Xây dựng quy trình pma real time pcr phát hiện listeria monocytogenes và salmonella spp trên mẫu sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ∞0∞ ĐỖ NGỌC DIỄM TRÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH PMA REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN Listeria monocytogenes VÀ Salmonella spp TRÊN MẪU SỮA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc GIẤY XÁC NHẬN Tôi tên là: Đỗ Ngọc Diễm Trúc Ngày sinh: 15/08/1985 Nơi sinh: Sóc Trăng Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã học viên: 1884202010008 Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh kết nối tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ký tên (Ghi rõ họ tên) i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn “Xây dựng qui trình PMA Real-time PCR phát Listeria monocytogenes Salmonella spp mẫu sữa” nghiên cứu tơi Ngoại trừ tài liệu tham khảo trích dẫn luận văn này, tơi cam đoan toàn phần hay phần nhỏ luận văn chưa công bố sử dụng để nhận cấp nơi khác Không có sản phẩm/nghiên cứu người khác sử dụng luận văn mà khơng trích dẫn theo quy định Luận văn chưa nộp để nhận cấp trường đại học sở đào tạo khác TP Hồ Chí Minh, Năm 2020 ĐỖ NGỌC DIỄM TRÚC ii LỜI CẢM ƠN Trước hết xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy giáo Khoa Công Nghệ Sinh Học trang bị cho kiến thức giúp định hướng đắn trình học tập Đặc biệt, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cô giáo PGS.TS Lê Huyền ÁI Thuý, Trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học dành thời gian, trực tiếp bảo, hướng dẫn tơi hồn thành tốt luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể anh chị nhân viên Công ty Cổ phần Công Nghệ TBR tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình triển khai thực luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! iii TĨM TẮT Sữa sản phẩm từ sữa đóng vai trò quan trọng chế độ dinh dưỡng hàng ngày người toàn giới Tuy nhiên sữa giàu dưỡng chất nên dễ nhiễm vi sinh tất giai đoạn từ chế biến đến trình tiêu dùng Hai tác nhân phổ biến gây ngộ độc sữa Salmonella spp Listeria monocytogenes Trong Salmonella spp ghi nhận tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến thứ (Aarestrup cộng sự, 2007) Việc nhiễm Listeria tương đối hiếm, thường tiến triển nặng với tỉ lệ tử vong cao từ 20% - 30% (theo báo cáo FAO WHO năm 2001) Để phát vi sinh gây ngộ độc thực phẩm phương pháp ni cấy truyền thống xem tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy lại tốn thời gian nhân lực, khơng đáp ứng u cầu cần có kết nhanh việc ứng dụng quy trình vào thực tế Phương pháp Real-time PCR phát triển với đặc tính phát nhanh, chuyên biệt đơn giản phương pháp nuôi cấy truyền thống, đặc biệt cho phép phát nhiều tác nhân đồng thời Mặc dù vậy, kỹ thuật phân tử cho kết dương tính giả khơng phân biệt vi khuẩn sống hay chết áp dụng vào thực tế với bước trùng sản phẩm làm chết vi sinh vật DNA vi khuẩn diện sản phẩm sau bước tiệt trùng Để cải thiện vấn đề này, công trình nghiên cứu cho đời kết hợp kỹ thuật PCR với chất nhuộm sinh học, propidium monoazide (PMA), dẫn xuất ethidium bromide Cách kết hợp cho phép phát DNA từ tế bào có màng ngun vẹn dựa đặc tính thuốc nhuộm PMA PMA xâm nhập qua màng tế bào vi khuẩn chết, gắn vào DNA liên kết cộng hóa trị DNA sau gắn với PMA khơng thể khuếch đại dẫn đến ức chế phản ứng PCR (Nocker cộng sự, 2006) Việc ứng dụng quy trình PMA real-time PCR nhằm phát Salmonella spp Listeria monocytogenes công bố qua số cơng trình giới Tuy nhiên nước chúng tơi chưa tìm thấy cơng bố việc sử dụng PMA kết hợp PCR hay Real-time PCR phát vi sinh vật nói chung tác nhân iv vi sinh gây ngộ độc sữa Listeria monocytogenes Salmonella spp nói riêng Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm bước đầu xây dựng quy trình PMA Real-time PCR, phát đồng thời Listeria monocytogenes Salmonella spp mẫu sữa nhằm đáp ứng nhu cầu nước, hạn chế việc nhập khuẩn, giảm giá thành chủ động việc kiểm nghiệm Kết ghi nhận giới hạn phát quy trình PMA Real-time PCR 10CFU/ml mẫu chuẩn L monocytogenes mẫu chuẩn Salmonella Mặc khác độ nhạy quy trình mẫu gây nhiễm salmonella 10CFU/ml mẫu gây nhiễm L.monocytogenes 102CFU/ml Không ghi nhận mẫu thực nghiệm nhiễm Salmonella L monocytogenes v ABSTRACT Milk and dairy products play an important role in the daily nutrition and diet of people in the world Milk is rich