Xác định serovar và mối quan hệ di truyền của các chủng xoắn khuẩn Leptospira phân lập từ lợn

Để giải quyết vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài “ Xác định serovar và mối quan hệ di truyền của các chủng xoắn khuẩn Leptospira phân lập từ lợn’’ với 2 mục tiêu chính sau : + Xác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

-oOo -

NGUYỄN HỒ DUNG NGHI

XÁC ĐỊNH SEROVAR VÀ MỐI QUAN HỆ

DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG XOẮN

KHUẨN LEPTOSPIRA PHÂN LẬP TỪ LỢN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn: TS VÕ THÀNH THÌN

ThS NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Nha Trang – 06/2013

LỜI CẢM ƠN

Sau 3 tháng thực tập tại Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y

miền Trung, dưới sự hướng dẫn của thầy TS Võ Thành Thìn và ThS Nguyễn

Thị Kim Cúc cùng các anh, chị ở Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y

miền Trung và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường đại học Nha Trang tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này

Qua đây, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS Võ Thành Thìn - phó Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung và ThS

Nguyễn Thị Kim Cúc – giảng viên Bộ môn công nghệ Sinh học, Viện Công

nghệ Sinh học và Môi Trường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình

Tôi cũng xin chân thành cản ơn các cấp lãnh đạo phân viện Thú Y Miền Trung đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành thực tập, đến ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị Phạm Trung Hiếu, Nguyễn Thị Thắm, Lê Đình Hải, Phạm Duy Hưng trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi hoàn thiện về một

số kỹ năng và thao tác trong phòng thí nghiệm và dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn Phan Thị Ngọc Ẩn, Nguyễn Thị Thu Hằng đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình và các bạn sinh viên cùng lớp 51CNSH đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ và đồng hành chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi trong suốt 4 năm học và trong thời gian thực hiện đề tài này Đấy thật sự là điều quý báu vô giá đối với tôi

Một lần nữa, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến tất cả

Nha Trang, tháng 6 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hồ Dung Nghi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LEPTOSPIRA 2

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới .2

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 3

1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA 4

1.2.1 Đặc điểm cấu tạo và hình thái .4

1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 5

1.2.3 Sức đề khángcủa Leptospira 5

1.2.4 Một số yếu tố độc lực 6

1.2.5 Các serovar Leptospira 7

1.3 Phương pháp xác định serovar Leptospira .8

1.3.1 Phương pháp huyết thanh học .8

1.3.2 Phản ứng ELISA (Enzyme Liked Immunosorbent Assasy) 9

1.3.3 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFAT) 9

1.3.4 Phản ứng vi ngưng kết (MAT) 9

1.4 Xác định một số đặc tính di truyền của các chủng xoắn khuẩn Leptospira .11

1.4.1 Xác định các serovar thuộc nhóm độc lực cao 11

1.4.2 Xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng xoắn khuẩn Leptospira 12

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 14

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 14

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 14

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14

2.3.1 Hóa chất, sinh phẩm .14

2.3.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 16

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.4.1 Xác định các serovar Leptospira 17

2.4.2 Phương pháp xác định khả năng mang gen LipL32 18

2.4.2.1.Tách chiết DNA 18

2.4.2.2 Thực hiện phản ứng PCR 19

2.4.3 Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng Leptospira 20

2.4.3.1 Chiết tách ADN mẫu 21

2.4.3.2 Thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại gen 16s rRNA 21

2.4.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR 21

2.4.3.4 Thực hiện phản ứng PCR để giải trình tự gen 21

2.4.3.5 So sánh trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA 22

2.5 XỬ LÍ SỐ LIỆU 23

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SEROVAR CÁC CHỦNG LEPTOSPIRA 24

3.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ 27

3.2.1 Kết quả phát hiện gen độc lực LipL32 27

3.2.2 Kết quả xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng Leptospira phân lập từ lợn 29

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

4.1.KẾT LUẬN 34

4.2 KIẾN NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số serogroup Leptospira thường gặp của các loài Leptospira 7

Bảng 1.2 Một số serovar Leptospira thường gặp gây bệnh ở vật nuôi 8

Bảng 1.3 Các serovar Leptospira sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán huyết thanh 10

Bảng 2.1 Kháng huyết thanh chuẩn kháng Leptospira dùng trong nghiên cứu 15

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 20

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR phát hiện gen LipL32 của Leptospira 20

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20

Bảng 2.5 Trình tự nucleotide của các cặp mồi dùng để giải trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA 21

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR để giải trình tự gen 22

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR để giải trình tự gen 22

Bảng 2.8 Các chủng Leptospira tham chiếu từ ngân hàng gen 23

Bảng 3.1 Kết quả xác định serovar của các chủng Leptospira phân lập từ lợn 25

Bảng 3.2 Kết quả phản ứng PCR phát hiện gene độc lực LipL32 .29

Hình 3.4 Vị trí các nucleotide khác biệt giữa các trình tự gen 16s RNA các

chủng Leptospira 31 Hình 3.5 Phả hệ của các chủng Leptospira phân lập từ lợn 32

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CSLD : Cơ Sở Dữ Liệu

EMJH : Ellinghausen, Mc Cullough, Johnson, Harris

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IZSVe : Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie LPS : Lipopolysaccharide

MAT : Microscopic Agglutination Test

PCR: Polymerase Chain Reaction

LỜI MỞ ĐẦU

Ngành chăn nuôi là một trong những ngành đóng vai trò quan trọng đối với một nước nông nghiệp như Việt Nam, đặc biệt là chăn nuôi gia súc Ngành chăn nuôi lợn với tổng đàn lợn đạt 27,8 triệu con, tổng lượng thịt cung cấp ước tính đạt 3,2 triệu tấn (tính đến cuối năm 2011) [1], là nguồn cung cấp thịt chủ yếu nhất cho thị trường cả nước

Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn luôn phải đối mặt với nhiều khó khăn như tình hình dịnh bệnh cũ và mới xảy ra quanh năm Đặc biệt, bệnh Leptospirosis do

xoắn khuẩn Leptospira đã tồn mấy chục năm cho tới nay vẫn không kiểm soát

được các nguồn lây nhiễm, gây ra nhiều thiệt hại nặng nề do cơ chế gây bệnh và

sự phá hủy các tổ chức bên trong cơ thể của Leptospira đến nay vẫn chưa được

làm rõ Bệnh với các triệu chứng lâm sàng như sốt, vàng da, viêm gan, thận, rối

loạn tiêu hóa, rối loạn sinh sản Leptospira gây bệnh ở nhiều đối tượng gia súc,

vật nuôi, và kể cả con người với khả năng lây lan cao nên không chỉ gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Do đó, tiến

hành nghiên cứu về Leptospira là vô cùng cấp bách

Mỗi loại gia súc đều có thể nhiễm một hay nhiều serovar xoắn khuẩn khác

nhau Leptospira gây bệnh trên lợn có nhiều serovar, mỗi serovar có một đặc tính riêng về tính kháng nguyên và hệ gen Leptospira ở lợn khu trú một lượng lớn

trong thận và thải ra ngoài qua nước tiểu, đây là nguồn lây nhiễm nguy hiểm cho người và vật nuôi Việc xác định các serovar gây bệnh trên lợn từ mẫu thận và mối quan hệ di truyền giữa chúng để từ đó có những nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra biện pháp phòng chống lại bệnh xoắn khuẩn trên lợn và ngăn chặn lây lan qua người là vô cùng quan trọng và cấp thiết Để giải quyết vấn đề trên, chúng tôi

tiến hành đề tài “ Xác định serovar và mối quan hệ di truyền của các chủng

xoắn khuẩn Leptospira phân lập từ lợn’’ với 2 mục tiêu chính sau :

+ Xác định serovar của các chủng Leptospira phân lập từ lợn

+ Xác định mức độ tương đồng gen và mối quan hệ di truyền của các

chủng Leptospira phân lập từ lợn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LEPTOSPIRA

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Leptospira là loại xoắn khuẩn gây bệnh Leptospirosis đã được nghiên cứu

từ lâu trên thế giới Leptospira được chia thành 2 nhóm là nhóm có khả năng gây

bệnh và và nhóm hoại sinh (saprophyte strain) không gây bệnh Có 13 loài

Leptspira có khả năng gây bệnh là L alexanderi, L alstonii (genomospecies 1),

L borgpetersenii, L inadai, L interorgrans, L fainei, L kirschneri, L licerasiae, L noguchi, L santarosai, L terpstrae (genomospecies 3), L weilii, L wolffi với hơn 260 serovar khác nhau Trong đó 2 loài L interorgrans và L fainei Loài được xem là có độc lực cao nhất đối với người và động vật [12][37][44] Nhóm không có độc lực gồm các loài L biflexa, L meyeri, L yanagawae (genomospecies 5), L kmetyi, L vanthielii (genomospecies 4) và L wolbachii với hơn 60 serovar [12]

Năm 1886, nhà khoa học Đức Weil đã phát hiện ra bệnh Leptospirosis ở người lần đầu tiên, nhưng đến năm 1915 các nhà khoa học Nhật Bản và Pháp mới tìm thấy xoắn khuẩn phân lập từ chuột lang gây bệnh vàng da và chảy máu

khi gây nhiễm cho người và động vật là L interograns [29]

Năm 1917, Noguchi đã tìm thấy trên chuột hoang ở Mỹ chủng Leptospira

có đặc tính hình thái và sinh học và miễn dịch học giống như chủng đã phát hiện

tại Nhật là L icterohaemorrhagiae [35] Năm 1918 các nhà khoa học Nhật phân lập được xoắn khuẩn gây bệnh “sốt mùa thu’’ ở lợn là L autumnalis

Các yếu tố độc lực của Leptospira cũng được nghiên cứu Năm 1997 Merien và cộng sự đã chứng minh được yếu tố độc lực của Leptospira chi phối

khả năng xâm nhiễm vào tế bào Vero và khả năng tiêu diệt tế bào lạ của chúng Đến năm 2000, Merien phát hiện ra loại protein liên quan đến độc lực này và chỉ

được tìm thấy trên các chủng Leptospira có độc lực [32] Năm 2006, Bulach phát

hiện enzyme sphingomyelinase quyết định khả năng gây dung huyết của

Leptospira ở nhiều serovar khác nhau [17][40]

Về mặt di truyền, Fukunaga xác định được genome của Leptospira có kích thước khoảng 3,9 – 4,6 Mb, có 2 hệ gen là 16sRNA và 23SrRNA [15][23] Một

số gen đã được dòng hóa và phân tích chức năng như gen quy định quá trình tổng hợp acid amin, rRNA, protein ở ribosome, RNA-polymerase, DNA repair, heat shock protein, shingomyelinase, hemolysins, protein màng ngoài, quá trình sinh

tổng hợp LPS [12][30] Gen LipL32 qui định protein gây độc LipL32 đặc trưng cho các Leptospira nhóm có độc lực [18]

Nghiên cứu về cây phát sinh loài trên 2 gen LipL32 và 16s RNA của Leptospiracho thấy có sự tương đồng cao giữa 2 cây phát sinh loài, điều này chỉ

ra rằng các chủng Leptospira có sự khác biệt về trình tự gen là kết quả của trôi

dạt di truyền [18]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh do Leptospira được Ragiot và Souchard phát hiện lần

đầu tiên trên người năm 1931 [2] Nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai và Nguyễn

