Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc và mối liên hệ di truyền của các chủng campylobacter spp , salmonella spp phân lập từ người và động vật (tóm tắt)

MỞ ĐẦU Campylobacter spp., Salmonella spp hai tác nhân vi khuẩn hàng đầu gây bệnh tiêu chảy giới tác nhân phổ biến gây bệnh viêm ruột kết có nguồn gốc từ vật nuôi có phổ vật chủ rộng, gồm người, động vật, bò sát…Trong tình hình nhiễm ngày gia tăng khắp nơi giới, tình hình kháng thuốc hai loại vi khuẩn không ngừng tăng lên, đặc biệt với fluoroquinolone (FQ), erythromycin riêng với Campylobacter Cephalosporin hệ riêng với Salmonella.Tình hình kháng kháng sinh báo cáo nhiều nước [1, 4, 24], thông tin nước ta giới hạn cần cập nhật Nhằm tình hiểu thêm tình hình kháng thuốc bệnh tiêu chảy mối liên quan di truyền hai loại vi khuẩn trên, thực đề tài “Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc mối liên hệ di truyền chủng Campylobacter spp Salmonella spp phân lập từ người động vật”, nhằm: Mô tả đặc điểm kháng thuốc chế kháng thuốc Campylobacter Salmonella phân lập người động vật (heo, heo rừng, gà, vịt, cầy hương) Khảo sát mối liên quan mặt di truyền Campylobacter Salmonella phân lập người động vật CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Campylobacter spp 1.1.1 Giới thiệu Campylobacter vi khuẩn gram âm, không tạo bào tử Tế bào Campylobacter nhỏ, có dạng cong hình chữ S hay có dạng xoắn (dài 0,5-5 µm rộng 0,2-0,8 µm) Chúng di động với tiêm mao nằm đầu hay hai đầu tế bào tạo nên kiểu di động xoắn ốc Campylobacter vi khuẩn vi hiếu khí hiếu khí tùy ý C jejuni C coli vi sinh vật vi hiếu khí ưa nhiệt Nhiệt độ phát triển tốt 42oC đòi hỏi nồng độ oxy từ 3-15% nồng độ CO2 3-5% Ưa nhiệt xem đặc điểm giúp chúng thích nghi với môi trường ruột động vật chim 1.1.2 Bệnh học, chẩn đoán điều trị Bệnh Campylobacter bệnh nhiễm lây từ động vật sang người Bệnh thường biết đến bệnh viêm dày - ruột xảy người sử dụng thức ăn hay nước bị nhiễm khuẩn Liều nhiễm gây bệnh thấp, trung bình khoảng 10cfu/ml - 500cfu/ml, Campylobacter vi sinh vật thường tìm thấy ruột người nên khả lây truyền người người thường thấp Chần đoán điều trị: Bệnh cảnh lâm sàng nhiễm Campylobacter tiêu chảy, đau bụng, sốt, đau đầu, suy nhược Tuy nhiên, biểu khó phân biệt với nhiễm trùng đường ruột vi khuẩn khác Salmonella, Shigella E.coli 0157:H7 Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống tiêu chuẩn vàng chẩn đoán bệnh Nuôi cấy C jejuni C coli cần điều kiện vi hiếu khí nhiệt độ ủ 42oC để kìm hãm phát triển số loài Campylobacter không chịu nhiệt Ngoài ra, để phát nhanh mẫu phân, người ta sử dụng phương pháp PCR hay ELISA phương pháp có độ nhạy độ xác cao Hiện nay, macrolide xem kháng sinh tối ưu điều trị nhiễm Campylobacter Ngoài ra, FQ (Ciprofloxacin) thường sử dụng để điều trị triệu chứng bệnh giống với triệu chứng bệnh viêm dày - ruột vi khuẩn khác Salmonella, Shigella [85] 1.1.3 Tình hình nhiễm Campylobacter spp Việt Nam giới - Ở Việt Nam: Trong nghiên cứu đoàn hệ kéo dài năm trẻ em tuổi khu vực TP HCM cho thấy Campylobacter chiếm tỷ lệ đến 20% sau rotavirus norovirus [14] Gần khảo sát kéo dài năm bệnh viện lớn điều trị trẻ em cho thấy với Shigella Salmonella, Campylobacter nhóm gây bệnh đáng ý nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy [31] Khảo sát động vật, xem nguồn gốc nhiễm khuẩn Campylobacter, cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn gia cầm - gia súc vùng đồng sông Mekong 31.9%, 23.9% 53.7% gà, vit, heo [24] tỷ lệ kháng kháng sinh cao Trước khảo sát vào năm 2007 cho thấy 100 mẫu thịt gà (ức) từ chợ Hà Nội 31% nhiễm với đa số C jejuni (45.2%) C.coli (25.8%) Tương tự khảo sát Viện Dinh Dưỡng Hà Nội cho thấy 