BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY THỦY SINH TIÊU THẢO LÁ NHĂN (CRYPTOCORYNE WENDTII) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Giảng viên hướng dẫn TS ĐỖ ĐĂNG GIÁP Sinh viên thực hiện TRƯƠNG PHƯỚC THUẬN MSSV 1611100162 Lớp 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 4 MỤC LỤC 5 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ iv LỜI MỞ ĐẦ.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii
Cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii do viện Sinh học nhiệt đới
TP Hồ Chí Minh cung cấp có chiều dài từ 1 – 1,5 cm
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Box cấy vô trùng SANYO
Hệ thống dàn đèn nuôi cấy
Hệ thống làm lạnh Daikin
Cân phân tích Toredo, độ chính xác d = 0,0001 g
Dụng cụ: Kẹp cấy, kéo, dao cắt, đèn cồn, bình thủy tinh 50 ml…
Hóa chất: Cồn 96 o , cồn 70 o , nước cất vô trùng, dung dịch javel, agar, xà phòng…
Môi trường MS, theo công thức của Murashiage và Skoog (1962), là lựa chọn lý tưởng cho hầu hết các cây nuôi cấy in vitro Môi trường này bao gồm các muối đa lượng, vi lượng, vitamin, đường saccharose, agar và các chất kích thích sinh trưởng như IAA và BAP Đặc biệt, nồng độ pH của môi trường được điều chỉnh về 5.8 và sau đó được hấp khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở nhiệt độ 121 o C trong 15 phút.
Nhiệt độ phòng nuôi cấy trong khoảng 25 – 27 o C và chế độ chiếu sáng 12h/ngày, cường độ ánh sáng là 2200 lux Độ ẩm 55%.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng 116 của Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện sinh học nhiệt đới, địa chỉ số 9/621 Xa lộ Hà Nội, khu phố 6, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh.
Bố trí thí nghiệm
2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện khử trùng của cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii tạo nguồn mẫu in vitro
Xác định điều kiện khử trùng của mẫu cấy Cryptocoryne wendtii được khử trùng bằng dung dịch Javel 25%, Javel 50%, HgCl2 0,1 %
❖ Khử trùng bằng dung dịch Javel 25%, Javel 50%
1 Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng
2 Rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng
3 Rửa trong cồn 70 o C (trong 1 phút)
4 Rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng
5 Khử trùng trong dung dịch Javel 25%, Javel 50% lắc trong 5,10,15 phút
6 Rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng
7 Thấm khô bằng giấy thấm đã vô trùng
❖ Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 %
1 Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng
2 Rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng
3 Rửa trong cồn 70 o C (trong 1 phút)
4 Rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng
5 Khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1 % lắc trong 5,10,15 phút
6 Rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng
7 Thấm khô bằng giấy thấm đã vô trùng
Thu mẫu: mẫu đã được khử trùng cấy vào môi trường MS để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau
Bảng 2.1 Khảo sát điều kiện khử trùng của mẫu tạo nguồn mẫu in vitro
Nghiệm thức Chất khử trùng Thời gian (phút)
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 9 nghiệm thức, 3 lần lặp lại
Quy mô: 5 mẫu/ bình x 10 bình/ nghiệm thức x 9 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành thu thập số liệu với các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu không nhiễm (%), tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)
2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin lên sự phát sinh chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Xác định loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật là yếu tố quan trọng để tối ưu hóa sự phát sinh chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii trong môi trường in vitro Việc nghiên cứu này giúp nâng cao hiệu quả nhân giống và phát triển cây thủy sinh, góp phần bảo tồn và phát triển đa dạng sinh học.
Các mẫu cây in vitro được cắt ngọn và rễ với chiều cao 1 – 1,5 cm được cấy vào bình thủy tinh 500 ml Môi trường MS được bổ sung BA và Kinetin ở các nồng độ từ 0,5 – 2,0 mg/l nhằm khảo sát quá trình nhân nhanh chồi in vitro Thí nghiệm được thiết kế theo bảng 3.2.
Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của mẫu cấy
Nghiệm thức Chất bổ sung Nồng độ (mg/l)
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 9 nghiệm thức, 3 lần lặp lại
Quy mô: 5 mẫu/ bình x 5 bình/ nghiệm thức x 9 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành thu thập dữ liệu với các chỉ tiêu quan trọng như số lượng chồi trên mỗi mẫu, số lá trên mỗi chồi và chiều cao của mẫu tính bằng centimet.
2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Xác định được môi trường khoáng nào ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii
Chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro có cùng kích thước (1 – 1,5 cm) được cấy lên môi trường khoáng bố trí như bảng 3.4
Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng chồi của mẫu cấy
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại
Quy mô: 5 mẫu/ bình x 10 bình/ nghiệm thức x 4 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu thập dữ liệu với các chỉ tiêu quan trọng như số lượng chồi, chiều cao chồi trung bình (cm) và số lá trên mỗi chồi (lá).
2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ từ chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Nghiên cứu xác định loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến sự hình thành rễ từ chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii trong môi trường in vitro Kết quả cho thấy sự lựa chọn phù hợp về chất điều hòa có thể tối ưu hóa quá trình phát triển rễ, góp phần nâng cao hiệu suất nhân giống cây trong điều kiện nuôi cấy.
Chồi cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii được nuôi cấy in vitro với chiều cao và kích thước đồng nhất trong môi trường khoáng thích hợp, bổ sung NAA hoặc IBA theo nồng độ đã được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ của mẫu cấy cây
Nghiệm thức Chất bổ sung Nồng độ (mg/l)
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 9 nghiệm thức, 3 lần lặp lại
Quy mô: 5 mẫu/ bình x 5 bình/ nghiệm thức x 9 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Sau quá trình nuôi cấy, cần thu thập các số liệu quan trọng để đánh giá hiệu quả, bao gồm số lượng chồi, số lá trên mỗi chồi, số rễ trên mỗi mẫu, và chiều cao cây tính bằng centimet.
2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii in vitro
Xác định được cường độ ánh sáng thích hợp cho sự tăng trưởng cây
Mẫu cấy cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii in vitro được trồng trong môi trường có thành phần khoáng phù hợp, dựa trên kết quả từ nội dung 3.3.3 Sự sinh trưởng của các mẫu cấy này đã được khảo sát dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau, theo bảng 3.5.
Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của cường độ sáng lên sự tăng chồi của mẫu cấy
Nghiệm thức Cường độ chiếu sáng (lux)
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại
Quy mô: 5 mẫu/bình x 5 bình/nghiệm thức x 3 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Chỉ tiêu: Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu nhận các số liệu với các chỉ tiêu như: chiều cao cây (cm), số lá/ chồi (lá), số chồi
Hình 2.1 Hệ thống đèn led bố trí để thực hiện nghiên cứu thí nghiệm
Các chỉ tiêu theo dõi
1 Tỷ lệ nhiễm (%) = Σ Số mẫu nhiễm Σ Số mẫu theo dõi× 100
2 Tỷ lệ mẫu sống (%) = Σ Số mẫu sống Σ Số mẫu theo dõi × 100
3 Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Σ Số mẫu tạo chồi Σ Số mẫu cấy ban đầu × 100
4 Hệ số nhân (lần) = Σ Số mẫu thu được Σ Số mẫu cấy ban đầu
5 Chiều cao TB chồi (cm) =Σ Chiều cao các chồi Σ Chồi theo dõi
6 Số chồi (chồi/mẫu) = Σ Số chồi thu được Σ Số mẫu ban đầu
7 Số lá (lá/chồi) = Σ Số lá Σ Số chồi
8 Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = Σ Số mẫu tạo rễ Σ Số mẫu theo dõi × 100
