Gen 16s rRNA của xoắn khuẩn Leptosppira được khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu (bảng 2.5), thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như phản ứng PCR xác định gen LipL32 (mục 2.4.2.2). Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1,5% cĩ bổ sung ethidium bromide.
Bảng 2.5. Trình tự nucleotide của các cặp mồi dùng để giải trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA Gen Trình tự mồi (5' 3') Mồi xuơi CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 16sRNA Mồi ngược CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT 2.4.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR khuyếch đại gen 16s rRNA được tinh sạch bằng bộ Kit QIAquick PCR purification (Qiagen). Trình tự các bước tiến hành như theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di trên hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer để kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm. Nồng độ ADN sau khi tinh sạch phải đạt 5-20 ng/µl.
2.4.3.4. Thực hiện phản ứng PCR để giải trình tự gen
Thực hiện phản ứng PCR để giải trình tự nucleotide 2 chiều gen 16s rRNA bằng bộ Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing với các mồi được trình bày ở bảng 2.5. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR giải trình tự gen được mơ tả trong bảng 2.6 và 2.7. Sản phẩm của phản ứng PCR được tiến hành giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL (USA).
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR để giải trình tự gen TT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
1 Terminator ready reaction mix 8
2 DNA (sản phẩm PCR đã tinh sạch, nồng độ 5-20
ng/µl) 1
3 Mồi (xuơi hoặc ngược, 3,2pmol/µl) 1
4 Nước khử ion 10
Tổng cộng 20
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR để giải trình tự gen Các giai đoạn phản ứng Nhiệt độ
(0C)
Thời gian Số chu kỳ
Tiền biến tính 96 1 phút 1 Biến tính 96 10 giây Bắt cặp 55 5 giây Tổng hợp 60 4 phút 30 Giữ ở 40C
2.4.3.5. So sánh trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA
Trình tự nucleotide thu được tiến hành xử lý, so sánh, phân tích bằng phần mềm BioEdit (version 7.0.9.0) theo phương pháp ClustalW Multiple Alignment / No Bootstrap NJ tree [43]. Xây dựng cây phả hệ dựa trên multiple alignment, chương trình MEGA 5.1 theo thơng số Neighbor – Joining (NJ). Độ tin cậy của nhánh phả hệ được tính tốn theo chương trình Boostrap với 1.000 lần lặp lại (1.000 replecates).
Trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA của các chủng Leptospira tham chiếu trên Ngân hàng gen được thể hiện ở bảng 2.8.
Bảng 2.8. Các chủng Leptospira tham chiếu từ ngân hàng gen
TT Lồi Serovar Chủng Mã số Nhĩm độc
lực
1 L. interrogans Pomona Pomona AY996800 Cao
2 L. noguchii Panama CZ214K AY631886 Cao
3 L. borgpetersenii Javanica Veldrat
Batavia 46
AY887899
Cao
4 L. kirschueri Bim 1051 AY996802 Cao
5 L. alexanderi Nanding M6901 AY996804 Cao
6 L. weilli Celladoni Celladoni AY631877 Cao
7 L. genomospecies 1 Shichuan 79601T AY631881 Cao
8 L. fainei Hurstbridge BKID6 AY996789 Cao
9 L. santarosai Shermani LT821T AY631883 Cao
10 L. inadai Lyme 10T AY631896 Trung bình
11 L. broomii Undesignated 5399T AY796065 Trung bình
12 L. biflexa Patoc Patoc1 AY631876 Khơng
13 L. genomospecies 3 Holland Waz
HollandT AY631897 Khơng
14 L. wolbachii Codice CDCT AY631879 Khơng
15 L. genomospecies 4 Hualin CH11 AY631888 Khơng
16 L. genomospecies 5 Saopaulo SaopauloT AY631882 Khơng
2.5. XỬ LÍ SỐ LIỆU
Số liệu thu thập được sẽ xử lý bằng phần mềm Excel. Dùng kiểm định chi-square bằng Excel để xác định ý nghĩa thống kê. Sự sai khác giữa 2 giá trị cĩ ý nghĩa thống kê khi p <0.05.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SEROVAR CÁC CHỦNG LEPTOSPIRA
Nghiên cứu này chủ yếu trên các chủng Leptospira phân lập từ lợn ở các tỉnh thuộc khu vực tây nguyên và nam trung bộ như Đắc Lắk, Kon Tum, Bình Định, Khánh Hịa. Serovar của các chủng Leptospira này được xác định bằng phản ứng MAT với bộ kháng huyết thanh chuẩn gồm 15 loại kháng thể kháng các serovar Leptospira thường gặp trên lợn (bảng 2.1). Phản ứng dương tính (xác định được serovar tương ứng với kháng huyết thanh chuẩn) khi cĩ sự kết hợp giữa kháng nguyên (Leptospira) với kháng thể trong mẫu huyết thanh chuẩn và quan sát như những cụm/đám mây dưới kính hiển vi nền đen (hình 3.1a), số lượng kháng nguyên di chuyển tự do (khơng ngưng kết) khơng quá 50%; nếu khơng cĩ sự ngưng kết này và kháng nguyên Leptospira di chuyển tự do trong vi trường là phản ứng âm tính (chưa xác định được serovar của chủng Leptospira)
hình 3.1.b.