28.3% nhiễm C jejuni [58, 89] - Trên giới: Ở nước phát triển vùng nhiệt đới, bệnh Campylobacter chưa phải vấn đề nghiêm trọng người lớn bệnh dịch trẻ em, đặc biệt trẻ nhỏ hai tuổi [16] Tình trạng nhiễm Campylobacter không triệu chứng bệnh xảy phổ biến người lớn trẻ em.Tuy nhiên, nước phát triển chương trình giám sát quốc gia bệnh nhiễm Campylobacter nên số liệu tần suất bệnh dân số Mặc dù thiếu liệu nghiên cứu bệnh - chứng dựa cộng đồng nước phát triển ước tính tỉ lệ nhiễm Campylobacter trẻ em tuổi từ 40.000 đến 60.000 ca/ 100.000 dân Tỉ lệ phân lập Campylobacter nước phát triển từ đến 20% [16, 32, 111] 1.1.4 Tình hình kháng kháng sinh Campylobacter spp - Ở Việt Nam: Trong khoảng thời gian 1996 – 1999, có 7% mẫu Campylobacter phân lập từ trẻ em tuổi Việt Nam kháng với FQ [34] Theo nghiên cứu Cần Thơ, Việt Nam, tỉ lệ Campylobacter phân lập từ thịt gà Cần Thơ kháng FQ tăng lên đến 64% C jejuni lên đến 100% C coli [114] - Trên giới: Trong thập kỉ qua, tình hình kháng FQ Campylobacter tăng nhanh với tỉ lệ phân lập chúng khắp giới Ở Châu Âu có khoảng 17% - 99% chủng Campylobacter phân lập từ người động vật kháng với FQ [10, 76, 86] Campylobacter kháng FQ trở nên phổ biến Châu Phi Châu Á 1.2 Tổng quan Salmonella spp 1.2.1 Giới thiệu Salmonella spp giống vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, bao gồm nhiều vi khuẩn gây bệnh người động vật Salmonella chia thành loài enterica bongori [38, 145] Salmonella enterica chia thành phân loài enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae and indica, với 2500 týp huyết khác [82] Salmonella spp vi khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, hình que, oxidase âm, không tạo bào tử có khả di động Salmonella có kích thước chiều rộng từ 0.7-1.5μM chiều dài khoảng 2-5μM [145] Trong phạm vi này, Salmonella spp hay Salmonella dùng để tất týp huyết Salmonella gây bệnh nhiễm trùng dày ruột nhiễm trùng xâm lấn người động vật, ngoại trừ S Typhi S Paratyphi A 1.2.2 Bệnh học, chẩn đoán điều trị Salmonella thường lây lan qua đường tiêu hóa Đa số trường hợp mắc bệnh ăn uống phải thực phẩm, nước uống bị nhiễm khuẩn không nấu chín, ăn phải thức ăn tươi rửa nguồn nước bị nhiễm khuẩn nước sông, ao hồ, cống rãnh Salmonella diện môi trường sau: nước, sữa nhiễm khuẩn, thịt nhiễm khuẩn, sò, ốc, hến Nhiễm Salmonella có nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, phụ thuộc mối tương tác vi khuẩn vật chủ Kết mối tương tác chủng Salmonella vật chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác týp huyết vi khuẩn, liều nhiễm, khả miễn dịch hệ vi sinh vật đường ruột vật chủ Chần đoán điều trị: triệu chứng nhiễm trùng dày ruột Salmonella thường tương tự triệu chứng tiêu chảy tác nhân gây bệnh khác Trẻ em tiêu chảy thường bị nước rối loạn điện giải Chẩn đoán xác có cách phân lập tác nhân gây bệnh Ở bệnh nhân bị nhiễm trùng dày ruột, việc cấy phân mẫu phết trực tràng dương tính hầu hết người bị nhiễm Tiêu lỏng nôn ói nhiều lần làm thể người bệnh bị nước nhanh chóng, đặc biệt trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ vùng khí hậu nóng có kèm sốt Phác đồ điều trị tiêu chảy theo khuyến cáo Tổ chức y tế giới bù nước chất điện giải dung dịch oresol, cho uống kèm viên kẽm [27] Riêng việc điều trị kháng sinh vấn đề tranh cãi Ngoài FQ (ciprofloxacin), Cephalosporin thường sử dụng để điều trị triệu chứng bệnh giống với triệu chứng bệnh viêm dày - ruột vi khuẩn khác E.coli, Shigella…[85] 1.2.3 Tình hình nhiễm Salmonella spp Việt Nam giới - Ở Việt Nam: số nghiên cứu dịch tễ tác nhân gây tiêu chảy Hà Nội bệnh nhi tuổi cho thấy bệnh nhiễm trùng dày ruột Salmonella spp tăng nhanh từ 0% năm 2004 lên 3,6% năm 2007 [63] 7% năm 2008 [62] Các liệu cho thấy Salmonella tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy Hà Nội Các nghiên cứu động vật cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella thịt (heo, bò, gà) hải sản (tôm) đồng Sông Cửu Long cao, dao động từ 21% đến 69,9% [107] - Trên giới: hàng năm, giới có khoảng 93,8 triệu ca nhiễm trùng dày ruột Salmonella, với tỉ lệ tử vong 155.000 ca Trong khoảng 80,3 triệu ca ngộ độc thực phẩm [91] Ở Hoa Kỳ, ước tính hàng năm có khoảng 1,4 triệu ca ngộ độc thực phẩm gây Salmonella [97, 129] Hai týp huyết gây bệnh người phổ biến S Enteritidis S Typhimurium [27] S Enteritidis týp huyết phổ biến toàn cầu, đặc biệt châu Âu (chiếm 80% số ca bệnh) châu Á (38% số ca bệnh) Đại dịch S Enteritidis ghi nhận lần đầu vào cuối thập niên 80 kỉ trước có nguồn gốc từ trứng gia cầm bị nhiễm khuẩn [56] 1.2.4 Tình hình kháng kháng sinh Salmonella spp - Ở Việt Nam: theo nghiên cứu trường Đại học Úc kết hợp với Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam, tỉ lệ phân lập Salmonella thực phẩm tươi sống chợ 50% (91 mẫu dương/180 mẫu), có tỉ lệ kháng kháng sinh cao, đặc biệt số chủng Salmonella đa kháng chiếm 50,5% [128] Nghiên cứu Hùng cộng (04/2015) phân lập Salmonella từ 145 bệnh nhân tiêu chảy cấp Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương Hà Nội Bệnh viện 103 cho kết tỉ lệ kháng kháng sinh cao: 100% với ampicillin; 88,89% với chloramphenicol 66,67% với trimethoprim - sulfamethoxazole [3] - Trên giới: nghiên cứu phân lập kiểm tra mức độ kháng thuốc Salmonella 3.570 trẻ em bị tiêu chảy Gaza, Palestine cho thấy tỉ lệ kháng thuốc ampicillin, trimethoprim - sulfamethoxazole, chloramphenicol, cephalexin 62%, 35%, 35% 26% [6] Một nghiên cứu tương tự Tehran, Iran, Salmonella có tỉ lệ kháng nalidixic acid 42,3% ceftazidime 23,4% [65] 1.2.5 Phương pháp phân loại Campylobacter spp Salmonella spp Sử dụng phương pháp MLST (Multilocus sequence typing) cách khuếch đại phân đoạn gen giữ nhà (house keeping genes) Các phân đoạn gen từ loci loci giải trình tự alen cho số dựa vào thứ tự thời gian chúng xác định Bảy alen loci gen hình thành nên kiểu trình tự trọn vẹn - sequence type (ST) mà cho số dựa vào thời điểm chúng xác định Alen xác định locus aspA aspA1 trình tự ST ST-1… Cũng sử dụng thuật toán BURST (Based Upon Related Sequence Types - thuật toán chuyên phân tích liệu trình tự MLST) để xác định clonal complex (CC); mẫu phân lập xác định thuộc clonal complex định mẫu phân lập có chung alen so với kiểu trình tự (ST) trung tâm giả định clonal complex (clonal complex mang tên kiểu trình tự trung tâm) CHƯƠNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: - Campylobacter spp - Salmonella spp 2.1.1 Phân lập từ người Chủng Campylobacter spp Salmonella spp nghiên cứu phân lập từ 1500 mẫu phân bệnh nhi bị tiêu chảy cấp nhập viện điều trị bệnh viện: Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới, Bệnh viện Đa Khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hòa, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đồng Tháp Bệnh viện Đa Khoa tỉnh Đắk Lắk Các bệnh nhi tham gia nghiên cứu nhập viện bệnh tiêu chảy, thường trú tỉnh thành phố nêu 2.1.2 Phân lập từ gia súc (heo, heo rừng, cầy hương) gia cầm (gà, vịt) Chủng Campylobacter spp Salmonella spp nghiên cứu phân lập từ mẫu thu thập theo phương pháp vớ dậm thú y từ 250 trang trại hộ chăn nuôi cá thể tỉnh Đồng Tháp, tỉnh Đắk Lắk (gồm 274 mẫu) (Nghiên cứu phần dự án khảo sát bệnh lây từ động vật - VIZIONS đơn vị chủ quản) 2.1.3 Qui trình thực nghiệm Qui trình phân lập, định danh phân tích kiểu gen chủng Campylobacter, Salmonella tóm tắc theo Sơ đồ 2.1 Sơ đồ 2.1 Qui trình thực nghiên cứu CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP THEO VÙNG Việc phân lập, định danh Campylobacter spp Salmonella spp tiến hành từ đầu năm 2012 đến cuối năm 2013 người Bệnh viện (Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hoà, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đắk Lắk, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đồng Tháp Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh) động vật tỉnh (Đồng Tháp, Đắk Lắk) thu kết chi tiết theo Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng3.1 Kết phân lập Campylobacter spp theo vùng Địađiểm ĐắkLắk Nguồn Người Heo 1/150 (0,67%) - Heo rừng 5/14 (35,71%) Đồng Tháp Khánh Hòa 3/150 1/150 (2%) (0,67%) 24/45 (53,33%) - 25/45 (55,56%) 26/120 25/45 Vịt (21,67%) (55,56%) Cầy 0/5 hương (0%) 32/289 77/285 1/150 Tổng số (11,07%) (27,02%) (0,67%) Gà - Tp Hồ Chí Minh 40/1000 (4%) - Thừa Thiên Huế 1/50 (2%) - - - - - - - - - 40/1000 (4%) 1/50 (2%) Tổng số 46/1500 (3,07%) 24/45 (53,33%) 5/14 (35,71%) 25/45 (55,56%) 51/165 (30,91%) 0/5 (0%) 151/1774 (8,51%) Bảng3.2 Kết phân lập Salmonella spp theo vùng Địa điểm Đắk Lắk Nguồn Người Heo Heo rừng 4/150 (2,67%) 4/14 (28,57%) Đồng Tháp 12/150 (8%) 38/45 (84,44%) - Tp Hồ Chí Minh 13/150 64/1000 (8,67%) (6,4%) Khánh Hòa - - - - - - 42/45 (93,33%) 40/120 41/45 Vịt (33,33%) (91,11%) 4/5 Cầy hương (80%) 52/289 133/285 13/150 64/1000 Tổng số (17,99%) (46,67%) (8,67%) (0,64%) Gà Thừa Thiên Huế 25/50 (50%) - 25/50 (50%) Tổng số 118/1500 (7,87%) 38/45 (84,44%) 4/14 (28,57%) 42/45 (93,33%) 81/165 (49,09%) 4/5 (80%) 287/1774 (16,18%) Kết cho thấy tỉ lệ cấy dương tính Campylobacter từ mẫu động vật cao gấp gần 12,5 lần so với tỉ lệ cấy dương tính Campylobacter từ mẫu người Bảng 3.1 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p 95% Với macrolides tình hình tệ với C coli có 73% chủng từ gà 54% chủng từ heo kháng erythromycine Các tác giả phát có gia tăng có ý nghĩa tỷ lệ C coli kháng macrolide từ 2008 - 2014 tỷ lệ kháng C jejuni từ gà có giảm bớt Nguyên nhân sử dụng 12 gia tăng rộng rãi macrolides gồm tylosin, tilmicosin, erythromycin, kitasamycin tulathromycin, công nghiệp nuôi gà heo [136] Theo tác giả gia tăng đa kháng kháng sinh đe dọa khả điều trị Campylobacter nhóm kháng sinh nhạy cảm macrolides bệnh nhân đa số trường hợp nhiễm từ động vật 3.4 Tính đa kháng kháng sinh Salmonella spp Bảng 3.10 Kết kháng nhóm kháng sinh Salmonella Nguồn Người Heo rừng Heo Nhóm kháng sinh FQ 11/118 7/38 0/4 (NA, OFX, CIP) (9,32%) (18,4%) (0%) Cephalosporin 3/118 2/38 1/4 (CRO, CAZ) (2,54%) (5,26%) (25%) Beta lactams 23/118 16/38 2/4 (AMC) (19,5%) (42,1%) (50%) 0/118 0/38 0/4 FQ, Cephalosporin (0%) (0%) (0%) 7/118 4/38 0/4 FQ, Beta lactams (5,93%) (10,5%) (0%) Cephalosporin, 2/118 1/38 1/4 Beta lactams (1,69%) (2,63%) (25%) FQ, Cephalosporin, 2/118 1/38 0/4 Beta lactams (1,69%) (2,63%) (0%) Gà Vịt Cầy hương 12/42 (28,57) 4/42 (9,52%) 24/42 (57,14%) 0/42 (0%) 9/42 (21,43%) 2/42 (4,76%) 2/42 (4,76%) 22/81 (27,2%) 4/81 (4,94%) 28/81 (34,6%) 0/81 (0%) 10/81 (12,4%) 1/81 (1,23%) 3/81 (3,7%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) Bảng 3.10 cho thấy rằng: người có 9,32% (11/118) chủng kháng từ đến nhóm kháng sinh thường dùng để điều trị nhiễm khuẩn Salmonella FQ (nalidixic acid, ofloxacin, ciprofloxacin), cephalosporin (ceftriaxone, ceftazidime) beta lactams (amoxicillin - acid clavulanic) Bên cạnh đó, có tổng số 34 chủng từ heo, heo rừng, gả vịt tổng số 169 kháng từ đến loại kháng sinh nêu chiếm tỉ lệ 20,12% Như vậy, với tình hình này, tương lai gần không xuất vi khuẩn siêu kháng thuốc Samonella Campylobacter mà nhiều loại vi khuẩn khác 13 Ở người động vật, tỷ lệ Salmonella kháng nhóm FQ hay Cephalosporins