9 Số rễ (rễ/chồi) = Σ Số rễ Σ Số chồi
KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
Kết quả khảo sát điều kiện khử trùng của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn
Cryptocoryne wendtii tạo nguồn mẫu in vitro
Giai đoạn khử trùng mẫu là bước khởi đầu quan trọng trong việc tạo nguồn mẫu in vitro cho nuôi cấy, đặc biệt đối với cây thủy sinh sống dưới nước hoặc khu vực đầm lầy Việc khử trùng mẫu vật gặp nhiều khó khăn và thành công không chỉ phụ thuộc vào kỹ thuật mà còn vào chất khử trùng và thời gian khử trùng Kết quả khảo sát cho thấy hiệu quả của các chế độ khử trùng đối với mẫu thân rễ cây tiêu thảo lá nhăn khi sử dụng chất khử trùng HgCl2 0,1% hoặc Javel ở các nồng độ và thời gian khác nhau, được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của loại và thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng sau 2 tuần theo dõi
Thời gian khử trùng (phút)
Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%)
Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy rằng loại chất khử trùng và thời gian khử trùng ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả khử trùng Chất khử trùng HgCl2 0,1% tỏ ra hiệu quả hơn Javel trong tất cả các nghiệm thức khảo sát, trong khi các nghiệm thức sử dụng Javel có tỷ lệ nhiễm trên 40% Mặc dù việc tăng nồng độ hoặc thời gian khử trùng bằng Javel có thể giảm tỷ lệ nhiễm, nhưng lại gây chết mẫu, đặc biệt là ở nghiệm thức Javel 50% trong 15 phút với 92% mẫu chết Ngược lại, các nghiệm thức sử dụng HgCl2 0,1% cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm giảm theo thời gian khử trùng, với tỷ lệ nhiễm lần lượt là 3,3% và 2,7% cho thời gian 10 và 15 phút Hai nghiệm thức này cũng đạt tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất, 94,7% và 92,7% Do đó, HgCl2 0,1% là chất khử trùng phù hợp để khử trùng mẫu cấy thân rễ cây tiêu thảo lá nhăn trong thời gian 10 phút.
Ảnh hưởng của cytokinin lên sự phát sinh chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích phân chia tế bào và ảnh hưởng đến sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi Sự cân bằng giữa auxin và cytokinin là yếu tố quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro Ngoài ra, cytokinin còn tác động đến quá trình ngủ đông của chồi, kích thích nảy mầm, hình thành mô mạch và mở rộng lá mầm ở nhiều loại thực vật.
Vật liệu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm là các cây con tiêu thảo lá nhăn
Cryptocoryne wendti in vitro có độ dài khoảng 1 – 1,5 cm và cấy vào môi trường MS có bổ sung BA và Kinetin như bảng 4.2, biểu đồ 4.1, 4.2, 4.3
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA và kinetin lên sự phát sinh chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Lưu ý rằng các giá trị trong bảng là trung bình, và các số liệu trong cùng một cột có các chữ cái theo sau cho thấy sự khác biệt ý nghĩa thống kê: “**” biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,01, trong khi “*” cho thấy sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,05.
Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy cytokinin, đặc biệt là sự kết hợp giữa BA và Kinetin, có tác động rõ rệt đến quá trình phân hóa chồi Nghiệm thức bổ sung BA cho thấy số lượng chồi mới hình thành cao hơn so với nghiệm thức đối chứng Việc tăng nồng độ BA cũng có ảnh hưởng tích cực đến số lượng chồi mới, với nghiệm thức bổ sung BA ở nồng độ 2,0 mg/l cho kết quả cao nhất, đạt 3,8 chồi/mẫu.
Các nghiệm thức bổ sung Kinetin với nồng độ từ 0,5 đến 2,0 mg/l đều tạo ra chồi mới, nhưng việc tăng nồng độ Kinetin không làm tăng số lượng chồi mới hình thành Số lượng chồi thay đổi không đáng kể so với nghiệm thức đối chứng.
