phân lập từ lợn
Trình tự gen 16s rRNA của 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn được xác định và phân tích. Chiều dài các chuỗi trình tự phân tích 1085bp. So sánh các trình tự này với trình tự tham chiếu của các chủng Leptospira cĩ độc lực cao, độc lực trung bình, khơng độc lực đã cĩ trên ngân hàng gen để xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. Các trình tự được so sánh bằng phương pháp giĩng hàng
(alignment) để đánh giá độ tương đồng giữa chúng, sau khi tính được độ tương
đồng, xây dựng dendogram thể hiện sự phân nhĩm các chủng trên cây phân loại dựa trên cơ sở sự khác biệt trình tự gen.
Mối quan hệ di truyền giữa các chủng Leptospira phân lập từ lợn được trình bày ở hình 3.5 cho thấy 33 chủng phân lập từ lợn cĩ mối quan hệ di truyền gần nhất với các chủng cĩ độc lực cao, tiếp đến là các chủng cĩ độc lực trung tính, và cĩ mối quan hệ xa với các chủng khơng cĩ độc lực. Trình tự nucleotide gen 16s RNA của 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn hồn tồn tương đồng nhau, nằm cùng một nhánh trên cây phả hệ (hình 3.5). Trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA khơng cĩ sự sai khác giữa 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn tại khu vực Nam trung bộ - Tây Nguyên (phụ lục 2). Sự sai khác chỉ xảy ra giữa 33 chủng nghiên cứu với các chủng Leptospira nhĩm độc lực cao, nhưng tỉ lệ sai khác là rất thấp. So sánh với chuỗi trình tự gen 8 chủng tham chiếu cho thấy trên 1085bp chỉ cĩ sai khác 1-3 bp. So với L. genomosp chỉ sai khác 3 base tại các vị trí 547, 559, 570. So với L. alexanderi chỉ sai khác 2 base, với L. weilii và L. santarosai chỉ sai khác 1 base (hình 3.4). So với trình tự gen tham chiếu các lồi khác trong nhĩm độc lực, trình tự nucleotide của 33 chủng phân lập từ lợn hồn tồn tương đồng. Trên cây phả hệ, 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn nằm gần nhất với các lồi thuộc nhĩm cĩ độc lực cao.
Đối với các chủng thuộc nhĩm độc lực trung bình, so sánh với 3 chủng tham chiếu cho thấy cĩ sự sai khác 1 base trình tự khi so sánh với L. broomii và
L. inadai serovar Lyme. Đối với các chủng thuộc nhĩm khơng độc lực, so sánh
với 5 chủng tham chiếu cho thấy cĩ sự sai khác 1 base với L. genomosp.4, 2 base với L. genomosp.5. Trên cây phả hệ, 33 chủng Leptospira nghiên cứu nằm xa với 2 nhĩm này (hình 3.5).
Hình 3.4. Vị trí các nucleotide khác biệt giữa các trình tự gen 16s RNA các chủng Leptospira
Hình 3.5. Phả hệ của các chủng Leptospira phân lập từ lợn
Phản ứng PCR xác định gen độc lực LipL32 cho thấy tất cả 33 chủng
Leptospira phân lập từ lợn đều cĩ độc lực, kết quả phân tích cây phân loại di
Chủng Leptospira phân lập Nhĩm Leptospira độc lực cao Nhĩm Lep. độc lực TB Nhĩm Lep. khơng cĩ độc lực
truyền tương thích với kết quả PCR trên, tức 33 chủng Leptospira cĩ mối quan hệ gần với nhĩm Leptospira độc lực cao. Cây phân loại thu được từ nghiên cứu của chúng tơi tái khẳng định tính bảo tồn gen rất cao của các lồi Leptospira. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra các serovar trong cùng một lồi Leptospira
cĩ mối tương đồng gen rất cao, trung bình chỉ sai khác 0,2 base trong 1430 trình tự base khi phân tích trên gen 16s RNA [44 ]. Trong một nhánh, tỉ lệ tương đồng trình tự gen giữa các lồi cũng rất cao, đặc biệt trong nhánh cĩ độc lực, tỉ lệ tương đồng gen giữa 8 lồi trong nhánh cĩ độc lực là ≥98.6% , tức chỉ cĩ 2-20bp khác nhau khi so sánh đoạn trình tự 1431bp. Hai lồi cĩ mối tương đồng gen lớn nhất là L. interrogans và L. kirschneri , chỉ khác biệt 2 bp khi so sánh trình tự 16s RNA dài 1432 bp. Các lồi L. genomosp1, L. noguchi cũng cĩ mối tương đồng gen cao với L. interrogans. Cây phân loại quan hệ di truyền trong nghiên cứu của chúng tơi tương thích với kết quả nghiên cứu của Paul N. Levett và cs [44].