thấp nhóm beta lactams Trong đó, tỷ lệ kháng [FQ, beta lactams] cao [FQ, Cephalosporins] [Cephalosporins, beta lactams] 3.5 Cơ chế kháng FQ (Ciprofloxacin) Campylobacter spp Kết khảo sát cho thấy 71 chủng C jejuni kháng FQ từ người, heo, gà vịt có 57 chủng mang đột biến gen gyrA codon 86 với kiểu đột biến điểm C257T làm thay đổi Threonin thành Isoleucine cấu trúc protein Thêm vào đó, có 30 chủng có đột biến gen cmeR mã hóa cho hệ thống bơm đẩy thuốc CmeABC Trong đó, đột biến hệ thống bơm đẩy thuốc C jejuni phân lập từ người, gà vịt đa dạng Trường hợp C jejuni mang đột biến người, gà vịt chiếm tỷ lệ cao, gần 50% Bảng 3.13 Kết phân tích Campylobacter kháng FQ Đối tượng Đột biến gyrA Đột biến cmeR Đột biến gyrA cmeR 36 21 21 Heo (n=25) 22 02 02 Gà (n=25) 23 07 07 Vịt (n=25) 22 15 13 Tổng số 103 45 43 Người (n=46) Kết khảo sát cho thấy chủng C coli phân lập từ động vật (heo, gà, vịt) có 13/50 chủng có đột biến gyrA codon 86 với kiểu đột biến điểm C257T (thay Threonin Isoleucine), có đến 33/50 chủng có đột biến điểm T227G (thay Threonin Methionine) Trong đó, C.coli người có kiểu đột biến điểm C257T (n=11) 14 Như vậy, so với C jejuni, C coli có thêm đột biến T227G Hiện tượng đột biến làm thay đổi Threonin thành Methionine phổ biến C coli phân lập từ heo, gà, vịt Đây kiểu đột biến hoàn toàn chưa công bố từ trước đến Nghiên cứu cho thấy đột biến T227G lây truyền theo chiều dọc 3.6 Cơ chế kháng macrolide (erythromycin) Campylobacter Kết phân tích gen kháng erythromycin Campylobacter có phát kiểu đột biến đôi [A-2074-C, A-2075-C] [A-2075G, A-2076-C] kiểu đột biến chưa công bố nơi khác giới Bảng 3.18 Bảng liệt kê đột biến trình tự gen rrnB Loài Đột biến công bố [71, 134] C jejuni A-2230-G T-2268-C A-2230-G, T-2268-C Đột biến tìm _ C coIi A-2230-G A-2074-C A-2074-G A-2075-G A-2230-G, T-2268-C A-2075-G [A-2074-C, A-2075-C] [A-2075-G, A-2076-C] Theo kết nghiên cứu trước cho MIC erythromycin ≥ 128 µg/mL (đối với chủng có tính kháng cao) giải trình tự phát đột biến vị trí A2075G gen rrNB, MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) erythromycin < 128 µg/mL (đối với chủng có tính kháng thấp) có khả mang đột biến vị trí A2074C không mang đột biến [11, 122] Trong nghiên cứu này, so sánh kết MIC erythromycin với vị trí đột biến gen rrnB cho thấy với 11 chủng có MIC erythromycin ≥ 256 µg/mL (11 chủng C coli) có có chủng mang đột biến vị trí A2075G (heo=5 gà=1 vịt=2); có chủng mang đột biến, bao gồm kiểu 15 sau: A2074C & A2075C; A2075G & A2076C heo A2075G & A2076C gà 3.7 Cơ chế kháng thuốc Cephalosporin Salmonella spp Kết khảo sát chủng Salmonella spp mang gen mã hóa ESBL tiết enzym ESBL-TEM ESBL-OXA kỹ thuật PCR Bảng 3.19 cho thấy chủng Salmonella thuộc nhóm B kháng ceftriaxone, ceftazidime amoxicilline - acid clavulinic (Augmentin) có mang gen mã hóa ESBL bao gồm chủng phân lập từ động vật (3 chủng Đồng Tháp chủng Đắk Lắk) chủng phân lập từ người (1 chủng Khánh Hòa chủng Tp Hồ Chí Minh) Bảng 3.19 Bảng phân tích đặc điểm gen ESBL Salmonella spp Địa điểm Nguồn CTX(485bp) OXA(564bp) TEM(269bp) SHV(713bp) Đồng Tháp Heo (n=2) - - + - Đồng Tháp Gà (n=1) - - + - Đắk Lắk Vịt (n=2) - + + - - - + - Người (n=1) - + + - Khánh Người Hòa (n=1) - - + - Đắk Heo rừng Lắk (n=1) HCMC Như vậy, chủng Salmonella nghiên cứu lần phát mang gen mã hóa ESBL plasmid (ESBL-TEM ESBL-OXA) người động vật tỉnh Đắk Lắk Đồng Tháp Những chủng Salmonella kháng kháng sinh Cephalosporin hệ có nguy chuyển gen kháng kháng sinh từ hệ sang hệ khác (chuyển gen theo chiều dọc) 16 chuyển gen kháng kháng sinh từ loài vi sinh vật sang loài vi sinh vật khác nhóm vi khuẩn đường ruột (chuyển gen theo chiều ngang) 3.8 MỐI LIÊN HỆ DI TRUYỀN 