên hợp MDA sản phẩm cuối peroxyd hóa lipid 2.4.3 Một số mơ hình chuột nhắt trắng bị gây độc CCl4 - Tiêm phúc mô dung dịch CCl4 pha dầu Lấy 4-5 ml CCl4 hòa với dầu thực vật cho đủ 10 ml, tiêm phúc mô 0,1 ml/10 g thể trọng chuột Sau 24 giờ, chuột s đƣợc cho dùng thuốc thử nghiệm [10] - Gây tổn thƣơng gan chuột cấp tính cách tiêm phúc mô dung dịch CCl pha dầu oliu liều (0,1 ml/10 g thể trọng chuột) nồng độ khác 0,25%; 0,5%; 1% 2% để gây mức độ tổn thƣơng gan khác Đánh giá mức độ tổn thƣơng gan gián tiếp qua việc theo dõi gia tăng hoạt tính enzyme ALT, AST huyết [4] - Chuột đƣợc cho dùng thuốc thử nghiệm 14 ngày Ngày thứ 15 gây bệnh dung dịch CCl4 0,2% pha dầu oliu, tiêm phúc mô liều (0,1 ml/ 10g thể trọng chuột), chuột đƣợc cho nhịn đói qua đêm Sáng ngày 16, chuột đƣợc gây ngạt đá CO2, mổ lấy máu tim gan để khảo sát hoạt tính enzyme gan ALT, AST xác định hàm lƣợng MDA, GSH gan [7], [11], [41] CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1 Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, giống đực, cân nặng khoảng 25 – 30 g, khỏe mạnh, khơng dị tật, khơng có biểu bất thƣờng Viện Vaccin Sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp Chuột đƣợc nuôi ổn định nhiệt độ phòng 3-4 ngày trƣớc bắt đầu thử nghiệm Thức ăn (do Viện Vaccin Sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp) nƣớc uống đƣợc cung cấp đầy đủ ngày 3.1.2 Hóa chất, dung mơi Silymarin 70 mg (Legalon® 70 Protect), Madaus, Đức Thuốc thử định lƣợng ALT (alanine aminotransferase) AST (aspartate aminotransferase) EliTech Clinical System, Pháp Huyết chuẩn Randox, Anh Các chất chuẩn/hóa chất sau: quercetin, acid ascorbic, DPPH (2,2-Diphenyl-1picrylhydrazyl), 5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid), L-Glutathion reduced (GSH), acid thiobarbituric (TBA), 1,1,3,3-Tetramethoxypropan (MDA) Sigma-Aldrich, Đức Tetraclorid carbon (CCl4), acid tricloroacetic (TCA), ethanol, KCl, KH2PO4, K2HPO4, Na2CO3 Trung Quốc 3.1.3 Cao toàn phần Vả Quả Vả đƣợc thu hái huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế Nguyên liệu đƣợc cắt nhỏ, sấy khô xay thô đến kích thƣớc khoảng mm Bột Vả đƣợc tiến hành chiết xuất phƣơng pháp ngấm kiệt với cồn ethanol 90%, 70% 45% Các dịch chiết sau đƣợc cô thu hồi dung môi máy cô quay chân khơng, thu đƣợc cao tồn phần từ Vả Hiệu suất chiết trung bình cao lần lƣợt 10,82%, 10,90% 9,31% 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Khảo sát tác động chống oxy hóa in vitro Cao trà Vả đƣợc pha dung dịch DMSO 2%, chất đối chứng dƣơng (acid ascorbic) đƣợc pha nƣớc cất thành d y nồng độ Thuốc thử DPPH 90µM pha methanol trƣớc dùng đựng chai thủy tinh màu nâu, đậy kín nút Cho vào ống nghiệm đồng lƣợng dung dịch cao Vả/ acid ascorbic với dung dịch DPPH Lắc hỗn hợp phản ứng, để yên tối nhiệt độ phòng 30 phút Đo độ hấp thu mẫu (Abs) bƣớc sóng 517 nm; từ tính hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) đƣợc theo cơng thức sau: HTCO (%) = Trong Abschứng: Độ hấp thu giếng chứa mẫu chứng có DPPH Absthử: Độ hấp thu giếng chứa mẫu thử có DPPH Absmàu: Độ hấp thu giếng chứa mẫu thử DPPH Mỗi mẫu đƣợc đo lần lấy giá trị trung bình Từ giá trị HTCO, xây dựng phƣơng trình đa thức bậc biểu diễn mối liên quan nồng độ mẫu thử HTCO; từ tính tốn giá trị EC50 (là nồng độ có hiệu đánh bắt 50% DPPH) Cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao đƣợc lựa chọn để đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo 3.2.