Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của nấm linh chi báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

BỘ CÔNG THƢƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA NẤM LINH CHI Mã số đề tài: 171.4290 Chủ nhiệm đề tài: Dƣơng Duy Phƣơng Giáo viên hƣớng dẫn: Lâm Khắc Kỷ Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài này, chúng em xin chân thành cảm ơn BGH Trƣờng Đại học Công nghiệp TP.HCM tạo điều kiện hỗ trợ kinh phí cho đề tài Chúng em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đàm Sao Mai, Viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm nhiệt tình hỗ trợ tạo điều kiện tối đa trình đăng ký thực đề tài Chúng em xin cảm ơn đến thầy Lâm Khắc Kỷ tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu để chúng em thực tốt đề tài Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn tất quý thầy cô tham gia giảng dạy Viện Công nghệ Sinh học thực phẩm- môn Công nghệ Sinh học giúp chúng em trau dồi kiến thức trình học tập trƣờng PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết từ nấm Linh chi 1.2 Mã số: 171.4290 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Họ tên Đơn vị công tác TT Vai trò thực đề tài (học hàm, học vị) Dƣơng Duy Phƣơng Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài Lê Trần Phúc Thảo Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm Thƣ ký Nguyễn Thị Quý Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm Thành viên Nguyễn Thị Kim Trang Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực 1.5.1 Theo hợp đồng: Từ tháng năm 2017 đến tháng 10 năm 2017 1.5.2 Gia hạn (nếu có): Khơng có 1.5.3 Thực thực tế: Từ tháng năm 2017 đến tháng 10 năm 2017 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý.) 1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: triệu đồng II Kết nghiên cứu 2.1 Đặt vấn đề Nấm dƣợc liệu tên gọi chung loại nấm có cơng dụng làm thuốc chữa bệnh, nghiên cứu y học Nấm dƣợc liệu bao gồm loại nấm ăn đƣợc loại không ăn đƣợc.Nhiều loại nấm dƣợc liệu nhƣ Chaga, Hầu Thủ, Linh chi, Thƣợng Hồng, Đơng trùng hạ thảo… đƣợc sử dụng y học Trung Quốc từ hàng ngàn năm trƣớc nhằm ngăn ngừa ung thƣ rối loạn căng thẳng sau chấn thƣơng.Tất loại nấm dƣợc liệu giúp "bình thƣờng hố" ảnh hƣởng tiêu cực stress lên thể, giúp đối phó, đáp ứng thích ứng với stress tốt Cùng với tình trạng nhiều bệnh ung thƣ, bệnh xơ vữa động mạch tim gốc tự gây nguyên nhân thúc đẩy nghiên cứu khả kháng oxy hóa loại dƣợc liệu ngày để phục vụ y tế phòng ngừa, điều trị phục hồi ngƣời Chính lợi ích chung nhu cầu thiết yếu sức khỏe cộng đồng, định lựa chọn nấm dƣợc liệu Linh chi đỏ để nghiên cứu khả kháng oxy hóa invitro từ cao chiết nấm 2.2 Mục tiêu  Mục tiêu tổng quát Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro cao tổng cao phân đoạn thể nấm Linh chi, từ xác định cao có hoạt tính oxy hóa cao để nghiên cứu sâu hoạt chất mô hình in vivo  Mục tiêu cụ thể Khảo sát mơ hình thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa in vitro để chọn mơ hình ổn định phù hợp với điều kiện chỗ, Áp dụng mơ hình thử nghiệm kháng oxy hóa in vitro cao chiết cao phân đoạn từ nấm Linh chi đƣợc trồng Việt Nam 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Nguyên liệu nghiên cứu Nấm Linh Chỉ đỏ (Ganoderma lucidum) có nguồn gốc Nhật Bản đƣợc ni trồng Việt Nam đƣợc cung cấp công ty Linh Chi VINA Dƣợc liệu đƣợc xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát 2.3.2 Thu nhận cao tổng cao phân đoạn nấm Linh chi Thu nhận kế thừa cao tổng cao phân đoạn nấm Linh chi từ đề tài “NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ NẤM DƢỢC LIỆU QUÝ” ThS Lâm Khắc Kỷ để tiến hành khảo sát tính kháng oxy hóa vi vitro 2.3.4Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp bắt gốc tự in vitro Sau mơ hình thực nghiệm in vitro thƣờng đƣợc sử dụng để sàng lọc khảo sát kháng oxy hóa Các phƣơng pháp xác định khả oxy hóa  Phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH DPPH có khả tạo gốc tự bền dung dịch Methanol bão hòa Khi cho chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm làm trung hòa bao vây gốc tự làm giảm cƣờng độ hấp phụ ánh sáng gốc tự DPPH Hoạt tính đánh giá kháng oxy hóa đƣợc đánh giá thơng qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đo OD máy so màu bƣớc sóng 517nm  Phƣơng pháp bắt gốc tự ABTS•+ Khi cho hợp chất có tính oxy hóa cao tác dụng với dung dịch chứa ABTS•+, ABTS•+ bị khử trở thành dạng khơng màu ABTS –R+ Dựa vào khả này, ta xác định hoạt tính bắt gốc tự ABTS•+ hợp chất phân tích cách đánh giá thơng qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đo OD máy so màu bƣớc sóng 734nm 2.4 Tổng két kết nghiên cứu 2.4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phƣơng pháp DPPH Hoạt tính bắt gốc tự DPPH khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hiệu quả, nhanh chóng đơn giản Việc mẫu khảo sát có khả bắt gốc tự DPPH chứng tỏ mẫu có chứa hợp chất có khả nhƣờng hydrogen chuyển electron cho gốc tự cách trực tiếp, tạo thành sản phẩm ổn định hơn, có khả kết thúc phản ứng chuỗi điện tử tự [12] Các thí nghiệm khảo sát khả bắt gốc tự DPPH đƣợc thực với cao chiết khoảng nồng độ khảo sát từ 0-500 µg/ml cho kết khả bắt gốc tự phù hợp với nồng độ cao khác ( Phụ lục) Qua đồ thị mối tƣơng quan khả bắt gốc tự nồng độ dịch chiết cao cồn cao phân đoạn từ cao cồn Linh chi phƣơng pháp DPPH ( Phụ lục), ta có đồ thị so sánh giá trị IC50 cao cồn cao phân đoạn nhƣ đồ thị 4.1 Giá trị IC50(µg/ml) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 866.633 388.885 306.939 Giá trị IC50(µg/ml) 245.21 130.135 EtOH PE EtOAc n-BuOH Nƣớc Đồ thị 4.1 Giá trị IC50 (µg/ml) cao nấm Linh chi thử nghiệm DPPH Theo đồ thị 4.1 biểu diễn giá trị IC50 cao EtOH cao phân đoạn từ cao EtOH nấm Linh chi kết hợp với kết xử lý thống kê (Phụ lục) cho thấy cao EtOAc cao có chi số IC50 thấp nên loại cao có khả kháng oxy hóa mạnh loại cao, khả kháng oxy hóa loại cao có khác biệt mặt thống kê 2.4.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phƣơng pháp ABTS Hoạt tính bắt gốc tự ABTS khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hiệu quả, nhanh chóng đơn giản Việc mẫu khảo sát có khả bắt gốc tự ABTS chứng tỏ mẫu có chứa hợp chất có khả nhƣờng hydrogen chuyển electron cho gốc tự cách trực tiếp, tạo thành sản phẩm ổn định hơn, có khả kết thúc phản ứng chuỗi điện tử tự [12] Các thí nghiệm khảo sát khả bắt gốc tự ABTS đƣợc thực với cao chiết khoảng nồng độ khảo sát từ 0-2000 µg/ml cho kết khả bắt gốc tự phù hợp với nồng độ cao khác ( Phụ lục) Qua đồ thị mối tƣơng quan khả bắt gốc tự nồng độ dịch chiết cao cồn cao phân đoạn từ cao cồn Linh chi phƣơng pháp ABTS ( Phụ lục), ta có đồ thị so sánh giá trị IC50 cao cồn cao phân đoạn nhƣ đồ thị 4.2 Giá trị IC50(µg/ml) 7000 6534.545 6000 5000 4000 Giá trị IC50(µg/ml) 3000 2000 1516.194 1684.803 1531.472 n-BuOH Nước 922.87 1000 EtOH PE EtOAc Đồ thị 4.2 Giá trị IC50 (µg/ml) cao nấm Linh chi thử nghiệm ABTS Theo đồ thị 4.1 biểu diễn giá trị IC50 cao EtOH cao phân đoạn từ cao EtOH nấm Linh chi kết hợp với kết xử lý thống kê (Phụ lục) cho thấy cao EtOAc cao có chi số IC50 thấp nên loại cao có khả kháng oxy hóa mạnh loại cao, khả kháng oxy hóa loại cao có khác biệt mặt thống kê, riêng cao cồn cao nƣớc khơng có khác biệt mặt thống kê 2.5 Đánh giá kết đạ đƣợc kết luận Kết nghiên cứu xác định đƣợc khả kháng oxy hóa in vitro loại cao phân đoạn nấm Linh chi phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH ABTS Từ chọn đƣợc cao phân đoạn EtOAc có khả bắt gốc tự mạnh với giá trị IC50 lần lƣợt 130,135 µg/ml 922,870 µg/ml theo hai phƣơng pháp DPPH ABTS Đề tài nghiên cứu đáp ứng đƣợc yêu cầu ban đầu đề ra, bao gồm số liệu khả kháng oxy hóa cao phân đoạn chọn đƣợc cao phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa cao nấm Linh chi 2.6 Tóm tắt kết Nghiên cứu đánh giá so sánh khả kháng oxy hóa