Hình 3.1. Phản ứng MAT xác định serovar của các chủng Leptospira
(a) phản ứng dương tính; (b) phản ứng âm tính
Kết quả xác định serovar các chủng Leptospira phân lập từ lợn được trình bày ở bảng 3.1, minh họa ở phụ lục 1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định serovar của các chủng Leptospira phân lập từ lợn TT Serovar Số chủng kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (% ) 1 Autumnalis 33 8 24,24 2 Pomona 33 5 15,15 3 Bataviae 33 5 15,15 4 Pyrogenes 33 3 9,09 5 Bratislava 33 2 6,06 6 Panama 33 2 6,06 7 Javanica 33 1 3,03 8 Hardjo 33 1 3 03 9 Tarassovi 33 1 3,03 10 Icterohaemorrhagiae 33 0 0 11 Copenhageni 33 0 0 12 Hedomadis 33 0 0 13 Gryppotyphosa 33 0 0 14 Canicola 33 0 0 15 Australis 33 0 0 Tổng hợp 33 28 84, 85
Kết quả xác định serovar các chủng Leptospira phân lập từ lợn ở bảng 3.1 cho thấy trong 33 chủng nghiên cứu, xác định được 28 serovar Leptospira bằng bộ kháng thể chuẩn, cĩ 5 chủng chưa xác định được serovar, tức 5 chủng này khơng thuộc 15 serovar trong bộ kháng thể chuẩn. Phương pháp MAT với bộ 15 kháng thể chuẩn phát hiện được serovar Leptospira với tỉ lệ 84,85 %, trong đĩ serovar cĩ tỉ lệ cao nhất là Autumnalis tỉ lệ 24,24% (p<0,05), các serovar tiếp theo lần lượt là: Pomona và Bataviae chiếm 15,15%, Pyrogenes chiếm 9,09%, Bratislava và Panama chiếm 6,06%, Javanicar, Hardjo và Tarassovi chiếm 3,03% (hình 3.2 ).
0 5 10 15 20 25 30 Autum nalis Pom ona Bata viae Pyro gene s Brat islav a Pana ma Java nica Har djo Tara ssov i Icte roha emor rhag iae Cope nhag eni Hed omad is Gry ppot ypho sa Cani cola Aus tralis T ỷ lệ ( % )
Hình 3.2. Kết quả so sánh tỷ lệ dương tính với các serovar của chủng Leptospira
Kết quả nghiên cứu này cĩ sự tương đồng với các nghiên cứu của các tác giả khác. Nghiên cứu của Boqvist vào năm 2002 cho thấy các serovar Leptospira nhiễm nhiều trên lợn là Autumnalis 32%, Bratislava 29%, Grippotyphosa 13%, icterohaemorrhagiae 27%, pomona 5%, Tarassovi 13% [ 3]. Nghiên cứu của Trương Quang trên lợn cho biết cĩ sự lưu hành của của 10 serovar trong đĩ cĩ Autumnalis, Pomona, Bataviae, Javanica, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Hebdomadis [47]. Nghiên cứu của Hồng Mạnh Lâm và cộng sự xác định cĩ 15 serovar Leptospira nhiễm trên lợn , trong đĩ cĩ Autumnalis, Pomona, Bataviae, Pyrogenes, Panama, Javanica, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Hebdomadis [7]. Từ các kết quả nghiên cứu trên và của chúng tơi cho thấy 9 serovar Leptospira: Autumnalis, Pomona, Bataviae, Pyrogenes, Bratislava, Panama, Javanicar, Hardjo,Tarassovi nhiễm phổ biến trên lợn.