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao tồn phần Vả 3.2.2.1 Bố trí thí nghiệm Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành lô nhƣ sau: - Lô bệnh (n=7): cho chuột uống nƣớc cất với thể tích 10 mL/kg - Lơ trà Vả (n=8): cho chuột uống cao Vả 250 mg/kg/lần - Lô đối chứng (n=7): cho chuột uống silymarin liều 50 mg/kg - Lô sinh lý (n=6): cho chuột uống nƣớc cất với thể tích 10 mL/kg Chuột đƣợc cho uống silymarin/cao Vả/nƣớc cất lần ngày vòng 14 ngày Vào ngày 15, chuột lô (ngoại trừ lô sinh lý) đƣợc gây viêm gan cấp tính cách tiêm phúc mô dung dịch CCl4 (pha dầu parafin thành nồng độ 0,5%), thể tích tiêm mL/kg Chuột sau đƣợc cho nhịn đói qua đêm Sáng ngày 16, chuột đƣợc gây ngạt đá CO2, mổ nhanh để lấy máu tim tách phần huyết tƣơng để đánh giá hoạt tính enzym ALT AST phƣơng pháp đo động học enzym bƣớc sóng 340 nm Gan chuột sau đƣợc tách để định lƣợng hàm lƣợng MDA GSH gan 3.2.2.2 Đo hoạt tính enzym gan ALT AST Nguyên tắc: Xác định hoạt tính enzym gan ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase) phƣơng pháp đo động học enzym dựa phản ứng: L-alanine + 2-Oxoglutarate ⇔ Pyruvate + L-glutamate Pyruvate + NADH + H+ → L-lactate + NAD+ L-aspartate + 2-Oxoglutarate ⇔ Oxoglutarate + L-glutamate Oxoglutarate + NADH + H+ ⇔ L-malate + NAD+ Độ hấp thu NADH đƣợc đo bƣớc sóng 340 nm Hoạt tính enzym gan ALT, AST đƣợc tính tốn dựa thay đổi độ hấp thu NADH thời gian phản ứng q trình oxy hóa NADH tỷ lệ thuận trực tiếp với hoạt tính enzym Quy trình: Bảng 3.3 Quy trình đo hoạt độ ALT / AST Thành phần Trắng Chuẩn Thử Thuốc thử (µl) 600 600 600 Nƣớc khử khống (µl) 60 Huyết chuẩn (µl) Huyết tƣơng mẫu thử (µl) 60 60 Trộn hỗn hợp thuốc thử mẫu thử, ủ vòng 50 giây, sau đo quang bƣớc sóng 340 nm, nhiệt độ 37 oC Ghi nhận thay đổi mật độ quang phút vịng 159 giây Hoạt tính enzym ALT đƣợc tính theo cơng thức: Hoạt tính ALT/AST (U/L) = xn Với nALT = 36 nAST = 38 Trong đó: OD thay đổi mật độ quang trung bình phút mẫu trắng / chuẩn / thử 3.2.2.3 Đo MDA gan Mổ nhanh lấy gan chuột sau đ lấy máu tim Sau rửa dung dịch NaCl 0,9 % lạnh, thấm khô gan giấy lọc, cân gan ghi nhận khối lƣợng Gan đƣợc nghiền đồng thể dung dịch KCl 1,15 % theo tỉ lệ g mô tƣơi 10 ml KCl nhiệt độ 0-4 oC Lấy ml dịch đồng thể, thêm ml đệm Tris-HCl 25 mM.Ủ hỗn hợp 37 oC 60 phút Thêm ml acid tricloroacetic (TCA) 10 % Ly tâm lạnh 0-4 oC 15 phút, tốc độ 9600 vòng/phút (dịch đƣợc bảo quản lạnh nƣớc đá để định lƣợng MDA bảo quản -80 oC để sử dụng sau đó) Lấy ml dịch trong, thêm ml acid thiobarbituric (TBA) 0,8 %, quấn chặt giấy parafin Đun cách thủy hỗn hợp phản ứng 100oC 15 phút Để nguội, đo quang bƣớc sóng 532 nm Hàm lƣợng MDA ml dịch đồng thể đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA Xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn: Pha dung