Ngọc Hải cho thấy chuột là nguồn lưu trữ và lây nhiễm tự nhiên Leptospira đối

với gia súc và con người [5][6] Theo Vũ Đình Hưng, các loại gia súc nhiễm

Leptospira với tỉ lệ rất cao, ở trâu 35,1 %, ở lợn 22, 9%, ở chó 26,47 %, đặc biệt

với công nhân chăn nuôi tỉ lệ nhiễm lên đến 56% [11] Nghiên cứu của Vũ Đình Hưng cho thấy gia súc thường mắc bệnh vào mùa mưa từ tháng 4 - 9 chiếm tỉ lệ 26,7 % [10] Theo Nguyễn Văn Bình, tỉ lệ nhiễm của trâu bò ở các khu vực nội, ngoại thành Hà Nội khá cao là 46,7 % và con cái tỉ lệ nhiễm cao hơn con đực [7] Tại Đắc Lăk, nhóm nghiên cứu Hoàng Mạnh Lâm xác định tỉ lệ nhiễm

Leptospira trên gia súc là 35,3 % với sự lưu hành của 15 serovar Leptospira, trong đó có 4 loại chưa công bố ở Việt Nam là L djasiman, L javanica, L panama và L semaranga [4]

Theo Boqvist, tỉ lệ nhiễm Leptospira trên lợn nái phía nam là khá cao: L autumnalis 32 %, L bratislava 29 % , L icterohaemorrhagiae 27 %, L grippotyphosa 13 %, L tarassovi 13 %, L pomona 5 % [3] Nghiên cứu của Võ

Thành Thìn và cs sử dụng phương pháp vi ngưng kết trên phiến kính (MAT), đã

xác định được tỷ lệ nhiễm Leptospira trên đàn lợn nái tại Khánh Hòa là 17,7%

Tỷ lệ này phụ thuộc vào điều kiện chăn nuôi và mùa vụ tại địa phương Có sự lưu

hành của 10 serovar Leptospira trên đàn lợn, tỉ lệ nhiễm cao nhất là các serovar Pomona (51,2%), Panama (19,5%), Icterohaemorrhagiae, Autumnalis [8]

Các nghiên cứu trên cho thấy tỉ lệ gia súc nhiễm Leptospira ở Việt Nam là

rất cao, đặc biệt là trên lợn, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi Tuy nhiên, cho đến năm 2012, chưa có nghiên cứu nào về mối quan hệ di truyền giữa các

chủng Leptospira gây bệnh trên lợn

1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA

1.2.1 Đặc điểm cấu tạo và hình thái

Hình 1.1 Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dưới kính hiển vi điệntử

động mạnh theo kiểu xoáy và bật thẳng lò xo do cấu tạo ở mỗi đầu có một nội

roi Màng trong của Leptospira gồm cytoplasmic liên kết chặt chẽ với lớp vỏ

peptidoglycan và được bao phủ bởi lớp màng ngoài gồm protein, lipid và Lipopolysaccharide (LPS) [24] LPS tạo nên tính kháng nguyên chủ yếu của

Leptospira, có đặc tính miễn dịch và cấu trúc tương tự như LPS của các vi khuẩn

gram âm nhưng độc tính thấp hơn [30] Ngoài ra, các loại protein cấu trúc và

protein chức năng cũng góp phần tạo nên lớp màng ngoài của Leptospira, chủ

yếu là các lipoprotein [26]

Leptospira không thể quan sát được khi nhộm Gram, chỉ có thể quan sát

được dưới kính hiển vi quang học nền đen, kính hiển vi quang học phản pha, hoặc theo phương pháp nhuộm bạc cổ điển Warthin – Starry

1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy tối ưu để Leptospira sinh trưởng: môi trường đặc hiệu,

hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ khoảng 28-30oC , pH từ 7,2 – 7,6 Trong điều kiện tối

ưu, thời gian thế hệ của Leptospira là 3 – 15 giờ nên thời gian nuôi cấy và phân

lập thường rất lâu, từ 2 – 30 ngày [21]

Môi trường nuôi cấy Leptospira bắt buộc phải có các chất dinh dưỡng sau:

acid béo mạch dài, vitamin B2, B12, muối amonium [21] Môi trường đặc hiệu

cho Leptospira được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là EMJH (Ellinghausen, Mc

Cullough, Johnson, Harris) với thành phần chính là acid oleic, albumin huyết thanh bò và polysorbate (Tween 80) [30] Albumin huyết thanh bò có vai trò như một chất giải độc và Tween 80 là nguồn cung cấp acid béo Một vài chủng

Leptospira cần bổ sung pyruvate hoặc huyết thanh thỏ vào môi trường khi nuôi cấy Khi phân lập Leptospira từ mẫu bệnh phẩm, có thể bổ sung kháng sinh vào

môi trường như 5 – fluorouracil, gentamincin, nalidixic acid hoặc rifampicin [21]

1.2.3 Sức đề khángcủa Leptospira

Xoắn khuẩn là loài có sức chống chịu kém với các tác nhân môi trường

bên ngoài Leptospira có sức đề kháng cao hơn so với các xoắn khuẩn khác, có

thể sống tự do trong môi trường đất, nước ngọt, nước mặn nhưng vẫn rất nhạy cảm với các yếu tố bên ngoài như: ánh sáng, nhiệt độ, kháng sinhvà những thuốc sát trùng thông thường [16][45][46]

Với nhiệt độ: ở 56oC xoắn khuẩn bị tiêu diệt trong 30 phút, ở 60oC xoắn khuẩn chết ngay; ở nhiệt độ 20oC xoắn khuẩn chết trong 4 giờ Nhưng ở nhiệt độ thấp vi khuẩn có khả năng tồn tại trong một thời gian dài có khi tới hàng năm [22]

Với ánh sáng: dưới ánh sáng chiếu trực tiếp, xoắn khuẩn chết trong vòng

30 phút đến 2 giờ, với tia tử ngoại phải sau 4 giờ xoắn khuẩn mới bị tiêu diệt hoàn toàn [16]

Với các chất kháng sinh: các xoắn khuẩn mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh như penicillin, amocicillin, ampicillin

Với hoá chất và thuốc sát trùng: Leptospira bị tiêu diệt nhanh chóng bởi

hoá chất như: dung dịch xút 5%, cồn 20%, dung dịch phenol 0,5%, acid chlohydric 2%, crezyl 5%, formol 0,25%, acid phenic 5%