in nutrients so it can easily be contaminated by microborganisms at all stages from processing to consumption Two common milk poisoning authors are Salmonella spp and Listeria monocytogenes Salmonella spp was recognized as the second most common food poisoning agent (Arilyrup et al., 2007) Listeria is relatively rare, but often develops severely with high mortality rates between 20% and 30% (FAO and WHO reports in 2001) For the detection of food poisoning microbes, traditional culture methods are considered the gold standard However, the culture method is time-consuming and labor-intensive, does not meet the requirement for fast results in the practical application of the process The Real-time PCR method has been developed with features such as faster, more specialized and simpler than the traditional culture method, especially allowing the detection of one or more agents simultaneously This molecular technique can give false positive results because it is impossible to distinguish live or dead bacteria when applied in practice with the sterilization step of the product that kills microorganisms but the bacterial DNA still present in the product after pasteurization In order to improve this problem, studies have shown a combination of PCR technique with a biological dye, propidium monoazide (PMA), a derivative of ethidium bromide This combination allows the detection of DNA from intact membrane cells based on the properties of the PMA dye PMA can penetrate the cell membrane of dead bacteria, attaching to the DNA by covalent bond DNA after binding to PMA cannot be amplified, leading to inhibition of PCR reactions (Nocker et al., 2006) The application of PMA real-time PCR process to detect Salmonella spp and Listeria monocytogenes has been published in the world In Viet Nam, we have not found any claim on the use of PMA in combination with PCR or Real-time PCR in the detection of microorganisms in general and milk poisoning microorganisms such as Listeria monocytogenes and Salmonella spp in particular Therefore, this study is carried out to initially build PMA Real-time PCR vi process, simultaneously detecting Listeria monocytogenes and Salmonella spp on milk samples to meet domestic demand, limit bacteria entry, possibly reduce costs and be more proactive in testing The results recorded detection limit of PMA Real-time PCR procedure was 10CFU /ml on the culture pure Listeria monocytogenes and on the standard Salmonella On the other hand, the sensitivity of the procedure on samples contaminated with salmonella is 10CFU / ml and on samples contaminated with L monocytogenes is 102CFU / ml No experimental samples were found to be contaminated with Salmonella and L monocytogenes vii MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Listeria monocytogenes Salmonella spp 1.1.1 Listeria monocytogenes 1.1.2 Salmonela spp 1.1.3 Các công bố giới việc sử dụng PMA kết hợp Real-time PCR phá Listeria monocytogenes Salmonella spp 1.1.3 Tình hình ngộ độc Listeria monocytogenes Salmonella spp giới Việt Nam 1.1.4 Quy định kiểm soát Listeria monocytogens Salmonella spp mẫu sữa 1.2 Phương pháp nuôi cấy 1.3.Phương pháp Real-time PCR kết hợp PMA 11 1.3.1.PMA 11 1.3.2 Real-time PCR (qPCR) kết hợp PMA 12 1.3.3 Chứng nội (IAC) 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Dụng cụ 14 2.1.2 Thiết bị 14 2.1.3 Hóa chất 14 2.1.4.Vật liệu sinh học 15 2.2 Phương pháp 16 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 16 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu sữa 17 2.2.3 Kiểm tra insilico đặc tính Mồi – Mẫu dò 17 2.2.4 Phương pháp Real-time PCR 19 2.2.5 Phương pháp Real-time PCR kết hợp thuốc nhuộm PMA 21 2.2.6 Sơ đồ thí nghiệm 23 ... độc sữa Listeria monocytogenes Salmonella spp nói riêng Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm bước đầu xây dựng quy trình PMA Real- time PCR, phát đồng thời Listeria monocytogenes Salmonella spp mẫu sữa. .. quy trình PMA real- time PCR nhằm phát Salmonella spp Listeria monocytogenes cơng bố qua số cơng trình giới Tuy nhiên nước chưa tìm thấy cơng bố việc sử dụng PMA kết hợp PCR hay Real- time PCR phát. .. nhận giới hạn phát quy trình PMA Real- time PCR 10CFU/ml mẫu chuẩn L monocytogenes mẫu chuẩn Salmonella Mặc khác độ nhạy quy trình mẫu gây nhiễm salmonella 10CFU/ml mẫu gây nhiễm L.monocytogenes