3.8.1 Mối liên hệ di truyền Campylobacter spp Phân loại di truyền phương pháp MLST 100 chủng Campylobacter gồm 40 chủng người 60 chủng động vật cho thấy có tất 76 kiểu trình tự (ST) xác định Ở người, kiểu trình tự ST-1919 chiếm ưu với 10% (4 chủng phân lập) kiểu trình tự không tìm thấy động vật Trong đó, động vật kiểu trình tự cụ thể chiếm ưu rõ ràng Các kiểu trình tự xuất người động vật gồm có: ST-161, ST-354, ST2865, ST-4403 Tuy nhiên, số lượng chủng phân lập có kiểu trình tự không nhiều Phức hợp dòng (CC) nghiên cứu tìm thấy nhóm động vật người CC Trong đó, có đến CC xuất người động vật gồm có CC-828, CC-353, CC354, CC-443, CC-460, CC-52 chiếm tỉ lệ giống 75% (6 CC/ CC) Mặc dù số lượng CC chủng phân tích thu động vật cao người giống nhau, không nhiều cho thấy chủng Campylobacter phân lập từ người động vật (gia súc, gia cầm) tương đồng mặt kiểu gen ( giống ST CC) Hình 3.10 Hình 3.11 mô tả cách phân nhóm 76 kiểu trình tự xác định chủng Campylobacter Minimum spanning tree (MST - bao trùm tối thiểu), vẽ phần mềm Bionumerics (version 5.0; Applied Maths) Mỗi kiểu trình tự đại diện vòng tròn Kích thước vòng tròn thể số lượng chủng tạo nên kiểu trình tự Nếu kiểu trình tự có alen khác nhau, chúng nằm chung nhóm, liên kết với đường kẻ đậm có vòng bao quanh (ví dụ: cụm có vòng bao màu hồng gồm nhóm AA, AC, AD, AE) Nếu chúng khác 17 từ alen trở lên, chúng liên kết đường kẻ đứt nét Các số biểu thị số lượng alen khác alen hai kiểu trình tự Những chủng phân lập từ người đánh dấu màu xanh chủng phân lập từ heo tô màu đỏ, chủng từ vịt có màu hồng chủng từ gà có màu nâu.Vòng tròn có từ màu trở lên chứng tỏ kiểu trình tự tìm thấy loài trở lên Các số biểu thị alen khác alen kiểu trình tự Màu bao xung quanh vòng tròn thể kiểu trình tự thuộc nhóm kiểu trình tự nhóm không khác alen alen Kết (ở Hình 3.10 Hình 3.11) mô tả đặc điểm di truyền quần thể Campylobacter phân lập từ người động vật Kết hợp với kết phân lập, phân tích ST CC cho thấy xuất phát điểm C coli từ động vật (heo) vậy, nói C coli lan truyền từ heo sang gà, vịt từ gia súc, gia cầm sang người Phức hợp dòng (CC) xuất người, gia súc gia cầm ST-828 (ở C coli) Hình 3.10 Cây bao trùm tối thiểu vẽ từ liệu MLST C coli Hình 3.11 Cây bao trùm tối thiểu vẽ từ liệu MLST C jejuni Khác với C coli, C jejuni xuất phát từ gà lan truyền sang heo, vịt ngưởi Phức hợp dòng (CC) xuất 18 người, gia súc gia cầm ST-460 C jejuni Thêm vào ST-460 (ở C jejuni) hay ST-574 (tuy tìm thấy người nghiên cứu này) xác định kiểu trình tự Campylobacter gây bệnh người, gà nước Châu Âu [77, 90] Hiện phương pháp MLST phương pháp phổ biến đáng tin cậy để khảo sát dịch tễ học phân tử di truyền dân số Campylobacter [30, 41, 118] Đây lần phương pháp sử dụng để khảo sát Campylobacter Việt Nam Như kết cho thấy kiểu trình tự ST phức hợp dòng CC phân tán Điều giải thích mẫu thu thập từ bệnh nhân đa số từ TP Hồ Chí Minh, nguồn nhiễm Campylobacter thịt gà vịt, thịt heo đa dạng từ nhiều tỉnh nên số lượng ST thay đổi Do giới hạn khách quan, mẫu từ động vật lại bao gồm tỉnh Đồng Tháp đại diện cho vùng đồng sông Mê Kông Đắk Lắk cho Tây Nguyên, nên giải thích tương đồng ST CC không cao phân tích MLST Một điểm cần lưu ý gần người ta bổ sung thêm phương pháp phối hợp với giải trình tự gen whole - genome sequencing - MLST (wgMLST) có độ tin cậy cao phương pháp MLST dựa vào gen wgMLST phân tích đến 1391- 1644 vị trí gen [30, 73, 82, 117] Vì tầm quan trọng Campylobacter tiêu chảy nên điều tra dịch tể MLST/wgMLST sử dụng phối hợp với yếu tố dịch tể khác địa điểm, thời gian, lại… nhằm xác định nguồn dịch 3.8.2 Mối liên hệ di truyền chủng Salmonella spp Phân loại di truyền phương pháp MLST có tất 59 kiểu