LPS của Leptospira có thành phần hóa học và đặc tính kích thích miễn

dịch giống vi khuẩn gram âm Tuy nhiên, độc tính của chúng trên thỏ, trên chuột, tương tác với tế bào lympho B yếu hơn so với LPS của vi khuẩn gram âm [38] [43] LPS có tính kháng nguyên rất mạnh và là kháng nguyên chủ yếu của

Leptospira

Khả năng dung huyết của Leptospira có ở nhiều serovar khác nhau và có

ít nhất 7 gen sphA-like được phát hiện ở các chủng Leptospira có độc lực, bao

gồm cả gene sphH [17]

Lipoprotein bề mặt Loa22 cũng là một yếu tố độc lực quan trọng của

Leptospira, đóng vai trò chủ chốt trong cơ chế gây bệnh của xoắn khuẩn này

trình gây bệnh của Leptospira [33]

Protein bề mặt LipL32 là độc lực đặc trưng và mang tính kháng nguyên

của Leptospira, có khả năng bám lên lamini, collagen và fibronectin của vật chủ

và có tính bảo toàn cao ở các loài Leptospira gây bệnh [27] [28] LipL32 có mặt

trong vật chủ suốt quá trình xâm nhiễm của Leptospira [18] Cũng giống như

protein giải phóng bề mặt (Lig–protein có khả năng bám lên fibronectin của vật

chủ), LipL32 chỉ giải phóng mạnh trên bề mặt khi Leptospira nhân lên trong cơ

thể vật chủ, trên môi trường nuôi cấy nhân tạo LipL32 chỉ được giải phóng rất ít

Do đó Leptospira thường mất khả năng gây bệnh mặc dù cấu trúc kháng nguyên

không thay đổi khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo [31] [34]

1.2.5 Các serovar Leptospira

Hiện nay đã phát hiện được trên 260 serovar khác nhau dựa vào cấu trúc đặc hiệu của kháng nguyên LPS (Lipopolysaccharide) trên bề mặt tế bào và cấu

trúc di truyền của Leptospira [30]

Bảng 1.1 Một số serogroup thường gặp của các loài Leptospira [30]

1 L interrogans

Icterohaemorrhagiae, Canicola, Ponoma, Australis, Autumnalis, Pyrogenes, Grippotyphosa, Djasiman, Hebdomadis, Sejroe, Bataviae, Ranarum, Luoisiana, Mini, Sarmin, Panama, Cynopteri, Tarassovi, Ballum, Celledoni, Manhao, Shermani, Hurstbrige

2 L noguchii Panama, Autumnalis, Pyrogenes, Tarassovi, Bataviae,

Lousiana, Australis, Shermani, Djasiman, Ponoma

3 L santarosai

Shermani, Hebdomadis, Tarassovi, Pyrogenes, Autumnalis, Bataviae, Mina, Grippotyphosa, Sejroe, Ponoma, Javanica, Sarmin, Cynopteri

4 L meyeri Ranarum, Semaranga, Sejroe, Mini, Javanica

10 L weilii Celledoni, Icterohaemorrhagiae, Sarmin, Javanica, Mini,

Tarassovi, Hebdomadis, Pyrogenes, Manhao, Sejroe

11 L inadai Lyme, Shermani, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Tarassovi,

Manhao, Canicola, Panama, Javanica

12 L parva Turneria

Các serovar gây bệnh thường mang tính đặc trưng loài như Canicola chủ yếu gây bệnh ở chó, Bratislava ở ngựa và lợn, Hardjo ở bò, Australis và Pomona

ở lợn [14] [16] [19] [20] [25]

Bảng 1.2 Một số serovar thường gặp gây bệnh ở vật nuôi [12], [21],

[30], [39]

1 Bò Hardjo, Pomona, Australis, Bratislava, Sejroe,

Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola

2 Lợn Bratislava, Australis, Pomona, Grippotyphosa, Canicola,

1.3 Phương pháp xác định serovar Leptospira

1.3.1 Phương pháp huyết thanh học

Trong chẩn đoán bệnh Leptospirosis, huyết thanh học là phương pháp phổ biến nhất vì nó không chỉ xác định được vi khuẩn gây bệnh mà còn cho biết

serovar Leptospira nào gây bệnh Đối với trường hợp cần xác định serovar của các chủng Leptospira chưa biết, cần có huyết thanh chứa kháng thể chuẩn đặc

hiệu với các serovar đã biết Có nhiều loại phản ứng huyết thanh khác nhau nhưng đều dựa trên nguyên tắc cơ bản là liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể

- Phản ứng vi ngưng kết tan – MAT với kháng nguyên sống

- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF - Immuno Fluorescence)

- Phản ứng ELISA

Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học có ý nghĩa rất lớn trong thực tế, nghiên cứu và trong điều tra cơ bản vì cách làm đơn giản và cho kết quả khá

chính xác Bằng phương pháp này nó không chỉ cho biết serovar gây bệnh mà còn phát hiện được những gia súc mắc bệnh nhưng không biểu hiện triệu chứng lâm sàng

1.3.2 Phản ứng ELISA (Enzyme Liked Immunosorbent Assasy)

Là phản ứng miễn dịch gắn enzyme được sử dụng để phát hiện kháng

nguyên Leptospira hoặc kháng thể kháng Leptospira tùy theo mục đích Trong

trường hợp cần xác định serovar, dùng kháng thể biết trước để tìm kháng nguyên

Kháng thể này liên kết đặc hiệu với các serovar Leptospira đã biết phổ biến gây

bệnh cho gia súc và người Cố định kháng nguyên - kháng thể lên vi giếng Nếu

có kháng nguyên tương ứng sẽ có kết hợp kháng nguyên - kháng thể không bị rửa trôi Cho kháng kháng thể có gắn enzyme tương ứng vào, nếu đã có kết hợp kháng nguyên - kháng thể thì sẽ có tiếp kết hợp kháng nguyên - kháng thể - kháng kháng thể, không bị rửa trôi Cho cơ chất tương ứng vào, enzym sẽ phân hủy cơ chất thành sản phẩm có màu, dùng phổ quang kế để định lượng phản ứng