Trong nghiên cứu trên, cĩ 5 chủng chưa xác định được serovar. Dựa vào các nghiên cứu khác cho thấy ngồi 15 serovar nằm trong bộ kháng thể chuẩn cịn cĩ các serovar phổ biến khác như Semarnanga, Djasiman, Selroe [7]. Do đĩ, 5 chủng cịn lại cĩ thể thuộc các serovar này hoặc thuộc các serovar mới chưa phát hiện tại nước ta.
3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG
LEPTOSPIRA
3.2.1. Kết quả phát hiện gen độc lực LipL32
Leptospira được xếp thành 2 nhĩm là cĩ độc lực (cĩ khả năng gây bệnh)
và khơng cĩ độc lực (khơng cĩ khả năng gây bệnh) hoặc độc lực trung bình. Các serovar Leptospira nhiễm trên động vật thường là các chủng cĩ độc lực gây bệnh. Tuy nhiên, theo Levett , Adler và Moctezuma, vẫn cĩ một số serovar Leptospira
khơng cĩ độc lực lưu hành trên gia súc. Vì vậy, gây khĩ khăn cho cơng tác chẩn đốn. Một số serovar thuộc lồi L. biflexa khơng cĩ độc lực thường tồn tại rất lâu trong mơi trường chăn nuơi và xâm nhập vào cơ thể gia súc, gây đáp ứng miễn dịch [3], [34]. Khi sử dụng phương pháp MAT để khảo sát kháng thể cũng như phân lập Leptospira từ những đàn gia súc này thường rất khĩ khăn và khơng đánh giá chính xác được sự lưu hành của Leptospira. Hơn nữa, ở thời kỳ đầu của quá trình gây bệnh, kháng thể kháng Leptospira chưa xuất hiện trong máu do đĩ khơng thể xác định rõ sự nhiễm Leptospira gây bệnh bằng phương pháp MAT. Vì vậy, việc áp dụng phương pháp PCR trong các trường hợp xác định serovar
Leptospira gây bệnh hoặc chẩn đốn sớm các ca bệnh là cần thiết.
Ở các chủng Leptospira cĩ khả năng gây bệnh trên gia súc và người, Lipoprotein màng ngồi là một trong những yếu tố độc lực chủ yếu và quan trọng nhất. Yếu tố độc lực này được quy định bởi gen LipL32. Gen này chỉ xuất hiện ở những chủng thuộc nhĩm độc lực cao. Vì vậy, việc phát hiện gen này cho phép kết luận khả năng gây bệnh của các chủng Leptospira phân lập được.
Phản ứng PCR đã được chuẩn hĩa phù hợp điều kiện phịng thí nghiệm tại Phân viện thú y miền Trung. Phản ứng được tối ưu, thỏa mãn các yêu cầu theo quy định, độ nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng cũng đã được xác định. Phản ứng này đặc hiệu với các serovar Leptospira thuộc nhĩm độc lực cao cĩ khả năng gây bệnh trên gia súc, khơng cĩ phản ứng chéo với các serovar thuộc nhĩm khơng cĩ độc lực (khơng cĩ khả năng gây bệnh) và các vi khuẩn khác thường gặp trên gia súc.
Việc xác định các chủng Leptospira cĩ thuộc nhĩm cĩ độc lực hay khơng là bước đầu giúp xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. Các chủng cùng thuộc nhĩm cĩ độc lực cĩ mối quan hệ gần trên hệ thống phân loại.