trình tự (ST) xác định 261 chủng Salmonella, có 15 kiểu trình tự tìm thấy người động vật là: 11, 17, 19, 34, 40, 46, 203, 292, 359, 423, 469, 1499, 1541, 1544, 1547 Ở người, kiểu trình tự 34 chiếm ưu với 18,75% (18 chủng 19 phân lập) so với 2,42% ( chủng phân lập) động vật Trong đó, động vật kiểu trình tự 17 chiếm ưu với 8,48% (14 chủng phân lập) so với 2,08% (2 chủng phân lập) người Tuy nhiên, kiểu trình tự phổ biến động vật 1500 (9,70% với 16 chủng phân lập) lại không tìm thấy người Từ kết kiểu di truyền thu nhận, dựa vào thông tin chung với kiểu trình tự trang web týp huyết Dựa vào liệu toàn cầu giúp xác định týp huyết hầu hết chủng nghiên cứu Số lượng kiểu di truyền týp huyết nhóm động vật đa dạng nhóm người Kết số lượng chủng phân tích thu động vật cao người Theo kết quả, S Typhimurium týp huyết gây bệnh nhiễm trùng dày ruột phổ biến với tỉ lệ lên đến 39,58% (38 chủng) người 10,91% (18 chủng) động vật, kết phù hợp với nhiều nghiên cứu giới S Typhimurium chủng gây bệnh diện phổ biến khắp châu lục Trong khi, S Enteritidis týp huyết liên quan đến dịch bệnh từ trứng gia cầm nhiễm khuẩn nước phát triển Hoa Kỳ hay Canada [65, 70] phân lập nghiên cứu có chủng người chủng động vật Hình 3.12 Cây bao trùm tối thiểu vẽ từ liệu MLST Salmonella 20 Kết phân tích cho thấy S.Weltevreden týp huyết phổ biến sau S Typhimurium phân lập từ người động vật nghiên cứu S Weltevreden týp huyết gây bệnh nhiễm trùng dày ruột Thái Lan Malaysia [38, 119, 126] Kết nghiên cứu Thong cộng phát tương đồng mặt di truyền chủng S Weltevreden gây bệnh người chủng phân lập từ rau sống Malaysia Như vậy, rau sống nguồn lan truyền S.Weltevreden Nhưng rau sống bị nhiễm bẩn nguồn nước, phân gia súc, gia cầm hay phân người Những nghiên cứu Hoa Kỳ hay Thái Lan cho thấy S Weltevreden týp huyết phổ biến thực phẩm đông lạnh nhập từ khu vực Đông Nam Á [61, 108] Ngoài ra, S Weltevreden phân lập từ nguồn nước vịt Thái Lan Như vậy, S Weltevreden týp huyết có liên quan đến nguồn nước nhiễm khuẩn phân gia súc, gia cầm Ở nước phát triển, nhiều nghiên cứu cho giả thuyết trang trại chăn nuôi nguồn chứa Salmonella việc lan truyền Salmonella thông qua đường ăn uống Tuy nhiên, đường lan truyền Salmonella Việt Nam chưa làm rõ nghi ngờ đường truyền từ người sang người từ động vật sang người lan truyền qua đường ăn uống, vệ sinh môi trường Từ kết bao trùm tối thiểu, nhận thấy có số týp huyết S Typhimurium, S Weltevreden, S Newport, S Enteritidis tìm thấy nhóm người bệnh động vật Ngoài ra, có số týp huyết có nhóm động vật mà không tìm thấy người Tuy nhiên, số lượng týp huyết thu nhận nên đưa kết luận xác týp huyết chuyển từ động vật sang người hay từ người sang động vật hay chủng có xuất phát điểm từ người hay động vật 21 CHƯƠNG - KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 4.1.1 Đặc tính kháng thuốc Campylobacter spp Tỷ lệ kháng kháng sinh Campylobacter phân lập từ động vật cao tỷ lệ kháng chủng phân lập từ người Tính kháng fluoroquinolone tượng đột biến vị trí codon 86 gen gyrA: có 89,3% (67/75) chủng vi khuẩn Campylobacter động vật có mang đột biến C257T (Thr-86-Ile) T227G (Thr-86-Me) gen gyrA Đây lần đột biến T227G C.coli, chưa báo cáo giới, phát động vật Việt Nam Bên cạnh, đột biến gen gyrA, 32% (24/75) chủng Campylobacter động vật có mang đột biến gen mã hóa CmeABC hệ thống bơm đẩy thuốc có vai trò kháng FQ Campylobacter người có tỉ lệ mang đột biến gen gyrA gen cmeR cao 45,65% (21/46) Campylobacter phân lập người hoàn toàn nhạy cảm với erythromycin Trái lại, nghiên cứu phát 11 chủng động vật kháng erythromycin (MIC ≥256 µg/ml) Kết phân tích trình tự genrrnB liên quan đến khả kháng erythromycin chủng này, phát có chủng Campylobacter