1.3.3 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFAT)

Là phản ứng dựa trên nguyên tắc kháng nguyên - kháng thể, trong đó

kháng nguyên hoặc kháng thể kháng Leptospira được nhuộm màu huỳnh quang

(thường dùng Fluorescein isothiocyanat) có màu xanh lục, Rodamin có màu đỏ gạch Kháng nguyên hoặc kháng thể chẩn đoán (nghi ngờ) được cố định trên phiến kính, nhỏ kháng thể hoặc kháng nguyên đã nhuộm màu huỳnh quang lên, nếu tương ứng sẽ có phản ứng gắn kết kháng nguyên – kháng thể, rửa không trôi, soi kính hiển vi huỳnh quang thấy phát sáng Ngược lại nếu không tương ứng khi rửa sẽ bị trôi, soi kính không thấy phát sáng Đây là phản ứng cho kết quả nhanh, chính xác được dùng nhiều trong chẩn đoán huyết thanh

1.3.4 Phản ứng vi ngưng kết (MAT)

Nguyên tắc của phản ứng MAT là sự liên kết trực tiếp giữa kháng thể

kháng Leptospira với kháng nguyên là các chủng Leptospira sống tạo nên các

ngưng kết có thể phát hiện được dưới kính hiển vi

Kháng nguyên của Leptospira chủ yếu là các protein màng ngoài như LPS

và lipoprotein LipL32 Trong đó, các epitopes LPS là các kháng nguyên chính kích hoạt đáp ứng miễn dịch Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho kháng nguyên

Leptospira phần lớn là kháng thể IgM và IgG [13] Do đó các phương pháp huyết

thanh học thường sử dụng hai loại kháng thể này để chẩn đoán bệnh hoặc phát

hiện các serovar Leptospira

Phản ứng MAT được sử dụng trong điều tra huyết thanh học toàn đàn, kháng nguyên phải sống, không tự ngưng kết và có ít nhất từ 150 – 300

Leptospira trên một vi trường Đối với chẩn đoán bệnh, huyết thanh chẩn đoán

được pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10 → 1/50 để thực hiện phản ứng MAT

định tính (tức là chỉ xác định xem trong huyết thanh có kháng thể Leptospira hay

không để loại bỏ những mẫu huyết thanh âm tính, chỉ giữ lại các mẫu huyết thanh (+) để làm phản ứng MAT định lượng) Huyết thanh (+) được pha loãng, sau đó chia ra các lỗ trên khay nhựa, số lỗ tương ứng với số Serovar đã có, nhỏ

tiếp các Serovar Leptospira tương ứng lên các lỗ khay nhựa, nếu có ngưng kết ta

có thể biết gia súc đó bị Leptospira do serovar nào gây ra Nâng hiệu giá ngưng

kết của các serovar đó lên các mức: 1/800, 1/1600, 1/3200 để xác định tính chất

và mức độ của bệnh

Đối với nghiên cứu phát hiện serovar của các chủng Leptospira đã có, cần

có bộ kháng thể chuẩn Trong tổng số các serovar Leptospira, có 12 serovar gây

bệnh chủ yếu cho động vật và người Mỗi serovar này lại mang tính kháng nguyên đại diện cho một nhóm Các serovar được sử dụng chủ yếu trong chẩn

đoán huyết thanh học hiện nay gồm 12 serovar Leptospira là:

Bảng 1.3 Các serovar sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán huyết thanh

Các serovar thường gặp như trên đã có bộ huyết thanh chứa kháng thể

chuẩn để sử dụng cho trường hợp phát hiện serovar các chủng Leptospira phân

lập từ động vật, người

1.4 Xác định một số đặc tính di truyền của các chủng xoắn khuẩn Leptospira

Leptospira là xoắn khuẩn gây bệnh tỉ lệ cao ở lợn Sự đa dạng về chủng loại và tính kháng nguyên của Leptospira gây khó khăn trong công tác phòng

chống bệnh Vì thế việc đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng vi khuẩn

phân lập từ lợn là cơ sở cho việc lựa chọn chủng Leptospira điển hình để tiến

hành nghiên cứu tiếp sản xuất vaccine, thuốc đặc trị

1.4.1 Xác định các serovar thuộc nhóm độc lực cao

Các chủng Leptospira phân lập từ lợn có thể thuộc nhóm có độc lực gây

bệnh hoặc thuộc nhóm hoại sinh không có độc lực Nếu các chủng đều cùng một

nhóm chứng tỏ các chủng Leptospira trên lợn có quan hệ di truyền gần Gen LipL32 qui định tính độc lực của Leptospira và chỉ có ở nhóm có độc lực cao

Dùng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu được thiết kế trên gen LipL32 để kiểm tra

các chủng Leptospira phân lập từ lợn thuộc nhóm nào Nếu phản ứng dương tính tức chủng Leptospira đó thuộc nhóm có độc lực, nếu phản ứng âm tính chủng đó

thuộc nhóm không có độc lực

LipL32 có khối lượng 32kDa, là một trong những loại protein có nhiều

nhất trong Leptospira, có tính kháng nguyên mạnh [28] LipL32 có là lipoprotein

có trong cấu trúc màng ngoài của Leptospira, có tính bảo tồn cao cả về mặt di

truyền lẫn miễn dịch [45], do đó chúng triển vọng cao trong ứng dụng sản xuất vaccine Vì các đặc tính trên, gen LipL32 mã hóa cho protein LipL32 là gen tiêu

biểu để chẩn đoán bệnh do Leptospira bằng phương pháp PCR

Toàn bộ cấu trúc gen LipL32 đã được xác định, chúng có 816 base, mã hóa cho 1 đoạn polypeptide gồm 272 acid amine, trong đó chứa 1 tín hiệu peptide

có 19 acid amine gắn với 1 tín hiệu lipoprotein chỉ vị trí phân cắt peptidase[37][28]