cao chiết từ nấm Linh chi Trong nghiên cứu này, cao cồn bốn loại cao phân đoạn ( PE, EtOAc, n-BuOH Nƣớc) đƣợc đánh giá khả kháng oxy hóa chúng phƣơng pháp 2,2- Diphenyl1- Picrylhydrazyl (DPPH) 2,2- azino-bis (3- ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid) (ABTS) Theo phân tích hồi quy tuyến tính xác định đƣợc giá trị IC50 loại cao chiết Kết cho thấy, cao phân đoạn EtOAc cho khả bắt gốc tự DPPH ABTS cao với giá trị lần lƣợt 130,135 µg/ml 922,870 µg/ml Từ kết trên, nghiên cứu lần khẳng định Linh chi nguồn dƣợc liệu có khả kháng oxy hóa tiềm y học  Tóm tắt tiếng Anh In this research, the antioxidant activity of extracts from Ganoderma lucidum was evaluated Particularly, different types of extracts including EtOH, PE, EtOAc, n-BuOH and Water were tested for their antioxidant activities by in vitro methods such as 2,2- Diphenyl-1Picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2- azino bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) scavenging activity Linear regression analysis was used to calculate IC50 value Results revealed that the EtOAc extract has a significant DPPH radical scavenging ability with highest IC50 value of 130,135 µg/ml Besides that, the EtOAc extract also showed the IC50 value of 922,870 µg/ml by using ABTS assay In conclusion, it is considered being a potential source of antioxidant herbal medicine III SẢN PHẨM ĐỀ TÀI, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO 3.1 Kết nghiên cứu ( sản phẩm dạng 1,2,3) Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu TT kinh tế - kỹ thuật Tên sản phẩm Đăng ký Đạt đƣợc Cao phân đoạn nấm Xác định đƣợc khả Xác định đƣợc khả Linh chi có hoạt tính kháng kháng oxy hóa kháng oxy hóa loại cao chọn đƣợc loại cao phân đoạn oxy hóa mạnh loại cao phân đoạn có chọn đƣợc cao EtOAc hoạt tính kháng oxy hóa loại cao có hoạt tính mạnh kháng oxy hóa mạnh 3.2 Kết đào tạo TT Họ tên Thời gian Tên đề tài thực đề tài Tên chuyên đề NCS Đã bảo vệ Tên luận văn Cao học Nghiên cứu sinh Học viên cao học Sinh viên Đại học IV TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ Kinh phí Kinh phí thực đƣợc T T Nội dung chi duyệt Ghi (triệu (triệu đồng) đồn g) A Chi phí trực tiếp Th khốn chun mơn 4.5 4.2 Ngun, nhiên vật liệu, Hóa chất DPPH ABTS Thiết bị, dụng cụ Cơng tác phí Dịch vụ thuê Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu kỳ In ấn, Văn phòng phẩm Chi phí khác B Chi phí gián tiếp Quản lý phí Chi phí điện, nƣớc Tổng số 0.8 ống nghiệm đầu tip 0.5 5 10 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2-azinobis ,3 ethylbenzothiazoline- axit 6-sulfonic DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IC50 The half maximal inhibitory concentration OD Optical Density ROS Reactive oxygen species EtOH Ethanol n-BuOH n-Butanol EtOAc Etyl acetate PE Petrolium ehter 14 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Tổng quan gốc tự dạng oxy hóa hoạt động Gốc tự nguyên tử hay phân tử mà lớp ngồi chứa ngun tử mang điện tích âm khơng có điện tích có khả phản ứng cao để tạo thành “bộ tám” electron Các gốc tự thƣờng bất ổn lƣợng nhƣ động học, thời gian tồn ngắn, hoạt tính mạnh, không ngừng công phân tử khác tạo phân tử mới, gốc gây phản ứng dây chuyền [1] Trong thể, gốc tự tồn chủ yếu dƣới dạng oxy hoạt động (ROS) Bên phân tử có chứa nguyên tử oxy bền nên dễ dàng phản ứng với đại phân tử khác nhƣ protein, lipid, DNA… gây rối loạn q trình sinh hóa thể Khi phân tử bị gốc tự công, điện tử trở thành gốc tự mới, lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác tạo thành chuỗi phản ứng thƣờng gọi phản ứng dây chuyền, gây biến đổi có tác hại thể, tác nhân chung Các dạng ROS thể sinh vật gồm: superoxide (O2• – ), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl (•OH), oxy đơn phân tử ( 1O2), gốc alkoxyl (RO•) peroxyl (ROO•)… gây nhiều bệnh nhƣ: ung thƣ, bệnh xơ vữa động mạch tim…[2] Trong thể tồn cân dạng oxy hóa hoạt động dạng