Kết quả PCR xác định gen LipL32 trên 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn cho thấy tất cả các chủng đều mang gen này. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.3. Điều này chứng tỏ tất cả các serovar Leptospira nhiễm trên lợn đều thuộc nhĩm cĩ độc lực gây bệnh.
Theo Hoke và cs., gen LipL32 mã hĩa cho lipoprotein cĩ trọng lượng phân tử là 32kDa. Đây là một trong những loại protein cĩ nhiều nhất trong
Leptospira, cĩ tính kháng nguyên mạnh, cĩ tính bảo tồn cao cả về mặt di truyền lẫn miễn dịch [34]. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất vắc-xin tiểu phần dựa trên thành phần kháng nguyên LipL32 là cĩ triển vọng.
Hình 3.3. Kết quả PCR xác định gen LipL32 của các chủng Leptospira Giếng 1: thang chuẩn DNA 100bp; Giếng 2: đối chứng dương; Giếng 3 : đối chứng âm; Giếng 4 đến 27: lần lượt là mẫu DNA từ 1 đến 24 của các chủng Leptospira. Giếng 28 : thang chuẩn DNA 100bp; Giếng 29: đối chứng dương; Giếng 30 đến 39 : lần lượt là mẫu DNA từ 25 đến 33 của các chủng Leptospira.
Bảng 3.2. Kết quả phản ứng PCR phát hiện gene độc lực LipL32. TT Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính Tỷ lệ ( % ) 1 33 33 100
3.2.2. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng Leptospira
phân lập từ lợn
Trình tự gen 16s rRNA của 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn được xác định và phân tích. Chiều dài các chuỗi trình tự phân tích 1085bp. So sánh các trình tự này với trình tự tham chiếu của các chủng Leptospira cĩ độc lực cao, độc lực trung bình, khơng độc lực đã cĩ trên ngân hàng gen để xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. Các trình tự được so sánh bằng phương pháp giĩng hàng
(alignment) để đánh giá độ tương đồng giữa chúng, sau khi tính được độ tương
đồng, xây dựng dendogram thể hiện sự phân nhĩm các chủng trên cây phân loại dựa trên cơ sở sự khác biệt trình tự gen.
Mối quan hệ di truyền giữa các chủng Leptospira phân lập từ lợn được trình bày ở hình 3.5 cho thấy 33 chủng phân lập từ lợn cĩ mối quan hệ di truyền gần nhất với các chủng cĩ độc lực cao, tiếp đến là các chủng cĩ độc lực trung tính, và cĩ mối quan hệ xa với các chủng khơng cĩ độc lực. Trình tự nucleotide gen 16s RNA của 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn hồn tồn tương đồng nhau, nằm cùng một nhánh trên cây phả hệ (hình 3.5). Trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA khơng cĩ sự sai khác giữa 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn tại khu vực Nam trung bộ - Tây Nguyên (phụ lục 2). Sự sai khác chỉ xảy ra giữa 33 chủng nghiên cứu với các chủng Leptospira nhĩm độc lực cao, nhưng tỉ lệ sai khác là rất thấp. So sánh với chuỗi trình tự gen 8 chủng tham chiếu cho thấy trên 1085bp chỉ cĩ sai khác 1-3 bp. So với L. genomosp chỉ sai khác 3 base tại các vị trí 547, 559, 570. So với L. alexanderi chỉ sai khác 2 base, với L. weilii và L. santarosai chỉ sai khác 1 base (hình 3.4). So với trình tự gen tham chiếu các lồi khác trong nhĩm độc lực, trình tự nucleotide của 33 chủng phân lập từ lợn hồn tồn tương đồng. Trên cây phả hệ, 33 chủng Leptospira phân lập từ lợn nằm gần nhất với các lồi thuộc nhĩm cĩ độc lực cao.