Một nghiên cứu trên các trình tự gen của 6 chủng Leptospira gồm: L kirschneri serovar grippotyphosa chủng RM52, L interrogans serovar lai, L.interrogans serovar pomona chủng RZ11, L noguchii serovar fortbragg chủng

Fort Bragg, L borgpetersenii serovar hardjo dòng 203, và L santarosai serovar Tropica So sánh các trình tự DNA LipL32 6 chủng Leptospira, cho thấy mức độ

bảo tồn gen giữa các chủng rất cao, với mức tương đồng trình tự DNA trung bình

là 96,4% (khoảng 93,5-99,6%) Hầu hết các trình tự sai khác đều là gen im lặng,

cho thấy có áp lực tiến hóa đã tác động lên hệ gen của Leptospira để duy trì

protein LipL32 So sánh trình tự acid amine của 6 LipL32 trên cho thấy tỉ lệ tương đồng acid amin trung bình là 97,8% (khoảng 95,2 - 98,.6%) Sử dụng các trình tự trên để thực hiện phân tích cây phát sinh loài Kết quả cho thấy có sự tương đồng cao giữa 2 cây phát sinh loài thực hiện trên gen LipL32 và 16s RNA

của Leptospira, điều này chỉ ra rằng các chủng Leptospira có sự khác biệt về

trình tự gen là kết quả của trôi dạt di truyền [13][18]

1.4.2 Xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng xoắn khuẩn Leptospira

Gen 16S và 23S rRNA là 2 gen có chức năng cần thiết cho sự sống của vi khuẩn, vừa có vùng bảo tồn và vừa có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau, giúp cho việc định danh hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn Các gen này đã được giải trình tự và lưu trữ trong các CSDL sinh học trực tuyến

Đối với hầu hết các loại vi khuẩn, phân tích trình tự gen 16s rRNA có thể kết luận về giống hoặc loài, cũng như vị trí của chúng trong bảng phân loại và mối quan hệ họ hàng giữa chúng, là một phương pháp phổ biến và hiệu quả

Nghiên cứu trình tự 16s rRNA của 43 chủng, đại diện cho tất cả 17 loài

Leptospira cho thấy bộ gen Leptospira gồm 2 gen 16s RNA không liên kết chặt

với nhau [13] Trình tự 16s rRNA của các chủng trên đã được giải mã và lưu trữ trong ngân hàng gen Chiều dài trung bình của các gen trên là 1430bp So sánh các trình tự gen cho thấy, các serovar trong cùng 1 loài có trình tự gen gần hoàn toàn giống nhau (trung bình chỉ có 0.2 bases khác nhau trong số 1430 bases so sánh) Cây phát sinh loài được phân tích từ 16s rRNA của 43 chủng trên có 5 nhánh, trong đó có 2 nhánh lớn là nhánh gây bệnh và nhánh không gây bệnh, tỉ lệ tương đồng trình tự gen giữa các loài trong nhóm gây bệnh rất cao (≥ 98.6%), điều này tái khẳng định mức độ bảo tồn cao của các loài xoắn khuẩn [13]

Những nghiên cứu lai DNA – DNA đã cho phép tập hợp các Leptospira

thành các loài cùng gen đơn bội, nhưng thiếu mối tương quan hệ thống giữa các loài cùng gen đơn bội với những chủng huyết thanh (serovar) cho sự phân loại huyết thanh học còn đang được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu lâm sàng

và dịch tễ học [44] Nghiên cứu này xác định được mối tương quan hệ thống giữa các chủng huyết thanh phân lập từ lợn và quan hệ di truyền giữa chúng dựa trên phân tích gen LipL32 và 16s rRNA

Để xác định cụ thể mức độ quan hệ di truyền của các chủng Leptospira

phân lập từ lợn, cần so sánh các trình tự gen và tính toán mức độ tương đồng giữa chúng Hệ gen bảo tồn 16s RNA mang tính đặc trưng cao của loài, thích hợp

là đối tượng phân tích để xác định mức độ quan hệ di truyền Giải trình tự gen 16s RNA của các chủng, sau đó tiến hành xử lý, so sánh và phân tích các trình tự này bằng phần mềm BioEdit để cho ra kết quả mức độ tương đồng Mức độ tương đồng cao cho thấy các chủng có mối quan hệ di truyền gần và ngược lại

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ ngày 25/2/2013 đến ngày 31/5/2013

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Nghiên cứu vi trùng – Phân viện thú y miền Trung, Nha Trang – Khánh Hòa

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng Leptospira phân lập từ lợn

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác định serovar của các chủng xoắn khuẩn Leptospira

- Xác định một số đặc tính di truyền phân tử của các chủng xoắn khuẩn

Các loại hóa chất, sinh phẩm dùng phản ứng MAT:

o Nước muối sinh lí

o Bộ kháng huyết thanh chuẩn của 15 serovar Leptospira do Viện IZSVe

o Môi trường nuôi cấy Leptospira ( EMJH ) dạng lỏng

Các loại hóa chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR

o Nước

o GoTaq Green master mix (Promega, USA)

o Mồi xuôi và mồi ngược (IDT, USA)

o Đối chứng dương

o Đối chứng âm

o DNA Marker (100bp, Promega)

Hóa chất dùng cho điện di

o Đệm TBE 10X

o Agarose

o Thuốc nhuộm ethidium bromide

2.3.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

Dùng cho phản ứng MAT

Micropipette các loại

Ống eppendorf các loại vô trùng

Đầu típ các loại vô trùng

Kính hiển vi điện tử nền đen Trung Quốc

Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)

Dùng cho phản ứng PCR và điện di

Đầu típ các loại vô trùng

Micropipette các loại vô trùng

Ống eppendorf các loại vô trùng

Găng tay chuyên dụng

Máy li tâm lạnh Eppendor MiKro 22R (Hattich – Đức )

Máy Block nhiệt Thermo block NB_305TB, N_BioTEX, Korea

Máy vortex VWR_International

Máy PCR PX2 (Thermo electron - USA)

Máy điện di Apelex PS 304 minipac II

Cân phân tích 324S, Sartorius, Đức

Kính hiển vi điện tử nền đen Trung Quốc

Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Xác định các serovar Leptospira