chống oxy hóa Đó trạng thái cân nội môi (homeostasis) Do ảnh hƣởng nhiều yếu tố tác động từ bên hay bên thể, làm cho cân di chuyển theo hƣớng gia tăng oxy hoạt động Trạng thái sinh lý đƣợc gọi stress oxy hóa Hay nói cách khác stress oxy hóa rối loạn cân chất chống oxy hóa oxy hóa theo hƣớng tạo nhiều oxy hóa 1.2 Tổng quan chất kháng oxy hóa 1.2.1 Khái niệm Chất kháng oxy hóa chất có khả làm chậm, ngăn cản đảo ngƣợc q trình oxy hóa Và thể sử dụng chất kháng oxy hóa để giúp trung hịa, ngăn ngừa, giảm thiểu tác động gốc tự [5] Các chất kháng oxy hóa đƣợc cung cấp hai nguồn bên bên thể:  Bên trong: protein (ferritin, transferrin, albumin), enzyme kháng oxy hóa (SOD, GPx, CAT…)  Bên ngồi: hợp chất có khả bắt gốc tự nhƣ hợp chất phenol, polysaccharide, vitamin C, vitamin E, carotenoid6… 1.2.2 Cơ chế hoạt động chất kháng oxy hóa thể Các chất kháng oxy hóa tham gia vào chuỗi phản ứng oxy hóa hoạt động theo hai chế riêng biệt [6]:  Cơ chế 1: Phá vỡ chuỗi phản ứng oxy hóa thể cách kết hợp electron chúng với gốc tự đƣợc hình thành chuỗi phản ứng Hình 1.1 Cơ chế hoạt động chất kháng oxy hóa Nguồn: http://hoathucpham.saodo.edu.vn/uploads/news/2017_11/hong1.jpg  Cơ chế 2: Loại bỏ ROS việc ức chế chất khởi động cho chuỗi phản ứng oxy hóa 1.3 Tổng quan nấm dƣợc liệu Nấm dƣợc liệu tên gọi chung loại nấm có công dụng làm thuốc chữa bệnh, nghiên cứu y học Nấm dƣợc liệu bao gồm loại nấm ăn đƣợc loại không ăn đƣợc Nhiều loại nấm dƣợc liệu nhƣ Chaga, Hầu Thủ, Linh chi, Thƣợng Hồng, Đơng trùng hạ thảo… đƣợc sử dụng y học Trung Quốc từ hàng ngàn năm trƣớc nhằm ngăn ngừa ung thƣ rối loạn căng thẳng sau chấn thƣơng Tất loại nấm dƣợc liệu giúp "bình thƣờng hố" ảnh hƣởng tiêu cực stress lên thể, giúp đối phó, đáp ứng thích ứng với stress tốt [17] Chính lợi ích chung nhu cầu thiết yếu sức khỏe cộng đồng, định lựa chọn nấm dƣợc liệu Linh chi đỏ để nghiên cứu khả kháng oxy hóa invitro từ cao chiết nấm 1.3.1 Giới thiệu nấm Linh Chi ( Ganoderma lucidum) 1.3.1.1 Giới thiệu tổng quát  Phân loại Tên gọi: Nấm Linh chi, nấm Lim, nấm Trƣờng thọ,… Tên khoa học: Ganoderma lucidum Phân loại khoa học Giới: Nấm Ngành: Nấm đảm Lớp: Agaricomycetes Bộ: Polyporales Họ: Ganodermataceae (Nấm gỗ) Giống: Ganoderma Loài: Ganaderma lucidum Ở Châu Á tên nấm Linh chi có lịch sử 2.000 năm Tên Linh chi Trung Quốc lần đƣợc ghi lại triều đại Đông Hán (25-220 năm trƣớc Cơng ngun) Theo nghĩa bóng tiếng Hàn “Linh chi” tƣợng trƣng cho kết hợp tinh thầ n chất đƣợc xem “sức mạnh tinh thần”[17] Giống Ganoderma đƣợc tìm thấy khắp nơi giới với nhiều đặc điểm khác nhƣ hình dạng màu sắc (đỏ, đen, xanh dƣơng/xanh lá, trắng, vàng tím) thể, đặc trƣng ký chủ địa lý, yếu tố đƣợc sử dụng để xác định loại thuộc giống [17] Cho đến gần đây, giống nấm Linh chi đƣợc chia thành hai nhóm Nhóm nấm Linh chi có bề mặt mũ sáng bóng (Ganoderma lucidum) Nhóm nấm Linh chi có bề mặt mũ sần sùi (Ganoderma applanatum)  Phân bố Nấm Linh chi phân bố rộng rãi vùng rừng rậm nhiệt đới cận nhiệt đới Châu Á, Châu Phi Châu Mỹ Đƣợc khai thác lâu đời Trung Quốc, Việt Nam Ấn Độ Nấm Linh chi (Garnoderma lucidum) có hai hình thức phát triển, nấm khơng cuống đƣợc tìm thấy vùng ơn đới Bắc Mỹ hai nấm có cuống dài dẹp đƣợc tìm thấy vùng nhiệt đới Tuy nhiên mơi trƣờng, có dạng trung gian hai dạng nêu  Mô tả Nấm Linh chi đƣợc sử dụng rộng rãi y học cổ truyền Châu Á, chi nấm quan trọng kinh tế Đặc điểm để phân biệt nấm Linh chi với lồi khác mũ nấm có hai vách, bào tử màu đỏ tƣơi hình thành phía bên hai vách [17] Nấm Linh chi có tên khoa học Ganoderma, phát xuất từ tiếng Hy Lạp: “ganos”là “độ sáng, lấp lánh” “derma” “da”, có nghĩa lồi nấm có màu da sáng Nấm Linh chi có chung đặc điểm tai nấm hóa gỗ; mũ trịn xịe, bầu dục hình thận; có cuống ngắn dài hay khơng cuống, thƣờng đính bên, đơi trở thành dính tâm liền tán mà thành Cuống nấm thƣờng hình trụ, mảnh (cỡ 0,3-0,8cm đƣờng kính), mập khỏe (tới 2- 3,5 cm đƣờng kính) Lớp