Số chồi hình thành cao nhất ở nồng độ Kinetin 1,5 mg/l với 1,3 chồi
Số chồi mới hình thành
Số lá mới hình thành
Từ kết quả trên cho thấy BA tác động tích cực đến sự hình thành chồi trên cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii
Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự phát sinh chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên số lá mới của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Số chồi mới hình thành
Số lá mới hình thành
Biểu đồ 4.2 cho thấy cytokinin kích thích sự hình thành lá, với môi trường MS bổ sung BA nồng độ từ 0,5 – 2,0 mg/l tạo ra số lượng lá mới cao gấp 1,6 lần so với môi trường đối chứng (7,1 lá/mẫu) Mặc dù nồng độ BA tăng từ 0,5 – 2,0 mg/l, sự ức chế hình thành lá mới không thay đổi nhiều; ở nghiệm thức BA 2,0 mg/l, số lá mới hình thành đạt 6,9 lá.
Môi trường MS với nồng độ Kinetin từ 0,5 – 1,5 mg/l có tác động tích cực đến số lượng lá mới hình thành ở cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii Cụ thể, nghiệm thức Kinetin 1,5 mg/l cho kết quả cao nhất với 5,9 lá mới/mẫu, trong khi nồng độ Kinetin 2,0 mg/l lại không làm tăng số lượng lá mới, chỉ đạt 5,5 lá/mẫu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cả BA và Kinetin đều có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành số lượng lá mới ở cây tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii, trong đó BA cho số lượng lá mới cao hơn Kinetin.
Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên chiều cao của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Nồng độ cytokinin, đặc biệt là BA, có tác động đáng kể đến sự sinh trưởng của cây Dữ liệu từ bảng 4.2 và biểu đồ 4.3 cho thấy việc bổ sung BA với nồng độ từ 0,5 đến 2,0 mg/l ảnh hưởng tích cực đến chiều cao cây trồng trong các nghiệm thức khảo sát.
MS bổ sung BA giúp cây phát triển đồng đều, nhưng nghiệm thức đối chứng cho thấy cây đạt chiều cao cao nhất là 14,0 cm trong số 4 nghiệm thức BA được khảo sát Cụ thể, nồng độ BA thấp nhất 0,5 mg/l đạt chiều cao 11,5 cm, trong khi nồng độ BA cao nhất 2,0 mg/l đạt chiều cao 12,4 cm Dựa vào số liệu ghi nhận, môi trường MS bổ sung cho thấy hiệu quả trong việc hỗ trợ sự phát triển của cây.
BA gây ức chế đến sự phát triển chiều cao của cây
Môi trường MS với nồng độ Kinetin từ 0,5 – 2,0 mg/l đã cho thấy sự phát triển chiều cao rõ rệt Cụ thể, nồng độ 1,0 mg/l Kinetin mang lại chiều cao phát triển tối ưu nhất là 18,5 cm, trong khi nồng độ cao hơn có xu hướng ức chế sự phát triển chiều cao Ở nồng độ cao nhất 2,0 mg/l, chiều cao chỉ đạt 15,3 cm.
Hình 3.1 Hình thái chồi của cây tiêu thảo lá nhăn trong môi trường bố sung BA và
Dựa vào số liệu từ bảng 4.2 và biểu đồ 4.1, 4.2, 4.3, việc bổ sung BA vào môi trường MS cho thấy nồng độ tối ưu để tạo chồi là 2,0 mg/l Tuy nhiên, khi nồng độ BA tăng cao, cây sẽ gặp phải vấn đề về chiều cao Ngoài ra, Kinetin cũng là một loại cytokinin có khả năng phát sinh chồi, nhưng hiệu quả không bằng BA.
Kinetin cho thấy sự phát triển vượt trội về số lượng lá mới và chiều cao cây so với BA Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Sundus Unal và cộng sự (2018), khi họ thực hiện nghiên cứu nhân giống in vitro cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii bằng cách sử dụng môi trường MS có bổ sung 4mg/l BA.
Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Thành phần khoáng trong môi trường đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của thực vật, đặc biệt trong nuôi cấy in vitro, nơi các loại khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng của mô và tế bào thực vật Các chất khoáng được chia thành khoáng đa lượng và khoáng vi lượng, với nhu cầu dinh dưỡng khác nhau tùy thuộc vào từng loại thực vật Để khảo sát môi trường khoáng thích hợp cho sự tăng trưởng của cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii in vitro, nghiên cứu đã lựa chọn các môi trường như MS, MS ½ và B5 Môi trường MS (Murashige and Skoog) rất giàu dinh dưỡng và phổ biến trong nuôi cấy thực vật, trong khi MS ½ giảm một nửa thành phần khoáng đa lượng và MS ½ chứa một nửa cả khoáng đa lượng và vi lượng so với MS B5 (Gamborg B5) được sử dụng cho việc tạo mô sẹo và biệt hóa các bộ phận thực vật, với vật liệu nuôi cấy là chồi cây tiêu thảo lá nhăn.
Cryptocoryne wendtii in vitro có kích thước 1 – 1,5 cm được cấy vào nghiệm thức với các loại môi trường khác nhau đã được bố trí trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Lưu ý: Các giá trị trong bảng thể hiện giá trị trung bình, và các số liệu trong cùng một cột có ký hiệu khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê: “**” biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,01, trong khi “*” chỉ ra sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,05.
Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Dựa vào số liệu từ bảng 4.3 và biểu đồ 4.4, có thể thấy rằng tất cả các môi trường khoáng đều sản sinh ra số chồi mới Tuy nhiên, về xác suất thống kê, môi trường MS, MS và B5 cho thấy những kết quả đáng chú ý.
Số chồi mới hình thành Số lá mới hình thành Chiều cao(cm)
Nghiệm thức Số chồi mới hình thành
Số lá mới hình thành Chiều cao(cm)
Trong thí nghiệm, môi trường MS ẵ cho số chồi cao nhất với 1,5 chồi, nhưng hàm lượng khoáng bị giảm dẫn đến số lá mới hình thành chỉ đạt 5,4 lá và 5,6 lá, thấp hơn so với môi trường MS (5,8 lá) Ngược lại, môi trường B5 với loại và hàm lượng chất khoáng khác biệt đã tạo điều kiện cho số lá mới phát triển tốt hơn, đạt 5,9 lá.
Hình 3.2 Hình thái mẫu cây tiêu thảo lá nhăn in vitro trong các môi trường khoáng
Hình 4.2 và biểu đồ 4.4 cho thấy cây phát triển tốt trong môi trường MS với rễ dài và khỏe, trong khi các môi trường MS ẵ, ẵ MS và B5 có hình thái tương tự nhưng rễ ngắn và thưa Sự thay đổi loại môi trường khoáng và hàm lượng ảnh hưởng đến chồi mới và số lá mới, từ đó tác động đến chiều cao cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii Môi trường B5 có chiều cao 15,8 cm, phát triển tốt hơn so với MS ẵ và ẵ MS (9,3 cm và 11,0 cm), nhưng không đạt hiệu quả như môi trường MS Môi trường MS cho chiều cao cây 17,8 cm, là cao nhất trong các nghiệm thức được khảo sát.
Môi trường MS ẵ có tác động tích cực đến việc hình thành chồi mới của cây tiểu thảo lỏ nhăn Cryptocoryne wendtii Tuy nhiên, số lượng chồi mới ở môi trường MS ẵ không chỉ phụ thuộc vào yếu tố hình thành chồi mà còn liên quan đến các yếu tố hình thái và chiều cao của cây.