Serovar của các chủng Leptospira được xác định bằng phương pháp vi

ngưng kết MAT (Microscopy agglutination test) với bộ kháng huyết thanh chuẩn gồm 15 serovar (bảng 2.1)

Các chủng Leptospira phải được cấy chuyển 3-4 ngày trước khi thực hiện

phản ứng MAT để xác định serovar Chúng được cấy chuyển trên môi trường EMJH dạng lỏng, mỗi chủng được cấy chuyển lên 2 ống môi trường (1 ống dùng

để làm phản ứng, 1 ống dùng để cấy chuyển lần sau) Chuyển 0,5-1ml canh khuẩn sang ống môi trường mới tương ứng, ủ ấm 30oC trong 3-4 ngày trong điều

kiện tối Sau 3-4 ngày nuôi cấy, Leptospira đang vào pha tăng trưởng, mật độ

cao, phù hợp để làm phản ứng MAT

Tiến hành phản ứng MAT

● Chuẩn bị đĩa 96 lỗ: đánh dấu số đĩa và sơ đồ mẫu

● Cho 50µl huyết thanh có chứa kháng thể chuẩn vào lỗ đĩa tương ứng với từng serovar

● Cho 50µl mẫu kháng nguyên vào lỗ tương ứng với từng serovar

● Đối chứng dương 100%: cho 50µl huyết thanh đối chứng dương vào lỗ tương ứng với từng serovar

● Đối chứng dương 50%: cho 75µl huyết thanh đối chứng dương vào lỗ tương ứng với từng serovar

● Đối chứng âm: cho 50µl nước muối sinh lý vào lỗ tương ứng với từng serovar

● Đậy nắp đĩa và ủ ấm 300C ± 20C trong vòng 2 giờ

● Đọc kết quả: lấy 5-10µl hỗn dịch kháng nguyên-huyết thanh nhỏ lên

kính và đọc kết quả ngưng kết dưới kính hiển vi nền đen với vật kính x10 và x30 Mẫu huyết thanh được đánh giá dương tính khi có sự ngưng kết giữa kháng nguyên - Kháng thể ở mức độ 50% trở lên, xem dưới kính hiển vi thấy hình

2.4.2 Phương pháp xác định khả năng mang gen LipL32

Gen LipL32 được xác định bằng phương pháp PCR [9]

2.4.2.1 Tách chiết DNA

a Nguyên tắc

Mẫu DNA của Leptospira được tách chiết bằng bộ Kit High pure PCR template preparation do Roche (Đức) sản xuất Quy trình chiết tách được thực

hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Mẫu sau khi xử lý được ly giải bằng cách

ủ với đệm ly giải và proteinase K

- Các acid nucleic được gắn vào màng lọc của ống lọc sau đó ta rửa với đệm Inhibitor Removal Buffer để loại các chất gây ức chế PCR

- Rửa loại bỏ muối, protein và các thành phần khác

- Acid nucleic sau khi được tinh sạch sẽ dùng đệm Elution tách ra khỏi màng lọc

DNA trong mẫu tách chiết được kết tủa trên màng lọc

b Quy trình tách chiết

Quy trình tách chiết DNA của Leptospira trong mẫu thận bộ Kit High pure PCR template preparation:

Bước 1: Lấy dịch mẫu

o Cho 200µl canh khuẩn Leptospira vào ống eppendorf mới

Bước 2: Bổ sung 5µl Lysozyme (10mg/ml trong 10mM Tris-HCl, pH 8.0) vào ống chứa dịch mẫu, ủ ấm 370C/15phút

Bước 3: Bổ sung 200µl binding buffer và 40µl Proteinase K  trộn đều ủ ấm 700C/10 phút

Bước 4: Bổ sung 100µl Isopropanol và trộn đều

Bước 5:

o Chèn ống có lọc (ống nhỏ có lọc màu trắng) vào ống thu hoạch (ống lớn)

o Hút 500µl dung dịch mẫu cho vào ống lọc

o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút

Bước 6:

o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch

o Bổ sung 500µl Inhibitor removal buffer vào ống lọc

o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút

Bước 7: Rửa lần 1

o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch

o Bổ sung 500µl Wash buffer vào ống lọc

o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút

Bước 8: Rửa lần 2

o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch

o Bổ sung 500µl Wash buffer vào ống lọc

o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút

Bước 9:

o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch

o Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 giây

o Loại bỏ ống thu hoạch

Bước 10: thu hoạch DNA

o Chèn ống lọc vào eppendorf mới vô trùng

o Bổ sung 200µl Elution buffer vào ống lọc

o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút

o Thu hoạch dung dịch trong ống eppendorf - Đây chính là dịch chứa

DNA của Leptospira

Chú ý: Elution buffer phải được ủ ấm ở nhiệt độ 70 0 C/ 15 phút

Mẫu DNA của Leptospira được bảo quản ở -200C

2.4.2.2 Thực hiện phản ứng PCR

Trình tự mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR

phát hiện gen LipL32 được mô tả trong bảng 2.2, 2.3 và 2.4 Sản phẩm PCR

được diện di trên thạch agarose 1,5% có bổ sung ethidium bromide

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR

Gen Trình tự nucleotide của mồi

(5'  3')

Kích thước sản phẩm (bp)

2.4.3 Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng Leptospira

Quan hệ di truyền giữa các chủng Leptospira được xác định dựa trên kết

quả giải trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA

2.4.3.1 Chiết tách RNA mẫu

RNA mẫu của các chủng Leptospira được chiết tách bằng bộ Kit High pure PCR template preparation (Roche) (mục 2.4.2.1)

2.4.3.2 Thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại gen 16s rRNA

Gen 16s rRNA của xoắn khuẩn Leptosppira được khuếch đại bằng phản

ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu (bảng 2.5), thành phần phản ứng và chu trình

nhiệt như phản ứng PCR xác định gen LipL32 (mục 2.4.2.2) Sản phẩm PCR

được điện di trên thạch agarose 1,5% có bổ sung ethidium bromide

Bảng 2.5 Trình tự nucleotide của các cặp mồi dùng để giải trình tự nucleotide trên