vỏ cuống láng đỏ- nâu đỏ- nâu đen, bóng, khơng có lơng, phủ suốt lên mặt tán nấm Mũ nấm dạng thận- gần trịn, đơi xịe hình quạt nhiều dị dạng đồng tâm có tỉa rảnh phóng xạ, màu sắc từ vàng chanh- vàng nghệ- vàng nâu- vàng cao- đỏ nâu- nâu tím, nhẵn bóng, láng nhƣ verni Khi già, sẫm màu lớp vỏ láng lớp phấn đỏ nâu bề mặt ngày nhiều dày Kích thƣớc tai nấm biến động lớn, từ 5-12 cm, dày 0,8- 3,3 cm Phần đính cuống gồ lên lõm nhƣ lõm rốn Mặt mũ có vân đồng tâm đƣợc phủ lớp sắc tố bóng láng Mặt dƣới phẳng, màu trắng vàng, có nhiều lỗ li ti, nơi hình thành phóng thích bào tử nấm Bào tử nấm dạng trứng cụt với hai lớp vỏ, hai lớp vỏ có nhiều gai nhọn nối từ [14] Linh chi loại nấm hoại sinh gỗ mục nát phát triển gỗ cứng kim Khuẩn ty sợi nấm trắng, có enzyme để phá vỡ thành phần gỗ nhƣ lignin cellulose [14] 1.3.1.2 Những nghiên cứu nấm Linh chi  Thành phần hóa học tác dụng dƣợc lý Linh chi Trong nấm Linh chi khơng có nhiều chất dinh dƣỡng cung cấp lƣợng nhƣ loài nấm ăn khác nhƣng có dƣợc liệu quý lồi nấm ăn khác có Hầu hết loại nấm, 90% khối lƣợng nƣớc, 10% lại bao gồm protein, chất béo, carbohydrate, chất xơ, tro, vài vitamin, muối khoáng nhƣ Kali, Canxi, Photpho, Magie, Sắt, Kẽm, Đồng vài yếu tố vi lƣợng khác [18] Trong nghiên cứu Mau, Lin Chen năm 2001 thành phần khơng bay G lucidum có 1,8% tro, 26-28% carbohydrate, 3-5% chất béo thô, 59% chất xơ thô, 7-8% protein thơ Ngồi ra, nấm có nhiều hoạt chất sinh học nhƣ terpenoids, steroids phenols, nucleotides, glycoproteins, polysaccharides dẫn xuất chúng Các nhóm hoạt chất gặp nhiều cấu trúc nấm Trong thể nang bào tử (Sporosphores, Sporocarps) bào tử đảm (Basidiospores) hệ sợi (Mycelia) nấm tự nhiên nấm trồng Nấm có nhiều amino acid thiết yếu đặc biệt leucine lysine Hàm lƣợng chất béo tổng số thấp tỷ lệ acid béo không bão hòa tƣơng đối cao so với tổng số acid béo nấm đƣợc coi đóng góp đáng kể cho giá trị dƣợc liệu nấm [18] [19] Bảng 1.1: Thành phần tác dụng chúng nấm Linh chi [14] Nhóm chất Chất Tác dụng Alcaloid Trợ tim Polysaccharid e Β-D-glucan Chống ung thƣ, tăng tính miễn dịch Ganoderan A, Hạ đƣờng huyết Tăng tổng hợp protein, tăng chuyển hóa B, C D-6 Steroid acid nucleic Ganodosteron Lanosporeric acid A Lanosterol Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp Cholesterol Ganodermic Ức chế giải phóng Histamin acid Mf, T-O Hạ đƣờng huyết, ức chế ACE Ganodermic acid R, S Chống khối u Ganoderic acid Bảo vệ gan B, D, F, H, K, S Y… Ganosporelact on A, B Lucidon A Lucidol Nucleosid giảm đau xuất Protein Ức chế kết dính tiểu cầu, thƣ giãn cơ, Adenosin dẫn Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa miễn Lingzhi-8 dịch Acid béo Oleic acid Ức chế giải phóng Histamin Trong số nhóm hoạt chất, nhóm có chất protein bật với Lingzhi-8 nhà khoa học Nhật Bản tìm [20]đƣợc chứng minh tác nhân chống dị ứng phổ rộng điều hòa miễn dịch hữu hiệu, đồng thời trì tạo kháng thể chống kháng nguyên viêm gan B Polysaccharides, peptidoglycans triterpenes ba thành phần có hoạt tính G.lucidum [21] [22] Tuy nhiên, hàm lƣợng thành phần khác nấm tự nhiên nấm trồng  Polysaccharides peptidoglycans Linh chi đƣợc biết đến với đa dạng cấu trúc polysaccharide có khối lƣợng phân tử cao mà chúng sản xuất polyglycan có hoạt chất sinh học đƣợc tìm thấy phận chúng Polysaccharides đại diện cho đại phân tử sinh học có cấu trúc đa dạng với tính chất hóa lý rộng [22] Các polysaccharide khác đƣợc chiết xuất từ thể, bào tử sợi nấm Linh chi Đặc biệt polysaccharide có G.lucidum (GL-PSs) đƣợc cho có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm phản ứng chống viêm, giảm đƣờng huyết, chống mệt mỏi, chống ung thƣ tăng tăng miễn dịch [23] [24] [25] [26] [27] He.Y cộng (1992) khảo cứu BN3B- gồm polysaccharides đồng có hoạt tính tăng miễn dịch Trong arabinogalactan mang liên kết glycoside [28] Hikino.H cộng (1085-1989) chứng minh hoạt lực hạ đƣờng huyết nhiều polysaccharides Đó heteroglycan có hoạt tính