Chiều cao của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii trong môi trường MS là 17,8 cm, cao hơn so với chiều cao của cây trong môi trường MS ẵ là 9,3 cm Điều này cho thấy môi trường MS có ảnh hưởng tích cực đến việc hình thành chồi mới của cây.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự thừa hoặc thiếu khoáng chất cản trở hoạt động sinh lý của cây, dẫn đến sự tăng trưởng chậm Môi trường khoáng MS là lựa chọn phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật, do đó, các thành phần và hàm lượng khoáng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii Nghiên cứu của Sundus Unal và cộng sự đã thành công trong việc nhân giống in vitro cây thủy sinh này trên môi trường Murashige và Skoog (MS).
Vậy công thức môi trường khoáng thích hợp để nhân nhanh chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro là môi trường MS + 8 g/l agar + 30 g/l sucrose.
Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ từ chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Auxin là hoóc môn thực vật quan trọng, ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng của tế bào, hình thành rễ, và hiện tượng ưu thế ngọn Hoóc môn này kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, nhưng nồng độ cao có thể gây hại cho sự phát triển của cây Tính hướng là đặc tính tự nhiên của thực vật, cho phép cây sinh trưởng hướng về các tác nhân kích thích bên ngoài như ánh sáng (hướng quang), đất (hướng địa), nước (hướng thủy) và phân bón (hướng hóa) Sự hình thành rễ khỏe mạnh là yếu tố then chốt giúp cây hấp thụ nước và khoáng trước khi được trồng ra môi trường tự nhiên.
Vật liệu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm bao gồm các mẫu chồi cây tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro, có kích thước từ 1 đến 1,5 cm, được cấy vào môi trường thích hợp để phát triển.
MS bổ sung NAA và IBA ở các nồng độ được bố trí như bảng 4.6 và biểu đồ 4.6
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ từ chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Lưu ý rằng các giá trị trong bảng là trung bình, và các số liệu trong cùng một cột có ký hiệu chữ cái theo sau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê: “**” chỉ sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,01, trong khi “*” chỉ sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,05.
Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt trong tác động của NAA và IBA lên sự hình thành rễ Cụ thể, nồng độ NAA 0,5 mg/l dẫn đến sự hình thành rễ tích cực với 6,0 rễ, cao hơn so với môi trường đối chứng (3,0 rễ) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ NAA lên 1,0 – 2,0 mg/l, sự hình thành rễ mới giảm xuống (NAA 1,5 mg/l chỉ còn 0,7 rễ) và có xu hướng tạo sẹo tại nồng độ 2,0 mg/l Ngược lại, IBA ở nồng độ 0,5 – 2 mg/l cho thấy khả năng hình thành rễ tốt hơn NAA, mặc dù khi tăng nồng độ IBA, số lượng rễ hình thành lại giảm, với IBA 1,0 mg/l và 1,5 mg/l lần lượt chỉ đạt 5,4 rễ và 5,0 rễ.
Số rễ mới hình thành
Số chồi mới hình thành
Số lá mới hình thành Chiều cao(cm)
IBA0,5 5,9 ab 1,4 cd 4,9 ab 17,5 ab
Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Từ kết quả trên cho thấy, NAA tác động lên sự hình thành rễ với nồng độ thấp cho hình thành số lượng rễ mới cao nhất
Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Số rễ mới hình thành
Số chồi mới hình thành
Auxin không chỉ kích thích sự phát triển của bộ rễ mà còn thúc đẩy hình thành chồi mới Theo biểu đồ 4.6 và bảng 4.4, việc bổ sung NAA với nồng độ 0,5 mg/l đã tạo ra 2,8 chồi mới, cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (1,7 chồi) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ NAA lên 2,0 mg/l, số chồi giảm xuống còn 1,4 chồi Ngoài ra, việc bổ sung IBA cũng kích thích sự hình thành chồi, nhưng số lượng chồi lại bị ảnh hưởng Cụ thể, nồng độ IBA 0,5 mg/l chỉ tạo ra 1,4 chồi, thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng Tăng nồng độ IBA lên 1,5 mg/l và 2,0 mg/l chỉ tạo ra 1,3 chồi mới, cho thấy tác động của IBA đến sự hình thành chồi mới không đáng kể.
Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành lá của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Biểu đồ 4.7 cho thấy auxin ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành lá mới của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro Việc bổ sung NAA với nồng độ từ 0,5 – 2,0 mg/l đã gây ức chế sự phát triển của lá, trong đó nghiệm thức NAA 0,5 mg/l chỉ tạo ra 4,7 lá, thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng với 5,1 lá Sự gia tăng nồng độ NAA dẫn đến việc giảm số lượng lá mới, với nồng độ 2,0 mg/l chỉ cho ra 4,1 lá.
Số lá mới hình thành
Việc bổ sung IBA vào môi trường không ảnh hưởng đến sự hình thành lá mới Cụ thể, trong nghiệm thức đối chứng, số lá mới hình thành là 5,1 lá, trong khi môi trường MS bổ sung IBA với nồng độ 0,5 mg/l cho kết quả là 4,9 lá Tăng nồng độ IBA lên 1,0 mg/l, 1,5 mg/l và 2,0 mg/l lần lượt cho số lá mới hình thành là 4,9, 5,0 và 4,7 lá, cho thấy rằng nồng độ IBA không tác động đáng kể đến sự hình thành lá mới.
Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành chiều cao của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Hình 3.3 Hình thái của cây tiêu thảo lá nhăn trong môi trường bổ sung IBA và
Auxin không chỉ ảnh hưởng đến số lượng rễ, chồi và lá mà còn tác động đến sự sinh trưởng và phát triển chiều cao của cây Theo biểu đồ 4.8 và hình 4.3, việc bổ sung NAA vào môi trường MS đã thể hiện rõ sự tác động lên chiều cao cây Ở nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức bổ sung NAA 0,5 mg/l, chiều cao cây lần lượt là 11,5 cm và 11,0 cm, cho thấy không có sự phát triển chiều cao rõ rệt Tuy nhiên, khi tăng nồng độ NAA lên 1,0 – 2,0 mg/l, chiều cao cây có xu hướng phát triển mạnh, đạt 16,5 cm ở nồng độ 1,5 mg/l và cao nhất là 16,7 cm ở nồng độ 2,0 mg/l.
IBA là một auxin tổng hợp có tác dụng kích thích ra rễ và phát triển chiều cao của cây Việc bổ sung IBA vào môi trường MS với nồng độ từ 0,5 đến 2,0 mg/l cho thấy sự tăng trưởng chiều cao cây diễn ra mạnh mẽ, đặc biệt ở nồng độ 1 mg/l và 1,5 mg/l, đạt chiều cao tối đa Mặc dù nồng độ 2,0 mg/l chỉ đạt chiều cao 18,1 cm, nhưng vẫn cao hơn so với nghiệm thức đối chứng là 11,5 cm.
Trong giai đoạn cây cần ra rễ, việc bổ sung auxin là cần thiết để kích thích sự hình thành rễ trước khi đưa cây ra môi trường tự nhiên Trong số các loại auxin, IBA với nồng độ 0,5 mg/l cho kết quả hình thành rễ tốt nhất, đạt 6,0 rễ, so với NAA chỉ đạt 5,9 rễ Mặc dù IBA 0,5 mg/l chỉ tạo ra 1,4 chồi, thấp hơn NAA 0,5 mg/l với 2,8 chồi, nhưng số lá mới của IBA (4,9 lá) lại cao hơn so với NAA (4,7 lá) Kết quả cho thấy môi trường bổ sung IBA hỗ trợ sự sinh trưởng chiều cao cây tốt hơn, đặc biệt với chiều cao đạt 17,5 cm ở nồng độ 0,5 mg/l.