Sản phẩm PCR khuyếch đại gen 16s rRNA được tinh sạch bằng bộ Kit

QIAquick PCR purification (Qiagen) Trình tự các bước tiến hành như theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di trên hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer để kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm Nồng độ ADN sau khi tinh sạch phải đạt 5-20 ng/µl

2.4.3.4 Thực hiện phản ứng PCR để giải trình tự gen

Thực hiện phản ứng PCR để giải trình tự nucleotide 2 chiều gen 16s rRNA bằng bộ Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing với các mồi được trình bày ở bảng 2.5 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR giải trình tự gen được mô tả trong bảng 2.6 và 2.7 Sản phẩm của phản ứng PCR được tiến hành giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL (USA)

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR để giải trình tự gen

Các giai đoạn phản ứng Nhiệt độ

2.4.3.5 So sánh trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA

Trình tự nucleotide thu được tiến hành xử lý, so sánh, phân tích bằng phần mềm BioEdit (version 7.0.9.0) theo phương pháp ClustalW Multiple Alignment /

No Bootstrap NJ tree [43] Xây dựng cây phả hệ dựa trên multiple alignment, chương trình MEGA 5.1 theo thông số Neighbor – Joining (NJ) Độ tin cậy của nhánh phả hệ được tính toán theo chương trình Boostrap với 1.000 lần lặp lại (1.000 replecates)

Trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA của các chủng Leptospira tham

chiếu trên Ngân hàng gen được thể hiện ở bảng 2.8

Bảng 2.8 Các chủng Leptospira tham chiếu từ ngân hàng gen

lực

3 L borgpetersenii Javanica Veldrat

Batavia 46

AY887899

Cao

7 L genomospecies 1 Shichuan 79601T AY631881 Cao

11 L broomii Undesignated 5399T AY796065 Trung bình

13 L genomospecies 3 Holland Waz

HollandT AY631897 Không

15 L genomospecies 4 Hualin CH11 AY631888 Không

16 L genomospecies 5 Saopaulo SaopauloT AY631882 Không

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SEROVAR CÁC CHỦNG LEPTOSPIRA

Nghiên cứu này chủ yếu trên các chủng Leptospira phân lập từ lợn ở các

tỉnh thuộc khu vực tây nguyên và nam trung bộ như Đắc Lắk, Kon Tum, Bình

Định, Khánh Hòa Serovar của các chủng Leptospira này được xác định bằng

phản ứng MAT với bộ kháng huyết thanh chuẩn gồm 15 loại kháng thể kháng

các serovar Leptospira thường gặp trên lợn (bảng 2.1) Phản ứng dương tính (xác

định được serovar tương ứng với kháng huyết thanh chuẩn) khi có sự kết hợp

giữa kháng nguyên (Leptospira) với kháng thể trong mẫu huyết thanh chuẩn và

quan sát như những cụm/đám mây dưới kính hiển vi nền đen (hình 3.1a), số lượng kháng nguyên di chuyển tự do (không ngưng kết) không quá 50%; nếu

không có sự ngưng kết này và kháng nguyên Leptospira di chuyển tự do trong vi trường là phản ứng âm tính (chưa xác định được serovar của chủng Leptospira)

hình 3.1.b

Hình 3.1 Phản ứng MAT xác định serovar của các chủng Leptospira

(a) phản ứng dương tính; (b) phản ứng âm tính

Kết quả xác định serovar các chủng Leptospira phân lập từ lợn được trình

bày ở bảng 3.1, minh họa ở phụ lục 1

Bảng 3.1 Kết quả xác định serovar của các chủng Leptospira phân lập từ lợn

kiểm tra

Số mẫu dương tính Tỷ lệ (% )

kháng thể chuẩn phát hiện được serovar Leptospira với tỉ lệ 84,85 %, trong đó

serovar có tỉ lệ cao nhất là Autumnalis tỉ lệ 24,24% (p<0,05), các serovar tiếp theo lần lượt là: Pomona và Bataviae chiếm 15,15%, Pyrogenes chiếm 9,09%, Bratislava và Panama chiếm 6,06%, Javanicar, Hardjo và Tarassovi chiếm 3,03% (hình 3.2 )

Hình 3.2 Kết quả so sánh tỷ lệ dương tính với các serovar của chủng Leptospira

Kết quả nghiên cứu này có sự tương đồng với các nghiên cứu của các tác

giả khác Nghiên cứu của Boqvist vào năm 2002 cho thấy các serovar Leptospira

nhiễm nhiều trên lợn là Autumnalis 32%, Bratislava 29%, Grippotyphosa 13%, icterohaemorrhagiae 27%, pomona 5%, Tarassovi 13% [ 3] Nghiên cứu của Trương Quang trên lợn cho biết có sự lưu hành của của 10 serovar trong đó có Autumnalis, Pomona, Bataviae, Javanica, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Hebdomadis [47] Nghiên cứu của Hoàng Mạnh Lâm và cộng sự xác

định có 15 serovar Leptospira nhiễm trên lợn , trong đó có Autumnalis, Pomona,

Bataviae, Pyrogenes, Panama, Javanica, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Hebdomadis [7] Từ các kết quả nghiên cứu trên và

của chúng tôi cho thấy 9 serovar Leptospira: Autumnalis, Pomona, Bataviae,

Pyrogenes, Bratislava, Panama, Javanicar, Hardjo,Tarassovi nhiễm phổ biến trên lợn

Trong nghiên cứu trên, có 5 chủng chưa xác định được serovar Dựa vào các nghiên cứu khác cho thấy ngoài 15 serovar nằm trong bộ kháng thể chuẩn còn có các serovar phổ biến khác như Semarnanga, Djasiman, Selroe [7] Do đó,

5 chủng còn lại có thể thuộc các serovar này hoặc thuộc các serovar mới chưa phát hiện tại nước ta