có đột biến vị trí A2075G, chủng mang đột biến vị trí A2075G A2074C chủng mang đột biến vị trí A2075G A2076C Đây kiểu đột biến đôi phát Việt Nam, chưa công bố nơi khác giới 4.1.2 Đặc tính kháng thuốc Salmonella spp Kết khảo sát độ nhạy 12 loại kháng sinh khác cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh Salmonella phân lập động vật cao tỷ lệ kháng thuốc chủng phân lập người Nghiên cứu phân lập 287 chủng Salmonella thuộc nhóm khác bao gồm Salmonella nhóm B, Salmonella nhóm C, 22 Salmonella nhóm D nhóm “khác” Đa số chủng phân lập kháng với loại kháng sinh Tuy nhiên, kết nghiên cứu cho thấy Salmonella phân gia súc, gia cầm khu vực tỉnh Đắk Lắk, Đồng Tháp nhạy cảm với FQ (ofloxacin, ciprofloxacin), cephalosporin hệ (ceftriaxone, ceftazidime), kháng sinh họ beta lactams (amoxicillin - acid clavulanic) Kết phân tích liên hệ di truyền sử dụng phương pháp bao trùm tối thiểu (minium spanning tree) cho thấy Salmonella lan truyền qua lại người động vật Bên cạnh đó, chủng Salmonella spp nghiên cứu phát gen mã hóa men bất hoat beta lactams phổ rộng (ESBL) plasmid (ESBL-TEM ESBL-OXA) Đây lần gen phát Việt Nam người (Khánh Hòa Tp Hồ Chí Minh) động vật (tỉnh Đắk Lắk Đồng Tháp) 4.1.3 Kết luận mối liên hệ di truyền Campylobacter spp Kết phân tích liên hệ di truyền sử dụng phương pháp “cây bao trùm tối thiểu” cho thấy: - C jejuni tác nhân gây bệnh tiêu chảy người đồng thời phân lập động vật khỏe mạnh với tỷ lệ cao nên nói động vật bao gồm gia súc gia cầm nguồn lây vi khuẩn - C.coli phân lập phần lớn từ heo chứng tỏ nguồn mang vi khuẩn lan truyền qua người để gây bệnh tiêu chảy Ngoài ra, kết cho thấy C coli lan truyền từ heo sang gà vịt Như vậy, kết luận chủng C coli phân lập từ người có nguồn gốc từ động vật 4.1.4 Kết luận mối liên hệ di truyền Salmonella spp 23 Những chủng Salmonella phân lập từ phân bệnh nhân bị tiêu chảy cấp phân từ trang trại chăn nuôi có mối tương đồng mặt di truyền sử dụng phương pháp phân loại di truyền MLST Các kiểu trình tự Salmonella thu người động vật đa dạng Một số týp huyết tìm thấy người động vật chiếm tỉ lệ cao S.Typhimurium, S Weltevreden, S Newport, S Enteritidis Kết phân tích liên hệ di truyền sử dụng phương pháp bao trùm tối thiểu (minium spanning tree) cho thấy Salmonella lan truyền qua lại người động vật 4.2 ĐỀ NGHỊ Từ kết đạt được, số nghiên cứu đề nghị nhằm thu nhiều kết kiến thức sâu quần thể Campylobacter Salmonella phân lập Việt Nam: - Cần có chương trình giám sát quốc gia bệnh nhiễm Campylobacter, Salmonella tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn vi khuẩn đóng vai trò quan trọng tiêu chảy cấp có nguồn từ động vật - Triển khai phương pháp MLST với lấy mẫu thu thập đa dạng vị trí, thời gian, phẩm vật (thịt sống, sữa, nước, môi trường) để khảo sát dịch tễ học phân tử vi khuẩn Campylobacter, Salmonella vụ dịch tiêu chảy Tp Hồ Chí Minh điạ phương khác Việt Nam nhằm có biện pháp đối phó hữu hiệu - Xây dựng khuyến cáo sử dụng kháng sinh hợp lý cho người động vật nhằn hạn chế tượng kháng thuốc gia tăng 24 ... thấy người động vật là: 1 1, 1 7, 1 9, 3 4, 4 0, 4 6, 20 3, 29 2, 35 9, 42 3, 46 9, 149 9, 154 1, 154 4, 1547 Ở người, kiểu trình tự 34 chiếm ưu với 1 8,7 5% (18 chủng 19 phân lập) so với 2,4 2% ( chủng phân lập) ... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: - Campylobacter spp - Salmonella spp 2.1.1 Phân lập từ người Chủng Campylobacter spp Salmonella spp nghiên cứu phân lập từ 1500 mẫu phân bệnh nhi... 4.1.2 Đặc tính kháng thuốc Salmonella spp Kết khảo sát độ nhạy 12 loại kháng sinh khác cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh Salmonella phân lập động vật cao tỷ lệ kháng thuốc chủng phân lập người Nghiên