Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (lindera myrrha)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HỐ VÀ ỨC CHẾ Q TRÌNH TỔNG HỢP HẮC TỐ Ở LỒI Ơ DƯỢC (Lindera myrrha) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG ThS LÊ QUỲNH LOAN Sinh viên thực MSSV: 1311100730 : VÕ THỊ THUẬN Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp CAM ĐOAN Người thực đề tài xin cam đoan đề tài cơng trình nghiên cứu riêng người thực đề tài hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoàng Dũng Ths Lê Quỳnh Loan Các số liệu, kết luận án trung thực Mọi tài liệu tham khảo dùng đề tài trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên cơng trình, thời gian, địa điểm công bố Tất nội dung, chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, người thực đề tài xin chịu hồn tồn trách nhiệm TP Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng năm 2017 Sinh viên thực Võ Thị Thuận i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm môn Công nghệ sinh học thầy, cô môn Công nghệ sinh học trường Đại học Công Nghệ TP.HCM tận tình truyền đạt kiến thức quý báu kĩ để em hoàn thành tốt q trình học tập, hồn thành khóa luận làm tảng chuẩn bị cho công việc sau Trong suốt khoảng thời gian làm đề tài tốt nghiệp phòng Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: TS Hồng Quốc Khánh, trưởng phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo cho em làm đề tài TS Nguyễn Hoàng Dũng gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chi tiết cơng việc, theo sát dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt q trình làm khóa luận ThS Lê Quỳnh Loan hướng dẫn tận tình, giúp đỡ hỗ trợ em suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Thầy Ngô Đức Duy tạo điều kiện, hỗ trợ em làm đề tài tốt nghiệp Em xin chân thàh cám ơn Nguyễn Hồi Hương, phòng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ TP HCM tận tình giúp đỡ em trình nhận đề tài Cám ơn tập thể lớp 13DSH02 em trao đổi, học tập suốt bốn năm trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, cám ơn tập thể phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới động viên hết lòng giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Cuối cùng, gửi lời cám ơn sâu sắc đến Ba Mẹ sinh nuôi dạy con, cám ơn anh chị gia đình ln bên cạnh động viên em suốt trình học tập trưởng thành ii Đồ án tốt nghiệp Vì kiến thức thân hạn chế, q trình nghiên cứu, hồn thiện đề tài em khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ phía q Thầy Cơ Tp Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng năm 2017 Sinh viên thực Võ Thị Thuận iii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề…………………………………………………………………1 Tình hình nghiên cứu…………………………………………………… đích Mục nghiên cứu…………………………………………………… Nhiệm vụ nghiên cứu…………………………………………………… Phương pháp nghiên đạt cứu………………………………………………….4 Kết được………………………………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài………………………………….5 Kết Đồ cấu án tốt nghiệp……………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chi Lindera (Họ Lauraceae) iv Đồ án tốt nghiệp 1.1.1 Chi Lindera (Họ Lauraceae) 1.1.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 1.2 Tổng quan ô dƣợc 1.2.1 Phân loại khoa học 1.2.2 Đặc điểm thực vật 10 1.2.3 Thành phần hoá học 12 1.2.4 Công dụng theo y học dân gian .12 1.3 Tổng quan trình tổng hợp sắc tố da 12 1.3.1 Ảnh hưởng tia cực tím (UV) người 12 1.3.2 Melanin 14 1.3.3 Vai trò melanin .15 1.3.4 Phân loại melanin 16 1.3.5 Con đường tổng hợp hoá học melanin 17 1.3.6 Các lại bênh liên quan đến sắc tố 19 1.3.7 Một số hoạt chất ức chế trình tổng hợp melanin 22 1.4 Tổng quan chiết xuất dƣợc liệu 27 1.4.1 Chiết xuất dược liệu 27 1.4.2 Phương pháp chiết xuất 29 1.4.3 Phương pháp Soxhlet 31 1.5 Hoạt tính kháng oxy hoá 31 1.5.1 Khái niệm gốc tự 31 1.5.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá .33 1.6 Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 37 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .39 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 39 2.2 Vật liệu nghiên cứu 39 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 39 2.2.2 Dụng cụ - Thiết bị 39 2.2.3 Hoá chất 39 v Đồ án tốt nghiệp 2.3 Quy trình thực 40 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.4.1 Phương pháp thu xử lý mẫu .41 2.4.2 Quy trình chiết thu nhận cao chiết 41 2.4.3 Phương pháp xác định thành phần hoá học 43 2.4.4 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự (DPPH assay) 47 2.4.