dịch MDA chuẩn có nồng độ từ 0,275 nmol/ml đến 27,324 nmol/ml Thực phản ứng tƣơng tự mẫu thử Dựa vào độ hấp thu giai mẫu chuẩn, suy phƣơng trình hồi quy tuyến tính độ hấp thu nồng độ suy hàm lƣợng MDA có mẫu 3.2.2.4 Đo GSH gan Mổ nhanh lấy gan chuột sau đ lấy máu tim Sau rửa dung dịch NaCl 0,9 % lạnh, thấm khô gan giấy lọc, cân gan ghi nhận khối lƣợng Gan đƣợc nghiền đồng thể dung dịch KCl 1,15 % theo tỉ lệ g mô tƣơi 10 ml KCl nhiệt độ 0-4 oC Lấy ml dịch đồng thể, thêm ml đệm Tris-HCl 25 mM Ủ hỗn hợp 37 oC 60 phút Thêm ml acid tricloroacetic (TCA) 10 % Ly tâm lạnh 0-4 oC 15 phút, tốc độ 9600 vòng/phút (dịch đƣợc bảo quản lạnh nƣớc đá để định lƣợng GSH bảo quản -80 oC để sử dụng sau đó) Lấy ml dịch trong, thêm vào 1,8 ml đệm EDTA phosphate pH 7,4 0,2 ml thuốc thử Ellman mM Lắc kỹ, để yên nhiệt độ phòng phút, đo quang bƣớc sóng 412 nm Hàm lƣợng GSH (nmol/ml dịch đồng thể) đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn GSH Xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn: Pha dung dịch GSH chuẩn có nồng độ từ 6,25 nmol/ml đến 500 nmol/ml Thực phản ứng tƣơng tự mẫu thử Dựa vào độ hấp thu giai mẫu chuẩn, viết phƣơng trình hồi quy tuyến tính độ hấp thu nồng độ suy hàm lƣợng GSH có mẫu 3.2.2.5 Phân tích kết xử lý số liệu thống kê Kết đƣợc xử lý phần mềm Microsoft Excel, trình bày dƣới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình (Mean ± SEM) đƣợc đánh giá ý nghĩa thống kê với phần mềm SPSS 20 phép kiểm t-test Mann-Whitney Sự khác biệt có ý nghĩa p < 0,05 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CHỐNG OXY HĨA IN VITRO Phƣơng trình đa thức bậc ngoại suy từ đƣờng biễu diễn mối liên quan nồng độ cao Vả hay acid ascorbic hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả đánh bắt gốc tự DPPH giá trị IC50 tính tốn đƣợc đƣợc trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Phƣơng trình tuyến tính giá trị IC50 cao trà Vả acid ascorbic Cao cồn 90% Phƣơng trình tuyến tính IC50 (μg/mL) y = 0,0242x2 + 4,8835x – 0,4302 304,2448 R² = 0,9978 Cao cồn 70% y = 0,0377x2 + 3,0464x – 4,3641 242,2059 R² = 0,9982 Cao cồn 45% y = 0,049x2 + 3,0194x + 7,6496 281,1196 R² = 0,9984 Acid ascorbic y = 0,0014x2 + 0,0393x + 0,4118 5,8768 R² = 0,9975 Nhƣ vậy, cao trà Vả khảo sát, cao cồn 70% có giá trị IC50 thấp Điều chứng tỏ hoạt tính đánh bắt gốc tự DPPH cao mạnh nhất, tƣơng ứng với hoạt tính chống oxy hóa in vitro mạnh Do đó, chúng tơi đ tiếp tục khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo cao 4.2 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN IN VIVO 4.2.1 Nồng độ ALT AST Nồng độ enzym gan ALT, AST (U/L) đƣợc trình bày bảng 4.2 Chỉ số ALT, AST lô bệnh cao đáng kể so với lô sinh lý (P < 0,01); cụ thể số ALT cao gấp 57,16 lần; số AST gấp 20,16 lần; chứng tỏ tác nhân gây bệnh CCl4 thử nghiệm đ gây tổn thƣơng tế bào gan nghiêm trọng Điều trị dự phòng 14 ngày với sylimarin trƣớc tiêm CCl4 đ làm giảm đáng kể lƣợng ALT AST lô đối chứng Chỉ số ALT AST giảm lần lƣợt 69,24% 64,04% so với lô chứng bệnh với P lần lƣợt 0,00058 0,035 Tƣơng tự, điều trị dự phòng cao trà Vả làm giảm 55,17% lƣợng ALT khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh (P = 0,00079) Lƣợng AST giảm 39,96% so với lô bệnh nhƣng chƣa khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh (P = 0,14) Tuy nhiên, số AST ALT lô cao trà Vả lại không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ đối chứng uống silymarin Bảng 4.2 Nồng độ ALT AST lô chuột thử nghiệm ALT (U/L) AST (U/L) Trà Vả 1776,14 ± 276,50 (***) 906,99± 178,93 Đối chứng 1218,65± 154,82 (***) 543,07± 140,76 (*) Chứng bệnh 3961,60±435,68 1510,66 ±353,56 Sinh lý 69,31± 7,04 74,93 ± 10,86 Nhƣ vậy, mẫu thử cao trà Vả có tác động bảo vệ tế bào gan, ngăn ngừa phần tác động gây tổn thƣơng gan cấp tính CCl4 Tuy nhiên tình trạng tổn thƣơng gan nặng nên mức ALT, AST chuột lô cao trà Vả nhƣ lô đối chứng chƣa thể trở mức bình thƣờng nhƣ lơ sinh lý 4.2.2 Nồng độ MDA VÀ GSH Hàm lƣợng MDA GSH (nmol/g) đƣợc trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Hàm lƣợng MDA GSH (nmol/g) lô chuột thử nghiệm MDA (U/L) GSH (U/L) Trà Vả 19,97 ± 2,91 55,59± 13,92 Đối chứng 23,25± 4,93 62,93± 16,90 Chứng bệnh 22,78 ± 4,67 26,78 ± 5,73 Sinh lý 14,14± 2,04 58,44 ± 5,01 Với liều CCl4 thí nghiệm đ gây tổn thƣơng oxy hóa tế bào gan nghiêm trọng làm tăng đáng kể lƣợng MDA giảm lƣợng GSH lô bệnh Thật vậy, hàm lƣợng MDA tăng gấp 1,6 lần GSH giảm 2,2 lần so với lô sinh lý Việc điều trị dự phòng với thuốc đối chứng sylimarin chƣa làm giảm lƣợng MDA nhƣng lại làm gia tăng đáng kể lƣợng GSH so với lô bệnh Mẫu thử cao trà Vả có giảm lƣợng MDA nhƣng chƣa khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ bệnh Bên cạnh đó, cao trà Vả làm gia tăng đáng kể lƣợng GSH (tăng gấp 2,08 lần so với lô bệnh) đạt giá trị gần so với lơ sinh lý 4.3 BÀN LUẬN Q trình oxy hóa thể đến từ nhiều nguyên nhân hậu q trình gây tổn thƣơng nhiều cấu trúc tế bào nhƣ màng, lipid, protein, lipoprotein DNA Trong đó, q trình oxy hóa đƣợc biết đến với mối liên hệ với bệnh nhƣ ung thƣ, bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, hô hấp Trong cao cồn khảo sát, cao cồn ethanol 70% dung mơi có khả chiết tối ƣu với hiệu suất chiết cao (10,9%) thể hoạt tính chống oxy hóa in vitro mạnh Do đó, chúng tơi đ chọn cao để khảo sát tác động chống oxy hóa in vivo thơng qua khả bảo vệ gan chống lại stress oxy hóa gây CCl4 Khả gây độc gan CCl4 chuyển hóa CCl4 tạo sản phẩm gốc tự nhƣ CCl3•, Cl3COO• gây tổn thƣơng tế bào gan ALT, AST hai men gan tế bào gan tạo ra, thƣờng có nồng độ cố định máu ALT có chủ yếu tế bào gan AST cịn có tim, hồng cầu Do đó, tăng ALT đặc hiệu cho tổn thƣơng gan [4], [7], [11], [41] Kết thử nghiệm cho thấy CCl4 gây tổn thƣơng tế bào gan đáng kể với số ALT tăng nhiều so với AST Nồng độ men gan tăng cao chứng tỏ tế bào gan đ bị tổn thƣơng nghiêm trọng, làm phá vỡ màng tế bào gan làm tăng tính thấm men qua màng tế bào, dẫn đến tăng nồng độ chúng máu Thông qua khả làm giảm nồng độ ALT, AST so với lô gây bệnh dùng dự phòng 14 ngày trƣớc tiêm CCl4, thuốc đối chứng sylimarin mẫu thử cao Vả đ thể tác động bảo vệ gan Tuy nhiên, mức độ tổn thƣơng nặng nên số ALT AST lô cịn cao so với lơ sinh lý Ngồi ra, chuyển hóa CCl4 hình thành gốc tự nên