chống ung thu Đó Ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline huyết tƣơng, làm giảm sinh tổng hợp glycogen hàm lƣợng glycogen gan- sở điều trị liệu bệnh nhân đái tháo đƣờng [29] Các phức hợp polysaccharides- protein có hoạt tính chống khối u tăng miễn dịch đƣợc nghiên cứu từ lâu Byong kak Kim cộng tiến hành lai hệ sợi dung hợp Protoplast nấm Linh chi G.lucidum với lồi khác, chí với nấm hƣơng Lentinus edodes, nhờ tăng cƣờng hoạt tính chống khơ u sarcom 180 phức polysaccharidesprotein lên đáng kể Gần tác dụng tăng sinh lý tổng hợp IL-2 hoạt tính DNA polymerase chuột già tuổi polysaccharides chứng minh cho khả làm trẻ hóa, tăng tuổi thọ nấm Linh chi [30], [31] Loạt nghiên cứu polysaccharide không tan nƣớc tác giả Nhật Bản chứng tỏ hiệu lực chống khối u rõ, chí làm tan khối u vởi tỷ lệ ¾ với lồi G.lucidum G.applanatum.[32] [33]  Triterpenes Tuy nhiên, nhóm đa dạng có tác dụng dƣợc lý mạnh nhóm Triterpenoidscác acid ganoderic Terpenes loại hợp chất tự nhiên mà khung cacbon bao gồm nhiều đơn vị C5 isoprene Ví dụ terpenes menthol (monoterpene) β carotene (tetraterpene) Có thể alkenes, số có chứa nhóm chức khác, nhiều nhóm cyclic Các hợp chất đƣợc phân bố rộng rãi khắp giới thực vật đƣợc tìm thấy sinh vật nhân sơ nhƣ sinh vật đáy Terpenes đƣợc phát có hoạt động chống viêm, chống nấm hoạt động hạ lipide Triterpenes phân lớp Terpenes có khung C30 Nhìn chung, triterpenoid có khối lƣợng phân tử dao động từ 400 đến 600 kDa cấu trúc hóa học chúng phức tạp bị oxy hóa cao [34] Trong G lucidum, cấu trúc hóa học triterpenes đƣợc dựa lanostane, chất chuyển hóa lanosterol, sinh tổng hợp đƣợc dựa cyclization squalene [35] Việc chiết xuất triterpene thƣờng đƣợc thực Methanol, Ethanol, Acetone, Chloroform, Ether, hỗn hợp dung mơi Các chiết xuất đƣợc tinh chế thêm phƣơng pháp tách khác nhau, bao gồm HPLC pha thƣờng pha đảo [36][37] Lần Nishtoba cộng (1984- 1987) chứng minh acid ganoderic C tự nhiên sau xác định đƣợc Acid ganoderic A B G lucidum Kể từ đó, 100 triterpenes G lucidum với thành phần hóa học đƣợc tìm thấy nghiên cứu rõ ràng Trong số đó, 50 loại loại nấm Phần lớn acid ganoderic lucidenic, nhƣng triterpenes khác nhƣ ganoderals, ganoderiols acid ganodermic đƣợc xác định Chúng thể hoạt lực ức chế giải phóng histamine, ứ chế Angiotensine Conversion enzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp Cholesterol hạ huyết áp Ngày nay, nhóm ganoderic acids đƣợc phát có tới hàng chục dẫn xuất khác Kết tách sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Các hợp chất có tác dụng bảo vệ gan, thực nghiệm thu đƣợc với việc gây tăng GOT GOP CCL4 (tetrachlorurcarbon) [17] G lucidum giàu triterpenes, loại hợp chất giúp cho nấm có vị đắng cho nhiều lợi ích khác nhau, nhƣ tác dụng hạ lipide chống oxy hoá Tuy nhiên, hàm lƣợng triterpene khác phận khác giai đoạn phát triển nấm Cấu trúc triterpenes khác G lucidum đƣợc sử dụng để phân biệt nấm với lồi có liên quan đến phân loại khác đóng vai trò chứng hỗ trợ phân loại Hàm lƣợng triterpene đƣợc sử dụng nhƣ thƣớc đo chất lƣợng mẫu nấm khác [17]  Khả kháng oxy hóa Linh chi Khả kháng oxy hóa Linh chi đƣợc nghiên cứu từ lâu có nhiều báo vấn đề Hầu hết phƣơng pháp sử dụng dung môi hữu để tách chất có Linh chi, từ thử nghiệm phƣơng pháp kháng oxy hóa in vitro in vivo nhƣ: DPPH, ABTS, hydroxyl radicals, khử Sắt… Theo T.P Smina cộng sự, 2011, họ phân lập Triterpene từ nấm Linh chi Nam Ấn Độ có thử nghiệm DPPH, ABTS gốc superoxide Khả kháng oxy hóa triterpenes để “nhặt” gốc tự tạo nên hệ thống bảo vệ thể [38] Các phƣơng pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro Sau mơ hình thực nghiệm in vitro thƣờng đƣợc sử dụng để sàng lọc khảo sát kháng oxy hóa Các phƣơng pháp xác định khả oxy hóa  Phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH DPPH có khả tạo gốc tự bền dung dịch Methanol bão hòa Khi cho chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm làm