Vậy auxin và nồng độ thích hợp nhất để tạo rễ cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn
Nghiên cứu về Cryptocoryne wendtii in vitro cho thấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA không đạt kết quả như mong đợi Điều này không phù hợp với nghiên cứu của Sundus Unal và cộng sự (2018), trong đó họ sử dụng môi trường MS bổ sung 4 mg/l BA và 1 mg/l IBA để nhân giống cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii.
Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Ánh sáng đóng vai trò quan trọng không chỉ là nguồn năng lượng mà còn là yếu tố quyết định sự phát triển và tồn tại của thực vật Cường độ, chất lượng và bước sóng của ánh sáng đều ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình trao đổi chất, hình thái, sinh lý và các thông số sinh hóa của cây.
Trong nhân giống in vitro, ánh sáng đóng vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Cường độ ánh sáng không chỉ điều chỉnh kích thước lá và thân mà còn tác động đến sự hình thành sắc tố và hiện tượng mọng nước của cây con Bên cạnh đó, quang kỳ và bước sóng của ánh sáng cũng góp phần quan trọng trong quá trình phát triển này.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Lưu ý rằng các giá trị trong bảng là trung bình, và những số liệu trong cùng một cột có ký hiệu khác nhau cho thấy sự khác biệt ý nghĩa thống kê: “**” chỉ sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,01, trong khi “*” thể hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,05.
Nghiệm thức Số chồi mới hình thành
Số lá mới hình thành Chiều cao(cm)
Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Trong đó : L1: cường độ ánh sáng 2000 lux
L2: cường độ ánh sáng 2500 lux L3: cường độ ánh sáng 3000 lux
Hình 3.4 Hình thái cây tiêu thảo lá nhăn in vitro trong khảo sát ảnh hưởng cường độ ánh sáng lên chồi
Cây đơn tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii có kích thước từ 1 – 1,5 cm, được nuôi cấy trong môi trường MS và sau đó được chiếu sáng dưới đèn với cường độ ánh sáng phù hợp.
Số chồi mới hình thành Số lá mới hình thành Chiều cao(cm)
Nghiên cứu về ảnh hưởng của 44 cường độ ánh sáng khác nhau lên sự sinh trưởng và hình thành chồi mới của cây tiêu tảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro sau 8 tuần cho thấy cường độ ánh sáng 2000 lux mang lại số lượng chồi mới cao nhất Mặc dù cường độ ánh sáng cao hơn có thể làm giảm số chồi mới hình thành (L2, L3 lần lượt đạt 1,2 và 1,1 chồi), nhưng chiều cao cây cũng bị ảnh hưởng Cây ở cường độ 2000 lux phát triển xanh tốt, đạt chiều cao 15,2 cm, trong khi mẫu ở L2 có chiều cao gần bằng 14,0 cm Đặc biệt, với cường độ ánh sáng 3000 lux, cây có sự phát triển vượt trội với chiều cao đạt 16,3 cm.
Hiện tại, có rất ít nghiên cứu về tác động của cường độ ánh sáng đối với cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro Tuy nhiên, theo Ammirato, việc hiểu rõ ảnh hưởng của ánh sáng có thể giúp tối ưu hóa quá trình phát triển của loài cây này.
Cường độ ánh sáng từ 1000 – 2500 lux là mức phổ biến được sử dụng trong nuôi cấy nhiều loại mô, với cường độ cao hơn có thể làm chậm quá trình sinh trưởng của chồi Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong sự phát sinh và phát triển của soma, trong khi ánh sáng mạnh thúc đẩy sự hình thành mô sẹo Cường độ ánh sáng trung bình kích thích sự tạo chồi, còn cường độ thấp giúp tăng chiều cao và làm lá xanh đậm hơn Kết quả cho thấy cây thủy sinh có thể phát triển tốt dưới các điều kiện ánh sáng khác nhau.
Cryptocoryne wendtii phát triển chồi tốt nhất ở cường độ ánh sáng 2000 lux, mang lại kết quả khả quan về sự tăng trưởng Bên cạnh đó, chiều cao của mẫu cũng có sự phát triển ổn định.