hệ thống phòng vệ thể s ngăn chặn nhờ chất chống oxy hóa nội sinh mà điển hình GSH GSH tham gia trực tiếp vào phản ứng trung hòa gốc tự phức hợp oxy hóa nhƣ trì trạng thái khử chất chống oxy hóa khác Do đó, dùng CCl4 liều thích hợp s làm gia tăng gốc tự do, từ làm suy giảm đáng kể lƣợng GSH thể Bên cạnh đó, điều kiện có oxy, gốc tự s tạo thành peroxyd gây peroxyd hóa lipid, có MDA - sản phẩm cuối peroxyd hóa lipid Hàm lƣợng MDA tế bào cao chứng tỏ gan bị tổn thƣơng nặng Trong thí nghiệm này, việc tăng hàm lƣợng MDA gan lô bệnh sau tiêm CCl4 chứng minh CCl4 có khả gây độc, peroxyd hóa tế bào gan Điều trị dự phòng với cao trà Vả làm giảm mức MDA tăng lƣợng GSH tƣơng đƣơng với thuốc đối chứng silymarin Tuy nhiên, giá trị MDA GSH lơ chƣa khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh mức độ tổn thƣơng tế bào gan nặng Nhƣ vậy, kết thí nghiệm bƣớc đầu cho thấy cao Vả có tác dụng chống oxy hóa ngăn ngừa phần tổn thƣơng gan gây CCl4 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN SAu trình thực đề tài, đ thu đƣợc số kết sau: Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết toàn phần từ vả với độ cồn khác nhau, đó, cao cồn 70% thể tác động chống oxy hóa rõ Thử nghiệm in vivo khảo sát tác dụng bảo vệ gan cao cồn trà liều 250 mg/kg, uống lần/ngày, cao Vả làm giảm đáng kể lƣợng ALT tăng hàm lƣợng GSH có tác dụng ngăn ngừa phần tổn thƣơng gan 5.2 ĐỀ NGHỊ Chúng xin đƣợc đề đề xuất số nội dung sau: Tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu cao chiết nhằm đƣa vào sử dụng sau Tiến hành thử nghiệm với nhiều liều sử dụng cao trà Vả khác để tối ƣu hóa liều, làm sở cho xây dựng liều dùng ngƣời Tiến hành mô hình gây tổn thƣơng gan cấp mạn tác nhân khác để đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao trà Vả TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học Hà Nội, tr PL182, PL 183 Đỗ Huy Bích cs (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập III, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 1134-1135 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập I, NXB Khoa học Kỹthuật Hà Nội, tr 1155-1173 Ngô Kiến Đức (2004), “Khảo sát tác động bảo vệ gan cao Linh Chi (Ganoderma lucidum) mơ hình gây tổn thƣơng gan cấp tính m n tính”, Luận văn Thạc sĩ Dược học, ĐH Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh Huỳnh Anh Duy (2014), “Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa từ Gừa Folium Fici microcarpa”, Luận văn thạc sĩ dược học, ĐH YD TP HCM Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ (2009), “Stress oxi hóa chất oxy hóa tự nhiên”, Tạp chí khoa học phát triển, tập 7(5), trang 667-677 Nguyễn Thị Thu Hƣơng cs (Viện Dƣợc Liệu, 2012), “Nghiên cứu tác dụng tăng cƣờng miễn dịch, chống oxy hóa khả kháng phân bào thực nghiệm nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) Linh chi vàng (Ganodermacolossum)”, Đề tài NCKH cấp Sở KH-CN TP.HCM, tr 45 Nguyễn Linh Nhâm (2015), "Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế α-glucosidase số loài thuộc họ dâu tằm (Moraceae)", Luận văn thạc sĩ dược học, Đại Học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh Trần Thanh Nh n (2008), Hóa sinh học, Nhà xuất Y học - Hà Nội, tr.117 – 134 10 Đoàn Thị Nhu, Đỗ Trung Đàm, Phạm Duy Mai, Nguyễn Thƣợng Dong, Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2006), Phương pháp nghiên cứu tác động dược lý thuốc từ dược thảo, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, tr 174-175, 279-294 11 Nguyễn Bảo Trân , “Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan chùm ngây”, Luận văn Thạc sĩ Dược học, ĐH Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Văn Tuyến cs (2005), “Sàng lọc khả chống sốt rét gây độc tế bào số loài sung (Ficus) thuộc họ Dâu tằm (Moraceae) Việt Nam, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 6, tr 34 – 38 13 Viện dƣợc liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học kỹ thuật Tài liệu tiếng nƣớc 14 Agarwal, A Saleh, R Bedaiwy and M A (2003), “Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction”, Fertil Steril, 79, pp 829843 15 Lien Ai Pham-Huy, Hua He, Chuong Pham-Huy (2008), “Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health”, International Journal Biomedical Science, vol 4(2), pp 89-96 16 Changwei Ao et al (2009), “Evaluation of antioxidant and antibacterial activities of Ficus microcarpa L fil Extract”, Food Control, 19, pp 940-948 17 Barry H (2001), “Free Radicals and Other reactive species in Disease”, Encyclopedia of Life science 18 Barry Halliwell and Susanna Chirico (1993), “Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance”, The American Journal of Clinical Nutrition, 57(5, suppl.), pp 715S-725S 19 Dobkin B H (2004), "Strategies for stroke rehabilitation", Lancet Neurol (9),pp.528-536 20 El-Fishawy A et al (2011), “Phytochemical and pharmacological studies of Ficus auriculata Lour”, Journal of natural products, 4, pp.184-195 21 Etsuo Niki (2010), “Assessment of Antioxidant Capacity in vitro and in vivo”, Free Radical Biology & Medicine, vol 49, pp 503–515 22 Francesca Rovetta Caterina Morabito, Mariano Bizzarri, Giovanna Mazzoleni, and Maria A Mariggiò Giorgio Fanò (2010), “ Modulation of redox status and calcium handling by extremely low frequency electromagnetic fields in C2C12 muscle cells: A real-time, single-cell approach”, Free Radical Biology and Medicine, 48, pp 579-589 23 Gaire B P et al (2011), “Phytochemical screening and analysis of antibacterial and antioxidant activity of Ficus auriculata (Lour.) stem bark”, Pharmacognosy Journal, 3(21), pp 49-55 24 Harleen K S et al (2011), “A Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids”, Internationale Pharmaceutica Sciencia, vol 1(1) 25 K K L T (2012), "Edible Medicinal And Non Medicinal Plants", Springer Netherland Volume 3, pp 358-359 26 Keiki Ogino, Da-Hong Wang (2007), “Biomarkers of oxidative/ nitrosative stress: an approach to disease prevention”, Acta Medica Okayama, 61 (4), pp 181189 27 Kelly E H., Anthony R T., Dennis J B (2002), “Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships”, The Journal of Nutritional Biochemistry, vol 13(10), pp 572-584 28 Kulisic T et al (2004), “Use of different methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil”, Food Chem, vol 85, pp 633–640 29 Lengsfeld (2004), “Glycosylated compounds from orka inhibit adhesion of Helicobacter Pylori to human gastro mucosa”, Journal of agricultural & food chemistry, 52(6), pp 1485-1503 30 Ndhlala, A R., Moyo, M., et al (2010) Natural antioxidants: fascinating or mythical biomolecules?, Molecules, 15(10), pp 6905-6930 31 Niki, E (2010) Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo Free Radical Biology and Medicine, 49(4), 503-515 32] Perez G (2001), “Anti- inflammatory activity of compounds isolated from plants”, The Scientific World Journal, 1, pp 713-784 33 Randall J Ruch, Michael A Pereira, Peter J Goldblatt (1986), “Mechanisms of Chloroform and Carbon Tetracloride Toxicity in Primary Culture Mouse Hepatocytes”, Enviroment Health Perspectives, 69, pp 301-305 34 Raymond F Burk, James M Lane and Kuldeep Patel (1984), “Relationship of Oxygen and Glutathione in Protection against Carbon Tetrachloride induced Hepatic Microsomal Lipid Peroxidation and Covalent Bindingin the Rat Rationale for the Use of Hyperbaric Oxygen to treat Carbon tetrachloride Ingestion”, The American Society for Clinical Investigation, pp 1996 35 Shao T.-M et al (2014), “Lactones from Ficus auriculata and their effects on the proliferation function of primary mouse osteoblasts in vitro”, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 24(160), pp 3952-3955 36 Takhtajan A (2009), Flowering Plants, Springer Science And Buisness Media, pp xl 281 37 Thingbaijam R et al (2013), “Antihyperglycemic and antihyperlipidemic activity of Ficus auriculata Lour Leaf extract in streptozotocin induced diabetic mice”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1), pp 412 427 38 Tietze F (1969), “Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidazed glutathione: applications to mammalian blood and other tissues”, Analytical Biochemistry, 27, pp 502-522 39 Marian Valko, Dieter Leibfritz, Jan Moncol, Mark T.D Cronin, Milan Mazur, Zoshua Telser (2007), “Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39, pp 44-84 40 Vearasilp S., Thobunluepop V (2015), "Radio Frequency Heating on Lipid Peroxidation, Decreasing Oxidative Stress and Aflatoxin B1 Reduction in Perilla frutescens L Highland Oil Seed", Agriculture and Agricultural Science Procedia 5, pp.177-183 [41] Kyung Jin Lee (2004) ''Protective Effect of Acteoside on Carbon Tetrachlorid Induced hepatotoxicity'', Life sciences,74, pp 1051-1064 ... (3R,4R)-4-hydroxy-de-O-methyllasiodiplodin( 9), 6-oxolasiodiplodin (1 0), ficusines A-C (11-1 3), (R)-(+)lasiodiplodin (1 4), ( +)- (R)-de-O-methyllasiodiplodin (1 5), (3R,6S)-6-hydrolasiodiplodin (1 6). .. hóa in vitro cao chiết toàn phần từ vả với độ cồn khác nhau, đó, cao cồn 70% thể tác động chống oxy hóa rõ Thử nghiệm in vivo khảo sát tác dụng bảo vệ gan cao cồn trà liều 250 mg/kg, uống l? ??n/ngày,... chống oxy hóa in vitro mạnh Do đó, chúng tơi đ chọn cao để khảo sát tác động chống oxy hóa in vivo thơng qua khả bảo vệ gan chống l? ??i stress oxy hóa gây CCl4 Khả gây độc gan CCl4 chuyển hóa CCl4