Đối với các chủng thuộc nhĩm độc lực trung bình, so sánh với 3 chủng tham chiếu cho thấy cĩ sự sai khác 1 base trình tự khi so sánh với L. broomii và
L. inadai serovar Lyme. Đối với các chủng thuộc nhĩm khơng độc lực, so sánh
với 5 chủng tham chiếu cho thấy cĩ sự sai khác 1 base với L. genomosp.4, 2 base với L. genomosp.5. Trên cây phả hệ, 33 chủng Leptospira nghiên cứu nằm xa với 2 nhĩm này (hình 3.5).
Hình 3.4. Vị trí các nucleotide khác biệt giữa các trình tự gen 16s RNA các chủng Leptospira
Hình 3.5. Phả hệ của các chủng Leptospira phân lập từ lợn
Phản ứng PCR xác định gen độc lực LipL32 cho thấy tất cả 33 chủng
Leptospira phân lập từ lợn đều cĩ độc lực, kết quả phân tích cây phân loại di
Chủng Leptospira phân lập Nhĩm Leptospira độc lực cao Nhĩm Lep. độc lực TB Nhĩm Lep. khơng cĩ độc lực
truyền tương thích với kết quả PCR trên, tức 33 chủng Leptospira cĩ mối quan hệ gần với nhĩm Leptospira độc lực cao. Cây phân loại thu được từ nghiên cứu của chúng tơi tái khẳng định tính bảo tồn gen rất cao của các lồi Leptospira. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra các serovar trong cùng một lồi Leptospira
cĩ mối tương đồng gen rất cao, trung bình chỉ sai khác 0,2 base trong 1430 trình tự base khi phân tích trên gen 16s RNA [44 ]. Trong một nhánh, tỉ lệ tương đồng trình tự gen giữa các lồi cũng rất cao, đặc biệt trong nhánh cĩ độc lực, tỉ lệ tương đồng gen giữa 8 lồi trong nhánh cĩ độc lực là ≥98.6% , tức chỉ cĩ 2-20bp khác nhau khi so sánh đoạn trình tự 1431bp. Hai lồi cĩ mối tương đồng gen lớn nhất là L. interrogans và L. kirschneri , chỉ khác biệt 2 bp khi so sánh trình tự 16s RNA dài 1432 bp. Các lồi L. genomosp1, L. noguchi cũng cĩ mối tương đồng gen cao với L. interrogans. Cây phân loại quan hệ di truyền trong nghiên cứu của chúng tơi tương thích với kết quả nghiên cứu của Paul N. Levett và cs [44].
Nghiên cứu của một số tác giả khác cũng cho thấy cây phát sinh lồi của
Leptospiraceae dựa trên phân tích trình tự gen 16s rRNA : Leptospiraceae gồm
cĩ 5 nhánh , trong đĩ cĩ 3 nhánh chính: nhánh các lồi gây bệnh cĩ độc lực cao gồm 8 lồi, điển hình là L. interrogans; nhánh các lồi khơng gây bệnh, điển hình
là L. biflexa ; nhánh trung gian cĩ độc lực trung bình, bao
gồm L. inadai , L. fainei , và L. broomii . Hai nhĩm cịn lại độc lập với 3 nhĩm trên và ít phổ biến hơn, là nhánh các lồi T. parva và nhánh các lồi
Leptonemaillini [44].Trong đĩ, nhánh các lồi gây bệnh là phổ biến hơn cả với
nhiều serovar thường xuyên gặp trên các đối tượng gia súc gia cầm. Hơn nữa, Các lồi Leptospira cĩ tính bảo tồn cao, đặc biệt là các lồi trong cùng 1 nhánh. Trong một nhánh, tỉ lệ tương đồng trình tự gen giữa các lồi cũng rất cao, đặc biệt trong nhánh cĩ độc lực, tỉ lệ tương đồng gen giữa 8 lồi trong nhánh cĩ độc lực là ≥98.6% , tức chỉ cĩ 2-20bp khác nhau khi so sánh đoạn trình tự 1431bp. Hai lồi cĩ mối tương đồng gen lớn nhất là L. interrogans và L. kirschneri , chỉ khác biệt 2 bp khi so sánh trình tự 16s RNA dài 1432 bp. Các lồi L. genomosp1,