trung hịa bao vây gốc tự làm giảm cƣờng độ hấp phụ ánh sáng gốc tự DPPH Hoạt tính đánh giá kháng oxy hóa đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đo OD máy so màu bƣớc sóng 517nm [13]  Phƣơng pháp bắt gốc tự ABTS•+ Khi cho hợp chất có tính oxy hóa cao tác dụng với dung dịch chứa ABTS•+, ABTS•+ bị khử trở thành dạng không màu ABTS –R+ Dựa vào khả này, ta xác định hoạt tính bắt gốc tự ABTS•+ hợp chất phân tích cách đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đo OD máy so màu bƣớc sóng 734nm [13]  Phƣơng pháp đánh giá khả đánh bắt gốc tự NO Natri nitroprussid bị phân hủy dƣới ánh sáng sinh gốc tự NO Trong dung dịch nƣớc, NO sinh phản ứng với oxy tạo thành sản phẩm bền vững nitrit nitrat Khi mẫu có hoạt chất ức chế NO hoạt chất phản ứng cạnh tranh với oxy, kết làm giảm nồng độ nitrit tạo thành dung dịch Dựa giảm hàm lƣợng nitrit tạo thành mẫu có hoạt chất ức chế NO so với mẫu khơng có hoạt chất ức chế NO, ta tính đƣợc khả ức chế gốc tự NO hoạt chất Hàm lƣợng Nitrit tạo thành đƣợc xác định dựa phản ứng lên màu với thuốc thử Greiss bƣớc sóng 540nm Khả ức chế gốc tự NO đƣợc xác định dựa phần trăm ức chế I (%) Từ đó, ta tính đƣợc giá trị IC50, đại lƣợng đánh giá khả ức chế mạnh hay yếu hoạt chất Để có sở đánh giá hoạt tính mẫu chất khảo sát, ta sử dụng quercetin acid caffeic làm chất đối đối chứng  Phƣơng pháp đánh giá khả đánh bắt peroxyhydro H2O2  Phƣơng pháp dánh giả khả ức chế trình peroxy hóa lipid màng tế bào MDA (Malonyl điaehyde) sản phẩm cuối q trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên đƣợc áp dụng rộng rãi thực tế đề tài nghiên cứu trình peroxy hóa lipid màng tế bào Nguyên tắc MDA đƣợc sinh q trình peroxy hóa lipid màng tế bào, cho phản ứng với acid thiobarbituric, phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại bƣớc sóng 532 nm, phản ứng đƣợc thực mơi trƣờng pH từ 2-3, nhiệt độ 90- 100 độ C thời gian từ 10- 15 phút Dựa giảm cƣờng độ hấp thu phức ta tính đƣợc khả kháng oxy hóa chất cần nghiên cứu  Phƣơng pháp ORAC Các phƣơng pháp đánh giá khả chống oxy hóa in vivo  Xác định hàm lƣợng hydroperoxyd lipid (LOOH)  Phát gốc tự tạo q trình peroxy hóa (phƣơng pháp đồng trùng hợp chắp nối, phƣơng pháp đo phát quang sinh học)  Xác định pentan-etan Mục tiêu 2.1 Mục tiêu tổng quát Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro cao tổng cao phân đoạn thể nấm Linh chi, từ xác định cao có hoạt tính oxy hóa cao để nghiên cứu sâu hoạt chất mơ hình in vivo 2.2 Mục tiêu cụ thể - Khảo sát mơ hình thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa in vitro để chọn mơ hình ổn định phù hợp với điều kiện chỗ, - Áp dụng mơ hình thử nghiệm kháng oxy hóa in vitro cao chiết cao phân đoạn từ nấm Linh chi đƣợc trồng Việt Nam Phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Nguyên liệu nghiên cứu Nấm Linh Chỉ đỏ (Ganoderma lucidum) có nguồn gốc Nhật Bản đƣợc nuôi trồng Việt Nam đƣợc cung cấp công ty Linh Chi VINA Dƣợc liệu đƣợc xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát 3.2 Thu nhận cao tổng cao phân đoạn nấm Linh chi Thu nhận kế thừa cao tổng cao phân đoạn nấm Linh chi từ đề tài “NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ NẤM DƢỢC LIỆU QUÝ” ThS Lâm Khắc Kỷ để tiến hành khảo sát tính kháng oxy hóa vi vitro 3.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp bắt gốc tự ABTS•+ 3.3.1 Nguyên tắc Dung dịch chứa ABTS•+ (2-azinobis ,3 ethylbenzothiazoline- axit 6-sulfonic) có màu lục lam đến màu xanh ngọc, có độ hấp phụ cực đại bƣớc sóng đặc trƣng 415nm, 660nm, 734nm 820nm Khi cho hợp chất có tính kháng oxy hóa cao tác dụng với dung dịch chứa ABTS•+, ABTS•+ bị khử thành dạng không màu ABTS – R+ Dựa vào khả này, ta định tính nhƣ định lƣợng khả bắt gốc tự ABTS•+ hợp chất phân tích [13] Hình 3.1 Phản ứng bắt gốc tự ABTS•+ 3.3.2 Tiến hành: Khảo sát khả bắt gốc tự ABTS•+ đƣợc thực theo quy trình Chang cộng tiến hành năm 2007 với số thay đổi phù hợp