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) .49 2.4.6 Phương pháp xác định độc tính .49 2.4.7 Phương pháp xác định hàm lượng melanin 49 2.4.8 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 50 2.4.9 Xử lý số liệu 51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc 52 3.2 Định tính thành phần cao tổng methanol dƣợc .53 3.3 Kết hoạt tính kháng oxy hố cao tổng methanol dƣợc ………………………………………………………………………… 54 3.4 Khảo sát tác dụng ô dƣợc lên độc tính tế bào u sắc tố B16F10……………………………………………………………………… 56 3.5 Khảo sát tác dụng ô dƣợc lên trình tổng hợp melanin 57 3.6 Kết chiết thu nhận cao phân đoạn 58 3.7 Kết định tính thành phần hố học cao phân đoạn .59 3.8 Kết hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết phân đoạn .61 3.9 Khảo sát tác dụng phân đoạn cao lên độc tính ức chế melanin tế bào u sắc tố B16F10 63 3.10 Kết xác định thành phần hoá học phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1 Kết luận 67 4.2 Đề nghị 68 vi Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DHI 5,6-dihydroxyindole DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DMSO Dimethyl sulfoxide DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IC50 Half maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ chất mà ức chế 50% gốc tự do, tế bào enzyme) MTT 3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide PIH Post-inflammatory hyperpigmentation TRP-1 DHICA oxidation TRP-2 DOPA chrome tautomerase vii Đồ án tốt nghiệp UV Ultraviolet (Tia cực tím) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Dung mơi khác dung chiết xuất nhóm hoạt chất dược liệu .28 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu cao tổng methanol ô dược 53 Bảng 3.2 Kết xác định thành phần hố học mẫu cao phân đoạn dược 59 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh số lồi thuộc chi Lindera Hình 1.2 Một số hợp chất Sesquiterpenoids xác định chi Lindera Hình 1.3 Một số hợp chất alkaloids xác định chi Lindera .9 Hình 1.4 Cây ô dược .11 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử melanin (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) .14 Hình 1.6 Cấu tạo da 14 Hình 1.7 Cơng thức hố học loại melanin 17 Hình 1.8 Hai nhóm melanin 17 Hình 1.9 Sơ đồ đường tổng hợp melanin 18 Hình 1.10 Các bệnh da tăng sắc tố 20 Hình 1.11 Các bệnh giảm sắc tố 21 Hình 1.12 Hydroquinone 23 Hình 1.13 Niacinamide (Vitamin B3) 23 Hình 1.14 Arbutin (4-Hydroxyphenyl-α-D-glucopyranoside) .24 Hình 1.15 Azelaic acid 25 Hình 1.16 Kojic acid .26 Hình 1.17 Vitamin C 26 Hình 1.18 Một số hợp chất ức chế trình tổng hợp melanin .27 ix Đồ án tốt nghiệp Corrected for the mean of the observations: DF SS MS Regression 3525.3231 Residual 2.2398 Total 3527.5629 587.9272 F 1175.1077 0.7466 P 1573.9533 Statistical Tests: PRESS 71.2012 Durbin-Watson Statistic 3.0505 Failed Normality Test Passed (P = 0.6450) K-S Statistic = 0.2634 Significance Level = 0.6450 Constant Variance Test Passed (P = 0.0956) Power of performed test with alpha = 0.0500: 1.0000 Regression Diagnostics: Row Std Res Stud Res -0.0454 -0.6453 0.1677 0.6009 -0.0645 -0.0977 -0.7969 -0.9753 1.4398 1.7228 -0.4280 -0.5707 -0.2727 -0.3670 Stud Del Res -0.5677 0.5231 -0.0799 -0.9636 13.6059< -0.4936 -0.3066 Influence Diagnostics: Row Cook's Dist Leverage 20.9500< 0.9951 1.0679 0.9221 0.0031 0.5636 0.1184 0.3323 0.3203 0.3015 0.0634 0.4376 0.0273 0.4479 DFFITS -8.0542 1.7992 -0.0908 -0.6798 8.9396< -0.4353 -0.2762 95% Confidence: Row Predicted 95% Conf-L 83.8854 81.1424 66.3294 63.6889 48.0686 46.0042 34.7911 33.2059 26.7688 25.2588 22.3570 20.5381 20.0433 18.2031 95% Conf-U 86.6284 68.9699 50.1329 36.3764 28.2787 24.1760 21.8836 95% Pred-L 80.0014 62.5171 44.6301 31.6171 23.6316 19.0600 16.7346 95% Pred-U 87.7694 70.1417 51.5070 37.9651 29.9059 25.6540 23.3521