Nghiên cứu của một số tác giả khác cũng cho thấy cây phát sinh lồi của
Leptospiraceae dựa trên phân tích trình tự gen 16s rRNA : Leptospiraceae gồm
cĩ 5 nhánh , trong đĩ cĩ 3 nhánh chính: nhánh các lồi gây bệnh cĩ độc lực cao gồm 8 lồi, điển hình là L. interrogans; nhánh các lồi khơng gây bệnh, điển hình
là L. biflexa ; nhánh trung gian cĩ độc lực trung bình, bao
gồm L. inadai , L. fainei , và L. broomii . Hai nhĩm cịn lại độc lập với 3 nhĩm trên và ít phổ biến hơn, là nhánh các lồi T. parva và nhánh các lồi
Leptonemaillini [44].Trong đĩ, nhánh các lồi gây bệnh là phổ biến hơn cả với
nhiều serovar thường xuyên gặp trên các đối tượng gia súc gia cầm. Hơn nữa, Các lồi Leptospira cĩ tính bảo tồn cao, đặc biệt là các lồi trong cùng 1 nhánh. Trong một nhánh, tỉ lệ tương đồng trình tự gen giữa các lồi cũng rất cao, đặc biệt trong nhánh cĩ độc lực, tỉ lệ tương đồng gen giữa 8 lồi trong nhánh cĩ độc lực là ≥98.6% , tức chỉ cĩ 2-20bp khác nhau khi so sánh đoạn trình tự 1431bp. Hai lồi cĩ mối tương đồng gen lớn nhất là L. interrogans và L. kirschneri , chỉ khác biệt 2 bp khi so sánh trình tự 16s RNA dài 1432 bp. Các lồi L. genomosp1,
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1.KẾT LUẬN
Phương pháp MAT với bộ 15 kháng thể chuẩn phát hiện được serovar
Leptospira với tỉ lệ 84,85 %, trong đĩ serovar cĩ tỉ lệ cao nhất là Autumnalis tỉ lệ 24, 24%, các serovar tiếp theo lần lượt là: Pomona và Bataviae chiếm 15,15%, Pyrogenes chiếm 9,09%, Bratislava và Panama chiếm 6,06%, Javanicar, Hardjo và Tarassovi chiếm 3,03%. %. Các chủng chưa phát hiện được serovar cĩ thể thuộc các serovar mới chưa phổ biến tại Việt Nam.
Phản ứng PCR cho kết quả dương tính với cả 33 chủng Leptospira
phân lập từ lợn, tức tất cả các serovar Leptospira nhiễm trên lợn đều thuộc nhĩm cĩ độc lực gây bệnh.
Cây phân loại được xây dựng từ phân tích trình tự gen 16s rRNA cho thấy 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn cĩ mối quan hệ di truyền gần nhất với các chủng cĩ độc lực cao, tiếp đến là các chủng cĩ độc lực trung tính, và cĩ mối quan hệ xa với các chủng khơng cĩ độc lực. Trong nhánh các lồi cĩ độc lực, lồi cĩ mối quan hệ gần nhất với 33 chủng Leptospira nghiên cứu là L. interrogans, tiếp theo là L.genomosp1, L.kirschneri, L.noguchi.