Quy trình - Tạo gốc tự ABTS•+: hịa tan dung dịch mM ABTS với 2,45mM K2S2O8, ủ tối nhiệt độ phòng 12 – 16 - Pha lỗng dung dịch ABTS•+: pha lỗng đệm muối phosphate (pH 7,4) đƣợc dung dịch A Lƣu ý, dung dịch sau pha loãng phải đạt giá trị OD734nm = 0,70 ± 0,02 - Các mẫu thử cao EtOH cao phân đoạn đƣợc tiến hành nghiên cứu nồng độ µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml, 1000 µg/ml, 2000 µg/ml - Mỗi mẫu phản ứng gồm: 100µl mẫu thử nồng độ khảo sát đƣợc cho phản ứng với 3ml dung dịch ABTS Hỗn hợp sau pha đƣợc để nhiệt độ phòng 30 phút, tối Đo quang bƣớc sóng 734 nm [ - Đối chứng dƣơng ta sử dụng Vitamin C - Khả bắt gốc tự ABTS•+ đƣợc tính theo hoạt tính khử gốc tự IC50: ] [ Acontrol(0 phút): Độ hấp thu đối chứng sau pha chế Acontrol(30 phút): Độ hấp thu mẫu đối chứng sau 30 phút ủ Asample(30 phút): Độ hấp thu mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ ] Ablank(30 phút): Độ hấp thu mẫu trắng sau 30 phút ủ Hình 3.2 Thay đổi màu sắc phản ứng ABTS theo khả bắt gốc tự cao 3.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH 3.4.1 Nguyên tắc: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,C18H12N5O6, M= 394,33) Là gốc bền màu tím, phân tử khơng bị dimer hóa nhƣ số gốc tự khác Thí nghiệm dựa việc đo lƣờng khả nhặt rác chất chống oxy hóa DPPH có khả tạo gốc tự bền dung dịch methanol bão hoà Các electron lẻ nguyên tử nito DPPH đƣợc giảm cách nhận nguyên tử hydro từ chất kháng oxy hóa với hydrazine tƣơng ứng Khi cho chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm trung hồ bao vây gốc tự làm giảm cƣờng độ hấp phụ ánh sáng gốc tự DPPH Hoạt tính kháng oxy hố đƣợc đánh giá thơng qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đo OD máy so màu bƣớc sóng 517nm [13] Hình 3.3 Ngun tắc phản ứng DPPH Nguồn: Hydroxycinnamic Acid Antioxidants: An Electrochemical Overview 3.4.2 Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch DPPH: pha DPPH dung dịch methnol 80%, cho đạt giá trị OD517nm = 0,70 ± 0,02 Gọi dung dịch A - Chuẩn bị dung dịch cao chiết nồng độ – 1000µg/ml - Tạo hỗn hợp phản ứng: cho 1ml dung dịch chứa mẫu cần phân tích vào 1,5 ml dung dịch A, ủ tối thời gian 30 phút, thí nghiệm đƣợc lặp lại tối thiểu lần cho phản ứng - Mẫu đối chứng dƣơng vitamin C đƣợc chuẩn bị nồng độ – 20µg/ml - Mẫu trắng đƣợc thực cách thay DPPH dung dịch Methanol 80% - Mẫu không gồm ml dung dịch Methanol 80% 1,5 ml DPPH - Khả bắt gốc tự DPPH đƣợc tính theo hoạt tính khử gốc tự IC50: [ ] [ ] Acontrol(0 phút): Độ hấp phụ đối chứng sau pha chế Acontrol(30 phút): Độ hấp phụ mẫu đối chứng sau 30 phút ủ Asample(30 phút): Độ hấp phụ mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ Ablank(30 phút): Độ hấp phụ mẫu trắng sau 30 phút ủ 3.5 Phân tích thống kê số liệu Sử dụng kỹ thuật thống kê kết hợp với phần mềm Excel phân tích hàm T –test để kiểm tra kết cao có khác mặt thống kê hay không Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phƣơng pháp DPPH Hoạt tính bắt gốc tự DPPH khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hiệu quả, nhanh chóng đơn giản Việc mẫu khảo sát có khả bắt gốc tự DPPH chứng tỏ mẫu có chứa hợp chất có khả nhƣờng hydrogen chuyển electron cho gốc tự cách trực tiếp, tạo thành sản phẩm ổn định hơn, có khả kết thúc ... tính kháng oxy hóa cao chi? ??t từ nấm Linh Chi? ??, để nghiên cứu sâu khả kháng oxy hóa Linh Chi tơi đƣa số hƣớng nhƣ sau:  Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cao chi? ??t từ nấm Linh Chi mơ hình tế bào ... màu bƣớc sóng 734nm 2.4 Tổng két kết nghiên cứu 2.4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phƣơng pháp DPPH Hoạt tính bắt gốc tự DPPH khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hiệu quả, nhanh chóng... liệu Linh chi đỏ để nghiên cứu khả kháng oxy hóa invitro từ cao chi? ??t nấm 2.2 Mục tiêu  Mục tiêu tổng quát Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro cao tổng cao phân đoạn thể nấm Linh chi, từ